专利名称：可溶性共同刺激分子增强免疫应答的用途的制作方法相关申请本申请要求1999年5月6日提交的美国临时申请第60/132,944号的优先权，其内容全文引用在此作为参考文献。T细胞为了响应外来蛋白质，抗原呈递细胞(APC)必须向静息T淋巴细胞提供两种信号(Jenkins，M.和Schwartz，R.(1987)《实验医学杂志》165，302-319；Mueller，D.L.等(1990)《免疫学杂志》144，3701-3709)。第一种信号赋予免疫应答以特异性，它是在呈递在主要组织相容性复合物(MHC)中的外来抗原肽的识别之后经由T细胞受体(TCR)转导的。第二种信号称为共同刺激，诱导T细胞增殖而成为功能性的(Lenschow等1996《免疫学年评》14233)。共同刺激既不是抗原特异性的，也不是MHC限制性的，据认为它是由一种或多种被APC表达的不同细胞表面分子所提供的(Jenkins，M.K.等1988《免疫学杂志》140，3324-3330；Linsley，P.S.等1991《实验医学杂志》173，721-730；Gimmi，C.D.等1991《美国国家科学院院报》88，6575-6579；Young，J.W.等1992《临床研究杂志》90，229-237；Koulova，L.等1991《实验医学杂志》173，759-762；Reiser，H.等1992《美国国家科学院院报》89，271-275；van-Seventer，G.A.等(1990)《免疫学杂志》144，4579-4586；LaSalle，J.M.等1991《免疫学杂志》147，774-80；Dustin，M.I.等1989《实验医学杂志》169，503；Armitage，R.J.等1992《自然》357，80-82；Liu，Y.等1992《实验医学杂志》175，437-445)。如果T细胞是仅通过T细胞受体而被刺激的，没有接收另外的共同刺激信号，那么它们会成为无应答性的、无反应性的，或者死亡，导免疫应答的下调。在APC上表达的CD80(B7-1)与CD86(B7-2)蛋白是决定性的共同刺激分子(Freeman等1991《实验医学杂志》174625；Freeman等1989《免疫学杂志》1432714；Azuma等1993《自然》36676；Freeman等1993《科学》262909)。B7-2似乎在初次免疫应答期间扮演主要角色，而B7-1在免疫应答过程后期受到上调，它可能对延长初次T细胞应答或共同刺激再次T细胞应答来说是重要的(Bluestone，1995《免疫》2555)。一种与B7-1和B7-2结合的配体是CD28，它在静息T细胞上组成型表达，在活化之后表达增加。通过T细胞受体发信号之后，CD28的连接反应和共同刺激信号的转导诱导T细胞增殖和分泌IL-2(Linsley，P.S.等1991《实验医学杂志》173，721-730；Gimmi，C.D.等1991《美国国家科学院院报》88，6575-6579；June，C.H.等1990《今日免疫学》11，211-6；Harding，F.A.等1992《自然》356，607-609)。第二种配体称为CTLA4(CD152)，它与CD28是同源的，但不在静息T细胞上表达，而出现在T细胞活化之后(Brunet，J.F.等1987《自然》328，267-270)。与CD28相反，CTLA4似乎对T细胞应答的负调节来说是决定性的(Waterhouse等1995《科学》270985)。CTLA4的阻断已经发现可除去抑制信号，而CTLA4的聚集已经发现可提供下调T细胞应答的抑制信号(Allison和Krummel，1995《科学》270932)。对开发增强免疫应答的方法一直存在迫切需要。例如，迄今为止利用本领域公认的方法还难以增加对某些病毒和肿瘤细胞的免疫应答。用于普遍增强免疫应答、特别是增强对肿瘤抗原和感染因子(例如病毒、细菌和/或寄生物抗原)的应答将大有裨益。发明概述本发明提供通过操纵共同刺激途径增强免疫应答的方法。这些方法对增加对肿瘤抗原和来自感染因子的抗原的应答来说是特别有效的。本发明至少在部分程度上基于这样的发现，共同刺激分子的可溶形式能够预防性和治疗性增强免疫应答。尽管本发明的可溶性共同刺激分子不是在固相上给药的(例如不是在细胞上给药的)，而且是在没有交联剂的存在下给药的，也见到了这种增强作用。这些发现是特别惊人的，因为根据现有教导，B7-1和B7-2分子的可溶形式不能产生共同刺激应答(Hayden等1996《组织抗原》48242；U.S.专利5,580,756)。因此，本发明在一方面提供预防性增强受治疗者对抗原的免疫应答的方法，即，将包含共同刺激分子的细胞外结构域的可溶性组合物给药，以便增强该受治疗者对该抗原的免疫应答。本发明在另一方面提供治疗性增强受治疗者对抗原的免疫应答的方法，即，将包含共同刺激分子的细胞外结构域的可溶性组合物给药，以便增强该受治疗者对该抗原的免疫应答。在一种实施方式中，该共同刺激分子选自由B7-1和B7-2组成的组。
另一方面，本发明提供增强受治疗者对I类限制性抗原的CD8+T细胞应答的方法，即，将包含I类限制性抗原或其片段的第一种试剂和包含B7分子的细胞外结构域的可溶性组合物给药，以便一旦对该受治疗者给药即增强对I类限制性抗原的CD8+T细胞应答。
在一种实施方式中，这些方法进一步包括将II类限制性抗原对该受治疗者给药。在另一种实施方式中，这些方法进一步包括将佐剂对该受治疗者给药。
在一种实施方式中，该B7分子是B7-1分子。在另一种实施方式中，该B7分子是B7-2分子。
在一种实施方式中，该共同刺激分子是单特异性的。在另一种实施方式中，该共同刺激分子是二聚体和二价的。在一种实施方式中，该可溶性共同刺激分子是单特异性的和二聚体和二价的。
在本发明的另外一种实施方式中，B7分子的细胞外部分是与包含免疫球蛋白分子一部分的第二种蛋白质或多肽融合的。在一种实施方式中，该部分免疫球蛋白分子包含半胱氨酸残基。在一种实施方式中，该部分免疫球蛋白分子包含人免疫球蛋白分子的铰链区、CH2与CH3区。在另一种实施方式中，该部分免疫球蛋白分子包含人免疫球蛋白分子的铰链区、CH1、CH2与CH3区。在一种实施方式中，该免疫球蛋白分子已经经过修饰，减少了补体固定和/或Fc受体结合。
在一种实施方式中，该抗原是肿瘤细胞抗原。
在另一种实施方式中，该受治疗者患有选自下组类型的癌症结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、肥大细胞瘤、肉瘤和膀胱癌。
在一种实施方式中，该抗原选自由细菌抗原、病毒抗原和寄生物抗原组成的组。
在一种实施方式中，该免疫应答是细胞免疫应答。在另一种实施方式中，该免疫应答是体液免疫应答。
图例说明

图1显示用II类限制肽免疫小鼠细胞的抗原特异性增殖应答，同时有或没有B7-2Ig(100μg)的共同给药。
图2显示在初次免疫时接受单一B7-2Ig治疗的小鼠细胞在再次免疫后比从未接受B7-2Ig的小鼠具有更大的增殖应答。数据来自平行实验。
图3显示B7-2Ig的共同给药增强对I类限制肽免疫的CTL应答。
图4显示在有或没有II类限制肽和B7-2Ig治疗的存在下，用I类限制肽免疫小鼠的CTL应答。
图5显示B7-IgG为脾细胞的体外增殖和淋巴因子分泌提供共同刺激信号。
图6显示B7Ig在预防性肿瘤疫苗模型中是有效的佐剂。
图7显示用混合有B7-1-或B7-2-IgG的辐射处理P815肿瘤细胞治疗性接种小鼠诱导肿瘤消退，延长存活期。
图8显示用以B7-IgG作为佐剂的治疗性辐射处理肿瘤细胞疫苗免疫小鼠对若干不同的小鼠肿瘤模型是有效的。
图9显示单独的B7-IgG的治疗性给药对小鼠的抗肿瘤作用与其作为疫苗佐剂的作用相当。
图10显示T或B细胞是B7-IgG-介导的抗肿瘤活性所需的。
图11显示CD8+、而非CD4+T细胞是介导B7-IgG抗肿瘤活性所需的。
图12显示已建立肿瘤的B7-IgG疗法与宿主IFN-γ无关。
详细说明本发明提供增强免疫应答的改进方法，即，将可溶性共同刺激分子(例如B7分子的细胞外结构域或B7融合蛋白)给药，从而增强免疫应答。可溶性共同刺激分子在给药时没有交联剂，仍然惊人地刺激T细胞应答。事实上，申请人已经发现，本方法比呈递在表面上的共同刺激分子增加了共同刺激水平，例如细胞表面上的共同刺激分子。
在发明的进一步说明之前，为了方便起见，这里收集了用在说明书、实施例和附后权利要求书中的某些术语。
I、定义本文所用的术语“预防性”包括共同刺激分子在接触抗原之前或与此同时给药，针对该抗原形成、增加和/或增强免疫应答。
本文所用的术语“治疗性”包括共同刺激分子给药治疗现有或进行中的感染或疾病(例如癌症或者病毒或细菌感染)，用共同刺激分子治疗将对该感染或疾病有益。关于治疗性处理，将共同刺激分子在接触抗原之后某一时间点给药，针对该抗原形成、增加和/或增强免疫应答。不言而喻，用共同刺激分子治疗性处理对受治疗者的免疫应答还可能具有其他有益效果，例如不是该特定抗原所特有的。
本文所用的术语“免疫细胞”包括造血起源的并且在免疫应答中扮演角色的细胞。免疫细胞包括淋巴细胞，例如B细胞和T细胞；自然杀伤细胞；骨髓细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、嗜曙红细胞、肥大细胞、嗜碱细胞和粒细胞。
本文所用的术语“免疫应答”包括T和/或B细胞应答，也就是细胞和/或体液免疫应答。在一种实施方式中，所要求保护的方法可以用于减少T辅助细胞应答。在另一种实施方式中，所要求保护的方法可以用于减少细胞毒性T细胞应答。所要求保护的方法可以用于减少初次与再次免疫应答。受治疗者的免疫应答例如可以通过测定抗体产生、免疫细胞增殖、细胞因子的释放、细胞表面标记物的表达、细胞毒性等加以测定。
本文所用的关于活化免疫细胞的术语“共同刺激”包括共同刺激分子提供第二种非活化受体介导信号(“共同刺激信号”)的能力，该信号诱导增殖或效应器功能。例如，共同刺激信号能够例如在已经接受T细胞受体介导信号的T细胞中导致细胞因子分泌。本文所用的术语“共同刺激分子”包括存在于抗原呈递细胞上的分子(例如B7-1、B7-2、B7RP-1(Yoshinaga等1999《自然》402827)、B7h(Swallow等1999《免疫》11423)和/或有关分子(例如同系物))，它们与T细胞上的共同刺激受体(例如CD28、CTLA4、ICOS(Hutloff等1999《自然》397263)、B7h配体(Swallow等1999《免疫》11423)和/或有关分子)。本文也将这些分子总称为“B7分子”。
本文所用的措辞“B7”或“B7分子”包括天然存在的B7-1分子、B7-2分子、B7RP-1分子(Yoshinaga等1999《自然》402827)、B7h分子(Swallow等1999《免疫》11423)、结构上有关的分子、这些分子的片段和/或其功能等价物。术语“等价物”试图包括编码功能相当的共同刺激分子的氨基酸序列，它们具有B7分子的活性，例如与免疫细胞上的天然B7配体结合的能力，例如T细胞上的CTLA4、ICOS和/或CD28，和/或调制免疫细胞共同刺激的能力。
本文所用的“多肽”指的是任意包含两个或多个氨基酸的肽或蛋白质，这些氨基酸通过肽键或改性肽键彼此连接。“多肽”指的是短链，通常称为肽、寡肽和寡聚物，和长链，一般称为蛋白质。多肽可以含有除20种基因编码氨基酸以外的氨基酸。“多肽”不仅包括经过自然过程修饰的那些，例如加工和其他转译后修饰，而且包括经过化学修饰技术修饰的那些。这样的修饰充分描述在基础文章和更详细的专著以及长篇研究文献中，它们是本领域技术人员所熟知的。人们将领会到，在给定的多肽中，相同类型的修饰可以在相同或不同程度上存在于若干位置上。而且，给定的多肽可以含有多种类型的修饰。修饰可以发生在多肽中的任意各处，包括多肽骨架、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。修饰例如包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键生成、去甲基化、共价交联的生成、半胱氨酸的生成、焦谷氨酸盐的生成、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、GPI锚定物生成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯基化、外消旋化、脂质连接、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧基化、羟基化与ADP-核糖基化、硒酸化、转运RNA介导的氨基酸加成为蛋白质(例如精氨酰化)和遍在蛋白化。例如参见《蛋白质——结构与分子性质》第2版，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York(1993)；Wold，F.“转译后的蛋白质修饰观点与展望”，《蛋白质的转译后共价修饰》pgs.1-12，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York(1983)；Seifter等《酶学方法》182626-646(1990)；Rattan等“蛋白质合成转译后修饰与老化”《Ann.N.Y.Acad.Sci.》66348-62(1992)。多肽可以是支链的或者是带有或不带有分支的环状。环状、支链和带有分支的环状多肽可以从转译后的自然过程获得，也可以完全利用合成方法制备。
本文所用的“分离的多肽”或“分离的蛋白质”指的是这样的多肽或蛋白质，当从细胞中分离后或者用重组DNA技术生产时，基本上不含其他多肽、蛋白质、细胞材料和培养基，或者当用化学方法合成时，基本上不含化学前体或其他化学品。“分离的”或“纯化的”多肽或其生物活性部分基本上不含来自该细胞或衍生B7多肽的组织来源的细胞材料或其他污染性多肽，或者当用化学方法合成时，基本上不含化学前体或其他化学品。措辞“基本上不含细胞材料”包括其中该多肽是从该细胞的细胞组分中分离的B7多肽制剂，从该细胞分离或者用重组方法生产该多肽。在一种实施方式中，措辞“基本上不含细胞材料”包括非B7多肽(本文也称为“污染性多肽”)少于约30％(以干重计)的B7多肽制剂，更优选为非B7多肽少于约20％，进而更优选为非B7多肽少于约10％，最优选为非B7多肽少于约5％。当B7多肽或其生物活性部分是用重组方法生产的时，它还优选地基本上不含培养基，也就是说，培养基占多肽制剂体积的不到约20％，更优选为少于约10％，最优选为少于约5％。
措辞“基本上不含化学前体或其他化学品”包括其中该多肽是从参与该多肽合成的化学前体或其他化学品中分离的B7多肽制剂。在一种实施方式中，措辞“基本上不含化学前体或其他化学品”包括化学前体或非B7化学品少于约30％(以干重计)的B7多肽制剂，更优选为化学前体或非B7化学品少于约20％，进而更优选为化学前体或非B7化学品少于约10％，最优选为化学前体或非B7化学品少于约5％。
优选的B7核酸分子与多肽是“天然存在的”。本文所用的“天然存在的”分子指的是具有天然存在的核苷酸序列(例如编码天然B7多肽)的B7分子。另外，还有这些多肽与核酸分子的天然或非天然存在的变体，它们保留了相同的功能活性，例如调制对应激反应的适应作用和/或微生物毒力的能力。这样的变体可以这样制备，例如利用本领域熟知的技术进行突变。作为替代选择，变体可以用化学方法合成。
本文所用的术语“变体”包括这样的核酸分子或多肽，它们在序列上不同于参照核酸分子或多肽，但是保留其必要性质。变体核苷酸序列的变化可能改变、也可能不改变被参照核酸分子编码的多肽的氨基酸序列。核苷酸的变化可以导致在被参照序列编码的多肽中发生氨基酸的取代、加成、删去、融合和截断，讨论见下。典型的多肽变体在氨基酸序列上不同于另一种参照多肽。差异一般是有限的，以致参照多肽与变体的序列总的说来是非常相似的，并且在很多区域是同一的。变体和参照多肽在氨基酸序列上可以通过任意组合的一种或多种取代、加成和/或删去加以区别。核酸分子或多肽的变体可以是天然存在的，例如等位变体，或者它可以是未知是否天然存在的变体。非天然存在的核酸分子与多肽变体可以通过技术人员已知的诱变技术、直接合成和其他重组方法加以制备。
例如，不言而喻的是，本文所述的B7多肽还包括其等价物。这样的变体例如可以这样制备，利用本领域已知的方法进行突变。作为替代选择，变体可以用化学方法合成。例如，利用本领域熟知的技术可以制备B7多肽的突变形式，它们在功能上是等价的(例如具有与CTLA4和/或CD28结合的能力)。突变例如可以包括至少一种分散的点突变，后者可以引起取代，或者包括至少一种删去或插入。例如，可以使用随机诱变。突变还可以通过随机诱变或者利用盒式诱变来完成。关于前者，分子的完整编码区被若干方法(化学、PCR、掺杂寡核苷酸合成)之一诱变，对随机突变的分子集合进行选择或筛选操作。关于后者，对相当于所定义的结构或功能决定子的多肽分散区进行饱和或半随机诱变，再将这些被诱变的盒重新引入到其他野生型等位基因构造中。在一种实施方式中，可以使用PCR诱变。例如，可以使用大引物PCR(O.H.Landt，1990《基因》96125-128)。
本文所用的术语“增强免疫应答”包括利用所要求保护的方法治疗受治疗者，增加T和/或B细胞应答，即细胞和/或体液免疫应答。在一种实施方式中，所要求保护的方法可以用于增强T辅助细胞应答。在另一种实施方式中，所要求保护的方法可以用于增强细胞毒性T细胞应答。所要求保护的方法可以用于增强初次与再次免疫应答。优选地，当与未经治疗的受治疗者或者未用所要求保护的方法治疗的受治疗者相比，所要求保护的方法增加受治疗者的免疫应答。免疫应答的增加例如可以表现为一旦用所要求保护的方法治疗后，受治疗者免疫细胞对抗原的应答增加。受治疗者的免疫应答例如可以利用各种体外或体内免疫细胞活化作用测量加以测定，例如测定抗体产生、免疫细胞增殖、细胞因子的释放、细胞表面标记物的表达、细胞毒性等。
本文所用的术语“可溶性”包括不与细胞缔合的分子，例如共同刺激分子。从细胞缔合分子衍生的可溶性共同刺激分子保留了前者的功能，也就是说它们能够与T细胞上的关连配体结合，经由T细胞上的CD28和/或CTLA4介导信号转导，不过，它们是可溶性的，也就是不与膜结合的。优选地，可溶性组合物包含B7分子的细胞外结构域。
本文所用的术语“共同刺激分子的细胞外结构域”包括共同刺激分子的一部分，它在共同刺激分子的细胞缔合形式中是细胞外的。优选地，共同刺激分子的细胞外结构域包含B7分子的细胞外结构域。B7细胞外结构域包括共同刺激分子介导与CD28和/或CTLA4结合的部分。例如，人B7-1细胞外结构域包含成熟型B7-1的约氨基酸1至约氨基酸208(SEQ ID NO1)，人B7-2细胞外结构域包含成熟型B7-2的约氨基酸24至约氨基酸245(SEQ ID NO2)。在一种实施方式中，可溶性共同刺激分子包含B7分子的细胞外结构域，进一步包含信号序列。
本文所用的术语“I类限制抗原”包括这样的抗原，它与主要组织相容性复合物(MHC)I类沟结合，并且在MHC I类分子构造中被呈递给T细胞。I类限制抗原主要刺激CD8+T细胞。本文所用的术语“II类限制抗原”包括这样的抗原，它与MHC II类沟结合，并且在MHC II类分子构造中被呈递给T细胞。II类限制抗原主要刺激CD4+T细胞。
本文所用的术语“佐剂”包括强化对抗原的免疫应答的试剂。佐剂可以与共同刺激分子联合给药，以另外增加免疫应答。
本文所用的术语“单特异性”包括仅具有一种特异性的可溶性共同刺激分子，也就是说，它们与T细胞上的关连配体结合，例如CD28或CTLA4。这样的单特异性试剂还不包括另外的特异性，因而不以定向方式与其他细胞表面分子结合。本文所用的术语“寡特异性”包括具有一种以上特异性的可溶性共同刺激分子，例如对除B7配体以外的分子具有另外的特异性，例如对细胞表面分子的特异性，例如肿瘤细胞抗原或T细胞受体。本文所用的术语“二价”包括每个可溶性共同刺激分子具有两个结合位点，用于与其关连配体、例如CD28和/或CTLA4发生相互作用。本文所用的术语“二聚体”包括以同型二聚体存在的可溶形式，也就是由两个相同的亚单位组成的单位，二者例如通过二硫键连接在一起。本文所用的术语“多聚的”包括具有两个以上亚单位的可溶形式。
II、可溶性共同刺激分子B7抗原是在B淋巴细胞、专业的抗原呈递细胞(例如单核细胞、树状细胞、朗格罕氏细胞)和向免疫细胞呈递抗原的细胞(例如角质形成细胞、内皮细胞、星形细胞、成纤维细胞、少突胶质细胞)表面上发现的一类共同刺激分子。这些共同刺激分子与T细胞表面上的CTLA4、CD28和/或ICOS或者免疫细胞上其他已知或尚不明确的受体结合。这类共同刺激分子的成员能够向活化的T细胞提供共同刺激作用，从而诱导T细胞增殖和/或细胞因子分泌。
人们已经确立了B7分子的纯化技术，另外已经从许多物种克隆了B7基因(cDNA)，包括人和小鼠(例如参见Freeman，G.J.等(1993)《科学》262909-911；Azuma，M.等(1993)《自然》36676-79；Freeman，G.J.等(1993)《实验医学杂志》1782185-2192)。
共同刺激分子的核苷酸序列是本领域已知的，可以在文献或数据库中找到，例如GenBank。例如参见B7-2(Freeman，G.J.等1993《科学》262909或GenBank入藏号P42081或A48754)、B7-1(Freeman等《实验医学杂志》1991.174625或GenBank入藏号P33681或A45803)、CTLA4(例如参见Ginsberg等1985《科学》2281401或GenBank入藏号P16410或291929)、CD28(Aruffo和Seed《美国国家科学院院报》848573或GenBank入藏号180091)、ICOS(Hutloff等1999《自然》397263；WO 98/38216)和相关的序列。
除了共同刺激分子的天然存在形式以外，术语“共同刺激分子”还包括非天然存在的形式，例如共同刺激分子的变体或突变体形式，它们保留有共同刺激分子的功能，例如与关连反受体结合的能力。例如，在避免与非共同刺激分子基因杂交的条件下(例如在等价于65℃5×SSC(1×SSC＝150mM NaCl/0.15M柠檬酸钠)的条件下)，能够与编码B7分子的DNA杂交的DNA序列可以用于制备抗B7抗体。作为替代选择，在核酸分子编码蛋白质结构域的区域保留序列同一性的DNA序列可以用于生产可用作免疫原的共同刺激蛋白，这些蛋白质结构域对共同刺激分子的功能来说是重要的，例如与其他共同刺激分子结合。优选地，非天然存在的共同刺激分子与天然存在的共同刺激分子细胞外结构域的氨基酸序列具有显著的氨基酸同一性(例如大于70％，优选为大于80％，更优选为大于90-95％)。
为了测定可能对共同刺激分子与其反受体结合来说是重要的共同刺激分子的氨基酸残基，可以对比包含不同物种、例如小鼠和人的共同刺激分子的细胞外结构域的氨基酸序列，记录保守的(例如同一的)残基。例如这可以利用任意的标准对比程序进行，例如MegAlign(DNASTAR)。这样的对比程序详细描述如下。这类保守或同一的残基对共同刺激分子与其受体的正确结合来说可能是必要的，因而不可能会改变。
例如，对介导与CD28和CTLA4的功能相互作用来说是重要的B7-1分子区域已经通过突变进行了鉴别。B7-1V-样结构域中的两个疏水性残基、包括在从各种物种克隆的所有B7-1与B7-2分子中都是保守的Y87残基，被发现是决定性的(Fargeas等1995《实验医学杂志》182667)。利用这些或相似的技术，可以测定决定性共同刺激分子的细胞外结构域的氨基酸残基，它们是决定性的，因此不会改变。
使用B7 cDNA分子，具有B7活性的肽可以利用标准技术加以生产。为表达肽而被转染的宿主细胞可以是任意的原核细胞或真核细胞。例如，具有B7活性的肽可以在下列细胞内被表达细菌细胞、例如大肠杆菌，昆虫细胞(杆状病毒)，酵母，或哺乳动物细胞、例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)和NS0细胞。其他适合的宿主细胞和表达载体可以参见Goeddel，(1990)，见上，或者是本领域技术人员已知的。酿酒酵母内的表达载体实例包括pYepSecl(Baldari等(1987)《欧洲分子生物学组织杂志》6229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz，(1982)《细胞》30933-943)、pJRY88(Schultz等(1987)《基因》54113-123)和pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)。在所培养的昆虫细胞(SF9细胞)内可用于蛋白质表达的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等(1983)《分子细胞生物学》32156-2165)和pVL系列(Lucklow，V.A.和Summers，M.D.，(1989)《病毒学》17031-39)。一般地，COS细胞(Gluzman，Y.，(1981)《细胞》23175-182)与诸如pCDM8等载体(Seed，B.，(1987)《自然》329840)联合用于哺乳动物细胞内的短暂扩增/表达，而CHO(中国仓鼠卵巢)细胞与诸如pMT2PC等载体(Kaufman等(1987)《欧洲分子生物学组织杂志》6187-195)用于哺乳动物细胞内的稳定扩增/表达。优选用于重组蛋白质生产的细胞系是NS0骨髓瘤细胞系，可从ECACC获得(目录#85110503)，描述在Galfre，G.和Milstein，C.中((1981)《酶学方法》73(13)3-46；和《单克隆抗体的制备策略与操作》AcademicPress，N.Y.，N.Y.)。载体DNA可以经由常规技术引入到哺乳动物细胞内，例如磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质转染试剂或电穿孔。适合于转化宿主细胞的方法可以参见Sambrook等(《分子克隆实验室手册》第2版，Cold Spring Harbor Laboratory press(1989))和其他实验室教科书。当用在哺乳动物细胞内时，表达载体的控制功能经常由病毒材料提供。例如，常用的启动子是从多瘤、腺病毒2、巨细胞病毒衍生的，最常见的是猿病毒40。
在哺乳动物细胞或其他细胞内被表达的具有B7活性的肽可以按照本领域的标准操作进行纯化，包括硫酸铵沉淀、分级柱色谱(例如离子交换、凝胶过滤、电泳、亲和色谱等)，最后包括结晶(一般参见“酶的纯化与相关技术”《酶学方法》22233-577(1971))。
用于制备本方法所用可溶性B7分子的B7分子可以来源于任意哺乳动物物种，优选为人。若干来源B7分子的核苷酸序列是本领域已知的。人B7-1的完整DNA序列(CD80)的GenBank入藏号为L25259，公布在Freeman等《科学》1993，2629090或Azuma等《自然》1993，36676中(另见WO 96/40915关于B7-1和B7-2的序列)。人B7-1和人B7-2的核苷酸序列还如SEQ ID Nos 1与2(B7-1)和SEQ ID Nos 3与4(B7-2)所示。作为替代选择，这样一种序列可以这样测定，基于序列与已知的、例如人B7序列杂交的能力，从所需来源分离B7核酸分子。例如，可以检测B7分子在高或低严格条件下与已知编码具有B7活性的肽的核酸分子杂交的能力。适当的促进DNA杂交的严格条件例如在约45℃下的6.0×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，然后在50℃下用2.0×SSC洗涤，这些条件是本领域技术人员已知的，或者可以参见《分子生物学流行方案》JohnWiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。例如，洗涤步骤中的盐浓度可以从约2.0×SSC 50℃的低严格条件到0.2×SSC 50℃的高严格条件中加以选择。另外，洗涤步骤中的温度可以从室温约22℃的低严格条件增加到约65℃的高严格条件。在优选的实施方式中，B7分子是人B7分子。
在一种实施方式中，可溶性共同刺激分子是从天然存在的B7-1或B7-2分子衍生的。具有如本文所述B7分子活性、并且因遗传密码的简并性而具有不同于天然存在B7分子的序列的多肽也可以以可溶形式被表达，也属于本发明的范围。这样的核酸编码功能上等价于B7的多肽(例如具有B7活性的多肽)，但是在序列上不同于本领域已知的B7-1或B7-2。例如，大量氨基酸由一个以上三联体命名。由于遗传密码的简并性，可能存在指定相同氨基酸的密码子或同义密码子(例如CAU和CAC是组氨酸的同义密码子)。作为一个实例，B7分子核苷酸序列内(尤其在密码子的第三个碱基内)的DNA序列多态性可能导致DNA中的“沉默”突变，这并不影响所编码的氨基酸。不过，预期在某一种群内将存在确实引起B7抗原氨基酸序列改变的DNA序列多态性。本领域技术人员将认识到，由于天然的等位基因变异，在某一种群个体中可能存在编码具有新颖B淋巴细胞抗原活性的肽的核酸的一种或多种核苷酸中的这些变异(高达核苷酸的约3-4％)。这样的核苷酸变异和所致氨基酸多态性也属于本发明的范围。此外，还可能存在一种或多种同种型或有关的交叉反应性B7分子。
除了天然存在的等位基因变体以外，本发明范围内的B7分子可以利用本领域公认的技术进行制备。在另一种实施方式中，可溶性共同刺激分子是B7-1或B7-2的修饰形式，它保留了B7共同刺激分子的功能，也就是在功能上是完全相同的。B淋巴细胞抗原的DNA序列经过遗传技术修饰，可以产生氨基酸序列改变了的蛋白质或多肽。这样的序列视为属于本发明的范围，其中被表达的多肽能够与CTLA4和/或CD28结合，并且调制T细胞介导的免疫应答和免疫功能。
例如，在一种实施方式中，按照大量方法的任意一种可以向DNA分子中引入突变，包括用于产生简单的删去或插入、有系统的删去、碱基簇的插入或取代或者单一碱基的取代，生成B淋巴细胞抗原DNA的变体或修饰后的等价物。例如，B7-1或B7-2 cDNA序列的改变、例如氨基酸的取代或删去优选地是通过定向诱变而获得的。定向诱变系统是本领域熟知的。方案和试剂在商业上可以从Amersham International PLC，Amersham，U.K.获得。
具有B7分子活性、也就是具有与B7分子的天然配体结合并且调制T细胞介导免疫应答的能力的修饰后的多肽视为属于本发明的范围，这种能力例如由已经接收初级活化信号的T细胞的细胞因子产生和/或T细胞增殖作用所证实。
具有B7分子活性的肽的另一种修饰实例是半胱氨酸残基优选地被丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸或谷氨酸残基取代，以减少经由二硫键的二聚作用。另外，具有B7活性的肽的氨基酸侧链可以用化学方法修饰。另一种修饰是肽的环化。
为了增强稳定性和/或反应性，具有B7活性的多肽经过修饰，可以在抗原氨基酸序列中掺入一种或多种多态性，这是由任意天然的等位基因变异所引起的。另外，D-氨基酸、非天然氨基酸或非氨基酸类似物经过取代或加成，可以产生属于本发明范围的修饰后的蛋白质。此外，按照A.Sehon及合作者的方法(Wie等，同上)，肽可以用聚乙二醇(PEG)修饰，产生与PEG共轭结合的肽。另外，可以在肽的化学合成期间加入PEG。肽的其他修饰包括还原/烷基化(Tarr《蛋白质微特性化方法》J.E.Silver ed.，Humana Press，Clifton NJ 155-194(1986))；酰化(Tarr，同上)；与适当载体的化学偶联(Mishell和Shiigi，eds《细胞免疫学精选方法》WH Freeman，San Francisco，CA(1980)，美国专利4,939,239)或稀福尔马林处理(Marsh(1971)《国际变态反应与应用免疫学文献》41199-215)。
优选的B7多肽具有B7活性，并且与天然存在的B7氨基酸序列具有至少约60％的同一性，优选为至少约70％的同一性，更优选为至少约80％的同一性。具有B7活性、并且与天然存在的B7分子具有至少约90％同一性、优选为至少约95％、更优选为至少约98-99％同一性的多肽也属于本发明的范围。术语在给定位置上的氨基酸“同一性”指的是当对比两种肽的氨基酸序列时，在对应位置上具有相同的氨基酸。若所比较的序列中某一位置被相同的氨基酸占据，则分子在该位置上是同一的。序列之间同一性的程度(或百分率)是由这些序列共享的匹配或同一位置数量的函数。
本领域普通技术人员能够轻易对比两种氨基酸序列，以提供生物学有义对比。序列的比较和两种序列之间同一性百分率的测定还可以利用数学算法来完成。在一种实施方式中，两种氨基酸序列之间的同一性百分率是利用Needleman和Wunsch(《分子生物学杂志》(48)444-453(1970))算法测定的，该算法已经结合在GCG软件包(可从http//www.gcg.com获得)中的GAP程序内，采用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵，间距权重为16、14、12、10、8、6、5或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。在另外一种实施方式中，两种核苷酸序列之间的同一性百分率是利用GCG软件包(可从http//www.gcg.com获得)中的GAP程序测定的，采用NWSgapdna.CMP矩阵，间距权重为40、50、60、70或80，长度权重为1、2、3、4、5或6。在另一种实施方式中，两种氨基酸或核苷酸序列之间的同一性百分率是利用E.Meyers和W.Miller算法(CABIOS，411-17(1989))测定的，该算法已经结合在ALIGN程序(2.0版)内，采用PAM120权重残基表，缺口长度补偿为12，缺口补偿为4。
本发明的核酸与蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”，以在公用数据库内例如对其他家族成员或有关序列进行检索。这样的检索可以利用Altschul等(1990)《分子生物学杂志》215403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)进行。BLAST核苷酸检索可以利用NBLAST程序、得分＝100、字长＝12进行，以得到与本发明核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质检索可以利用XBLAST程序、得分＝50、字长＝3进行，以得到与本发明B7蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了得到带有缺口的对比以利比较，可以采用Gapped BLAST，如Altschul等(1997)《核酸研究》25(17)3389-3402所述。当采用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。见http//www.ncbi.nlm.nih.gov。
“B7分子的至少一部分细胞外结构域”被定义为这样一种氨基酸序列，它包含B7的完整细胞外结构域序列或其一部分，该序列编码具有活性(也就是与免疫细胞上的天然B7配体结合的能力，例如与T细胞上的CTLA4和/或CD28结合)的多肽。具有B7活性的肽结合CTLA4和/或CD28，调制T细胞介导的免疫应答，这例如得到与这些配体结合或者诱导细胞因子产生和/或已经接收初级活化信号的T细胞增殖作用的证实，如附后实施例所示。在优选的实施方式中，“B7分子的至少一部分细胞外结构域”包括这样一种多肽，它包含人B7抗原的完整细胞外部分(例如B7-1序列的大约第1-208个氨基酸残基或B7-2序列的大约第24-245个氨基酸残基)，这部分可用于结合CTLA4和/或CD28。
除了仅包含天然存在的氨基酸的B7多肽以外，还提供了B7肽模拟物。肽类似物在药物工业中常用作非肽药物，具有类似于模板肽的性质。这些类型的非肽化合物称为“肽的模拟物”或“肽模拟物”(Fauchere，J.(1986)《药物研究进展》1529；Veber和Freidinger(1985)《TINS》p.392；Evans等(1987)《医药化学杂志》301229，引用在此作为参考文献)，在开发中通常借助计算机分子建模。
在结构上与具有治疗价值的肽相似的肽的模拟物可以用于产生等价的治疗或预防作用。一般地，肽模拟物在结构上与多肽范例(也就是具有生物或药理活性的多肽)、例如B7相似，但是其中一条或多条肽键可选地被选自下组的键代替-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH＝CH-(顺式与反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-和-CH2SO-，方法是本领域已知的，进一步描述在下列参考文献中Spatola，A.F.《氨基酸、肽和蛋白质的化学与生物化学》B.Weinstein，eds.，Marcel Dekker，New York，p.267(1983)；Spatola，A.F.《Vega Data》(1983.3.)，1卷，3期，“肽主链修饰”(综述)；Morley，J.S.《药物科学趋势》(1980)pp.463-468(综述)；Hudson，D.等《国际肽与蛋白质研究杂志》(1979)14177-185(-CH2NH-，CH2CH2-)；Spatola，A.F.等《生命科学》(1986)381243-1249(-CH2-S)；Hann，M.M.《英国化学会志柏尔金汇刊I》(1982)307-314(-CH-CH-，顺式与反式)；Almquist，R.G.等《医药化学杂志》(1980)231392-1398(-COCH2-)；Jennings-White，C.等《四面体快报》(1982)232533(-COCH2-)；Szelke，M.等，欧洲专利申请EP 45665(1982)CA9739405(1982)(-CH(OH)CH2-)；Holladay，M.W.等《四面体快报》(1983)244401-4404(-C(OH)CH2-)；Hruby，V.J.《生命科学》(1982)31189-199(-CH2-S-)，它们分别引用在此作为参考文献。特别优选的非肽键是-CH2NH-。
这类肽的模拟物可以具有显著优于多肽实施方式的优点，例如包括生产更经济、化学稳定性更高、药理性质增强(半衰期、吸收、效力、功效等)、特异性改变(例如广谱生物活性)、抗原性降低以及其他等等。肽模拟物的标记通常涉及一种或多种标记物直接或者通过间隔基团(例如酰胺基)与肽模拟物上的非干扰性位置共价结合，这些位置是通过定量结构-活性数据和/或分子建模来预测的。这样的非干扰性位置一般是这样的位置，它们不与大分子形成直接接触，而肽模拟物与这些大分子结合产生治疗效果。肽模拟物的衍生(例如标记)应当基本上不干扰肽模拟物的所需生物或药理活性。
B7氨基酸序列的一个或多个氨基酸被相同类型的D-氨基酸有系统地取代(例如D-赖氨酸代替L-赖氨酸)，可以用于生成更稳定的分子。另外，按照本领域已知的方法可以生成包含B7氨基酸序列或基本上同一的序列变异的约束肽(Rizo和Gierasch(1992)《生物化学年评》61387，引用在此作为参考文献)；例如，加入内在的半胱氨酸残基，这些残基能够形成分子内二硫桥，使肽环化。
本领域技术人员无需过度的实验方法即可生产相当于B7肽序列及其序列变体的多肽。这类多肽可以这样生产，在原核动物或真核动物宿主细胞中，表达编码B7肽序列的多核苷酸，经常作为更大多肽的一部分。作为替代选择，这样的肽可以用化学方法合成。异种多肽在重组宿主中的表达、多肽的化学合成和体外转译的方法是本领域熟知的，进一步描述在Maniatis等《分子克隆实验室手册》(1989)第2版，Cold SpringHarbor，N.Y.；Berger和Kimmel《酶学方法》152卷“分子克隆技术指南”(1987)，Academic Press，Inc.，San Diego，Calif.；Merrifield，J.(1969)《美国化学会志》91501；Chaiken I.M.(1981)《CRC Crit.Rev.Biochem.》11255；Kaiser等(1989)《科学》243187；Merrifield，B.(1986)《科学》232342；Kent，S.B.H.(1988)《生物化学年评》57957；Offord，R.E.(1980)《半合成蛋白质》Wiley Publishing，引用在此作为参考文献。
肽例如可以通过直接的化学合成加以生产。肽可以被制成修饰的肽，其中非肽部分通过共价键与N-端和/或C-端结合。在某些优选的实施方式中，羧基末端或氨基末端或二者都是经过化学修饰的。末端氨基与羧基的最普通的修饰分别是乙酰化和酰胺化。氨基末端修饰例如酰化(例如乙酰化)或烷基化(例如甲基化)，羧基末端修饰例如酰胺化，以及其他末端修饰，包括环化，这些都可以体现在本发明的各种实施方式中。某些氨基末端和/或羧基末端修饰和/或肽延长为核心序列，能够提供有利的物理、化学、生物化学和药理性质，例如稳定性增强、效力和/或功效增加、耐受血清蛋白酶、可取的药动学性质以及其他等等。
本发明还提供B7嵌合或融合多肽。本文所用的B7“嵌合多肽”或“融合多肽”包含用手术方法与非B7多肽连接的B7多肽。“B7多肽”指的是具有相当于B7多肽的氨基酸序列的多肽，而“非B7多肽”指的是具有相当于这样一种多肽的氨基酸序列的多肽，前者多肽与B7多肽基本上不是同源的，例如不同于B7多肽并且来源于相同或不同生物体的多肽。在B7融合多肽内，B7多肽可以相当于B7多肽的全部或一部分。在优选的实施方式中，B7融合多肽包含B7多肽的至少一个生物活性部分。在融合多肽内，术语“用手术方法连接”意在表明B7多肽与非B7多肽彼此是框架内融合的。非B7多肽可以与B7多肽的N-端或C-端融合。
优选的核酸片段编码长度为至少约40个氨基酸残基的B7多肽，优选地长度为至少约80个氨基酸残基，更优选地长度为至少约120个氨基酸残基。特别优选的片段在长度上为至少约200个氨基酸，例如包含B7分子的完整细胞外结构域。大量方法可以用于生成分离DNA序列的片段。编码B7-1或B7-2蛋白质、例如1-30个碱基长度的核酸亚区或片段可以按照标准的有机化学合成手段加以制备。该技术也可用于制备引物，引物用于生成更大的合成B7 DNA片段。
编码B淋巴细胞抗原的基因的更大亚区或片段可以这样被表达为肽，利用聚合酶链反应(PCR)合成有关的DNA碎片(Sambrook，Fritsch和Maniatis《分子克隆实验室手册》第2版，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989))，将所得DNA连接在适当的表达载体内。利用PCR，生成了所克隆的双链DNA的特定序列，克隆在表达载体内，然后测定CTLA4/CD28结合活性。例如，为了利用PCR表达人B7-1或B7-2蛋白的分泌(可溶)形式，可以合成不编码蛋白质的跨膜与胞质区的DNA。这种DNA分子可以连接在适当的表达载体内，引入到宿主细胞中，例如CHO，在那里合成和分泌B7蛋白片段。然后能够轻易地从培养基中获得B7蛋白片段。
在一种实施方式中，编码B7分子的至少一部分、例如缺乏分子跨膜部分的细胞外结构域部分的核酸分子被置于表达载体中，被宿主细胞表达，以便B7分子不在细胞表面上被表达。例如，编码B7分子细胞外结构域的cDNA在合成时可以使用从公开的B7-1或B7-2序列(参见Freeman等《免疫学杂志》1989.1432714或《科学》1993.2629090)衍生的引物，利用聚合酶链反应(美国专利4,683,202)。所得cDNA序列然后可以装配成真核生物或原核生物表达载体，该载体可以用于定向适当宿主细胞、例如COS或CHO细胞合成B7的细胞外结构域。
在另一种实施方式中，表达载体包括编码具有B7抗原活性的肽的DNA和编码第二种多肽的DNA。第二种多肽优选地不是从共同刺激分子衍生的。优选地，本发明的B7嵌合或融合蛋白是用标准的重组DNA技术生产的。例如，将编码不同多肽序列的DNA片段按照常规技术框架内连接在一起，利用采用钝端或交错端进行连接，限制酶消化以提供适当的末端，酌情填入粘端，碱性磷酸酶处理以避免不可取的连接，和酶的连接。在另一种实施方式中，融合基因可以用常规技术合成，包括自动DNA合成仪。作为替代选择，基因片段的PCR扩增可以利用锚定引物进行，该引物引起两个连续基因片段之间的互补突出端，随后可以进行退火和重新扩增，产生嵌合的基因序列(例如参见《分子生物学最新方案》eds.Ausubel等John Wiley & Sons1992)。而且，很多表达载体都是商业上可得到的，并且已经编码融合部分(例如GST多肽)。编码B7的核酸分子可以被克隆在这样的表达载体中，以便该融合部分与B7蛋白质进行框架内连接。例如，可以向肽中加入六-组氨酸，用于固定化金属离子亲和色谱纯化(Hochuli，E.等(1988)《生物工程学》61321-1325)。另外，为了促进不含无关序列的B淋巴细胞抗原的分离，可以在融合部分与肽的序列之间引入特异性内蛋白酶裂解位点。增加肽的溶解度可能是必要的，例如向肽中加入官能团，或者删去肽的疏水区。
在一种实施方式中，将编码B7分子或其部分的DNA与编码免疫应答所需抗原的DNA进行框架内连接，该抗原例如病毒抗原或肿瘤细胞抗原。
在一种实施方式中，将编码相当于B7抗原细胞外结构域的氨基酸序列的DNA与编码相当于免疫球蛋白分子恒定区的氨基酸序列的DNA连接(例如参见美国专利5,580,756或WO 97/28267)。第二种肽可以包括免疫球蛋白恒定区，例如人Cγ1结构域或Cγ4结构域或Cμ或其部分(例如人IgCγ1或人IgCγ4的铰链区、CH2和CH3区，例如参见Capon等US 5,116,964，引用在此作为参考文献)。所得B7Ig融合蛋白可以具有改变了的溶解度、结合亲合性、稳定性和/或化合价(也就是每个分子可利用的结合位点数)，并且可以增加蛋白质纯化的效率。
在优选的实施方式中，免疫球蛋白恒定区中的半胱氨酸残基是保守的，有助于二硫化物的键合和可溶性二聚B7Ig蛋白的生成。在一种实施方式中，B7分子的一部分与IgM抗体或其部分的恒定区融合，有助于可溶性多聚形式的B7Ig蛋白的生成。
特别优选的B7Ig融合蛋白包括与免疫球蛋白恒定区偶联的人B7-1或B7-2的细胞外结构域部分或可变区样结构域。用在可溶性B7分子中的免疫球蛋白恒定区可以含有遗传修饰，这些修饰减少或消除免疫球蛋白结构固有的效应器活性(例如参见WO 97/28267)。例如，编码B7-1或B7-2的细胞外部分的DNA以及编码B7-1或B7-2的可变区样结构域或者B7-1或B7-2的恒定区样结构域的DNA可以与编码经过位点定向诱变修饰的人IgCγ1和/或IgCγ4的铰链区、CH2和CH3区的DNA连接。
如果使用非人免疫球蛋白恒定区，优选地该恒定区被人源化。用于制备嵌合或人源化抗体的技术是本领域熟知的(例如参见Morrison等《美国国家科学院院报》816851(1985)；Takeda等《自然》314452(1985)；Cabilly等美国专利No.4,816,567；Boss等美国专利No.4,816,397；Tanaguchi等欧洲专利公报EP 171496；欧洲专利公报0173494；英国专利GB 2177096B；Teng等《美国国家科学院院报》807308-7312(1983)；Kozbor等《今日免疫学》47279(1983)；Olsson等《酶学方法》923-16(1982)；PCT公报WO 92/06193和EP 0239400)。
用于装配和表达编码相当于B7抗原和可溶性B7Ig分子的氨基酸序列的DNA的技术例如寡核苷酸的合成、PCR、转化细胞、构建载体、表达系统等，都已得到本领域的充分确认。
由重组技术生产的B7融合蛋白和多肽可以从含有蛋白质或肽的细胞与培养基的混合物中分泌和分离。作为替代选择，蛋白质或肽可以保留在细胞质中，收获细胞，溶解，分离蛋白质。细胞培养物通常包括宿主细胞、培养基和其他成分。适合于细胞培养的培养基是本领域熟知的。蛋白质和多肽可以从细胞培养基、宿主细胞中分离，或者利用本领域已知的用于纯化蛋白质和多肽的技术。用于转染宿主细胞和纯化蛋白质与肽的技术在本文中有进一步详细描述。
III、结构相关的可溶性共同刺激分子的活性筛选利用一种或多种若干不同的测定法可以完成结构相关的B7分子筛选，如本文所述它们保留特有的B淋巴细胞抗原活性。例如，肽的筛选可以看出它们保持对与天然存在的B7分子结合的抗-B7单克隆抗体的特异反应性。具体来说，将适当的细胞、例如COS细胞可以用编码供试多肽的DNA转染。在免疫沉淀测定法中，可以利用抗-B7单克隆抗体或CTLA4Ig或CD28融合蛋白评价分泌形式B7的产生。通过移动，还可以试验表达有关肽的细胞与CTLA4或CD28在平板上结合的能力。作为替代选择，还可以试验供试肽与天然存在的B7分子竞争与CD28或CTLA4结合的能力。
其他更优选的测定法试验B7抗原的功能特征。已如前述，T细胞合成细胞因子的能力不仅取决于T细胞受体对抗原的占据或交联(例如由抗-CD3或佛波酯提供的“初级活化信号”，产生“活化的T细胞”)，而且取决于共同刺激信号的诱导，在这种情况下是由与B淋巴细胞抗原的相互作用诱导的，例如B7-1或B7-2与T细胞上的CD28和/或CTLA4分子的相互作用。B7分子与T细胞上的已经经由T细胞受体接收信号的其天然配体的结合具有传递信号给T细胞的作用，诱导产生细胞因子、特别是白介素-2的水平增加，后者进而刺激T淋巴细胞的增殖。其他关于B7功能的测定法因而涉及测定细胞因子的合成，例如白介素-2、白介素-4或其他细胞因子，和/或测定已经接收初级活化信号的CD28+T细胞的T细胞增殖作用。
体外可以这样向T细胞提供第一或初级活化信号，使它们与抗-T3单克隆抗体(例如抗-CD3)或佛波酯接触，或者更优选地，由与I类或II类MHC分子有关的抗原提供。已经接收初级活化信号的T细胞在本文中称为活化的T细胞。B7功能是这样测定的，向T细胞培养物中加入B7源(例如表达具有B7活性的肽或B7的分泌形式的细胞)和初级活化信号(例如与I类或II类MHC有关的抗原)，测定功能结果，例如测定培养物上清液中的白介素-2、γ-干扰素或其他已知或未知的细胞因子。例如，可以采用若干常规的白介素-2测定法的任意一种，例如《美国国家科学院院报》861333(1989)所述测定法，有关部分引用在此作为参考文献。用于干扰素产生测定的试剂盒可从Genzyme Corporation(Cambridge，MA)获得。还可以如下实施例所述测量T细胞增殖。与缺乏共同刺激信号的阴性对照相比，如本文所述保留B7抗原特征的肽可以导致每个T细胞所产生的细胞因子增加，例如IL-2，还可以导致T细胞增殖作用增强。
IV、可溶性共同刺激分子的给药方法本文所述的组合物和/或药物对需要促进免疫应答的受治疗者给药。在一种实施方式中，可溶性B7分子是与抗原预防性给药的，例如在被病原体感染之前或者对未患癌症的受治疗者给药。在另一种实施方式中，可溶性B7分子是治疗性给药的，例如对将从增强共同刺激获益的患病受治疗者给药，例如患有癌症或被病原体感染的受治疗者。
在一种实施方式中，共同刺激分子是与抗原制剂共同给药的。抗原可以是蛋白质、多糖、脂多糖、脂肽，或者它可以是任意这些的组合。例如，抗原可以包括天然蛋白或蛋白片段、合成蛋白或蛋白片段、或肽；它可以包括糖蛋白、糖肽、脂蛋白、脂肽、核蛋白、核肽；它可以包括肽-肽缀合物；或者它可以包括重组的核酸表达产物。
在一种实施方式中，抗原制剂包含抗原的混合物，例如抗原是以辐射处理细胞(例如肿瘤细胞或病毒感染的细胞)、病毒颗粒或粗匀浆的形式给药的。在另一种实施方式中，将抗原肽或抗原肽的重组形式的纯化制剂对受治疗者给药，例如病毒肽或肿瘤相关抗原。在一种实施方式中，抗原制剂包含I类MHC限制肽。在另一种实施方式中，抗原制剂包含II类MHC限制肽。在另一种实施方式中，抗原制剂包含I类限制肽与II类限制肽的组合，用于对受治疗者给药。
在一种实施方式中，抗原是通过“遗传免疫”给药的。在这种实施方式中，将编码有关肽的DNA表达载体注入宿主动物，例如注入受治疗者的皮肤或肌肉。基因产物被正确地合成和糖基化，折叠，被受治疗者表达。利用这种方法，可以将难以足量获得或纯化的抗原给药。在一种实施方式中，通过粒子轰击装置“基因枪”将DNA注入肌肉或者释放到皮肤中，DNA是涂在金微粒上的。已经显示遗传免疫诱导特异性体液应答和细胞免疫应答(例如参见Mor等1995《免疫学杂志》1552039；Xu和Liew.1995《免疫学》84173；Davis等1994《疫苗》121503)。
可溶性B7分子的最优给药过程可以因所治疗的受治疗者而异。例如，可溶性B7分子可以与抗原给药和/或可以在抗原给药之前单独给药，或者可以在抗原给药之后若干天单独给药。在一种实施方式中，可溶性B7分子可以“遗传”给药，也就是将编码可溶性B7分子或其部分的核酸分子给药。在另外一种实施方式中，可溶性B7分子与抗原是以缀合物的形式给药的。
可溶性B7分子的给药剂量方案经过调整，可以为每名受治疗者提供最佳治疗反应，无需进行过度的实验。例如，可以测量对抗原的抗体效价或对抗原的细胞免疫应答(例如DTH应答(Puccetti等1994《欧洲免疫学杂志》241446))，以确定受治疗者是否对抗原正在形成免疫应答或者正在表现增强了的免疫应答，相应地可以调整剂量方案。
活性药物或组合物还可以通过肠胃外或腹膜内方式给药。药物例如可以通过鼻内、口服、静脉内、肌内、皮下或黏膜方式给药。还可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备分散系。在普通的贮存和使用条件下，这些制剂可以含有防腐剂，以防止微生物的生长。
适合注射的药物组合物包括无菌水溶液(若是水溶性的)或分散系，和用于临时制备无菌注射溶液或分散系的无菌粉末。本发明的药物组合物经过配制，可以适合于特定的给药途径。例如，在各种实施方式中，本发明的药物组合物可以适合于注射、吸入或吹入(通过口或鼻)，或者适合于鼻内、黏膜、口服、颊、肠胃外、直肠、肌内、静脉内、腹膜内和皮下释放。
药物或组合物将是无菌的。另外，它们应当在制备和贮存条件下是稳定的，应当防止微生物、例如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，例如含有水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其适合的混合物。适当的流动性可以这样保持，例如利用包衣、例如卵磷脂，在分散系的情况下保持所需的粒径，和利用表面活性剂。各种抗细菌和抗真菌剂可以防止微生物的作用，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫汞撒等。在很多情况下，优选的是在组合物中包括等渗剂，例如糖，多元醇、例如甘露糖醇、山梨糖醇，氯化钠。在组合物中包括延迟吸收的试剂可以延长可注射组合物的吸收，例如一硬脂酸铝和明胶。
无菌注射溶液可以这样制备，向适当的溶剂中加入所需量的活性组合物或药物，以及根据需要的一种如上列举的成分或其组合，然后无菌过滤。一般地，分散系是这样制备的，向含有基本分散介质和如上列举的所需其他成分的无菌载体中加入活性化合物(例如共同刺激分子和/或抗原和任意另外的药物)。在用于无菌注射溶液制备的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，从其预先无菌过滤的溶液中得到活性成分(例如药物或组合物)加任意另外的所需成分的粉末。药物或组合物在给药时可以是适用于无针注射药具的形式(这样的药具是本领域已知的，例如参见5,383,851、5,581,198、5,846,233)，例如《分子医学》1998.4109所述。
当活性药物或组合物被适当保护时，如上所述，蛋白质例如可以与惰性稀释剂或可同化的食用载体一起口服给药。本文所用的“药学上可接受的载体”包括任意所有的溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌与抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这类介质和试剂关于药学活性物质的用途是本领域熟知的。除了与活性化合物不相容的那些常规介质或试剂以外，其在治疗组合物中的用途是被期待的。也可以向组合物中加入补充的活性化合物。
尤其有利的是配制肠胃外组合物的剂量单元形式，有利于给药和剂量的均匀。本文所用的剂量单元形式指的是物理上不连续的单元，适合作为哺乳动物受治疗者的单元剂量；每个单元含有预定量的活性化合物以及所需的药物载体，该预定量经过计算，产生所需的治疗效果。本发明剂量单元形式的规范听命于和直接取决于(a)活性化合物的独特特征和所要达到的治疗效果，和(b)复合这样一种活性药物或组合物用于个体治疗领域所固有的限制。
本文所用的“药学上可接受的载体”例如包括溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌与抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这类介质和试剂关于药学活性物质的用途是本领域熟知的。也可以加入补充的试剂。
本发明的药物以适合于体内药物给药的生物学上可相容的形式对受治疗者给药，以增强免疫应答。“适合于体内给药的生物学上可相容的形式”表示所要给药的蛋白质形式，其中药物的治疗效果重于任何毒性作用。术语受治疗者打算包括其中能够引起免疫应答的活生物体，例如哺乳动物。受治疗者的实例包括人、非人灵长类、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。如本文所述具有B7分子活性的肽的给药可以是任意药理学形式，其中包括治疗有效量的单独的可溶性B7肽、可溶性B7肽与抗原的组合和可溶性B7肽与药学上可接受的载体的组合。
治疗或预防有效量的本发明组合物的给药被定义为在达到所需结果所必要的剂量和时间阶段下有效的量。优选地，可溶性B7分子的给药(含有或不含抗原)导致对抗原(例如病毒或肿瘤细胞抗原)的免疫应答增强。
受治疗者对抗原的免疫应答(例如细胞和/或体液免疫应答)可以利用本领域公认的技术加以测量。对抗原的免疫应答测量可以在体内或体外进行。例如，通过进行活组织检查并寻找细胞浸润，可以测量免疫细胞对肿瘤细胞的反应性。在感染部位或肿瘤部位附近或者在引流淋巴结中可以进行原位细胞因子染色。可以进行细胞的体外培养，以试验细胞对抗原的反应性(例如在抗原存在下的增殖和/或细胞因子产生，和/或对抗原的细胞毒活性)。例如，具有B7活性的多肽的治疗或预防有效量可因各种因素而异，例如个体的疾病状态、年龄、性别与体重、和肽引起个体所需应答的能力。剂量方案经过调整，可以提供最佳的治疗或预防应答。例如，可以每日分若干次给药或者可以适当减少剂量，这视治疗情形的紧急程度而定。
活性化合物可以按适宜的方式给药，例如注射(皮下、静脉内等)、口服给药、吸入、透皮用药或直肠给药。根据给药途径，活性化合物可以是包衣的，以保护化合物不受酶、酸和其他自然条件的作用，这些可能使化合物失去活性。
本发明进一步涉及药物形式的活性化合物，用在本文所述的疗法中。活性化合物还可以用于治疗药物的制备。
V、其他药物的给药治疗可以得到其他药物给药的补充，以进一步增加免疫应答。例如，可以将佐剂和/或细胞因子对受治疗者给药。
在一种实施方式中，可以将细胞因子给药，例如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、白介素1、白介素2、白介素3、白介素4、白介素5、白介素6、白介素7、白介素10和/或白介素12。也可以将干扰素给药，例如α、β和/或γ干扰素。优选地，将诸如IL-12等细胞因子给药，它们有助于Th1-型T辅助应答的形成和细胞免疫的形成。在另一种实施方式中，可以将其他调制共同刺激信号的药物对受治疗者给药，例如抗-CD28抗体。
在另一种实施方式中，可以将已知为佐剂的药物给药。如今唯一广泛用于人的佐剂是明矾(磷酸铝或氢氧化铝)。其他佐剂例如皂甙及其纯化组分Quil A、Freund完全佐剂和其他用于研究与兽医应用的佐剂在人用疫苗中具有潜在的用途。不过，也可以使用新的化学限定的制剂，例如胞壁酰二肽、一磷酰基脂质A、磷脂缀合物(例如Goodman-Snitkoff等《免疫学杂志》147410-415(1991)所述的那些)、雷琐酚、非离子表面活性剂(例如聚氧乙烯油酰醚和正十六烷基聚乙烯醚)、酶抑制剂(包括胰蛋白酶抑制剂)、二异丙基氟代磷酸酯(DEP)和抑肽酶。在将抗原给药的实施方式中，抗原例如可以被包封在脂蛋白体内，如Miller等《实验医学杂志》1761739-1744(1992)所述，引用在此作为参考文献，或者被包封在脂质囊中，例如Novasome TM脂质囊(Micro Vescular Systems，Inc.，Nashua，N.H.)，以进一步增强免疫应答。
除非另有指示，本发明的实施将采用本领域常规的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学技术。这样的技术在文献中有详细解释。例如参见《遗传学分子克隆实验室手册》第2版Sambrook，J.等编(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))；《分子生物学简明方案》第3版Ausubel，F.等编(Wiley，NY(1995))；《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover编，1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编(1984))；Mullis等美国专利No4,683,195；《核酸杂交》(B.D.Hames & S.J.Higgins编(1984))；专著《酶学方法》(Academic Press，Inc.，N.Y.)；《细胞与分子生物学中的免疫化学方法》(Mayer和Walker编，Academic Press，London(1987))；《实验免疫学手册》第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编(1986))；Miller，J.《分子遗传学实验》(Cold Spring HarborPress，Cold Spring Harbor，N.Y.(1972))。
所有引述在本申请中的参考文献、未决专利申请和公布的专利的内容据此特意加以引用作为参照。本文公开的每篇参考文献都是全文引用的。作为本申请优先权基础的所有专利申请也都全文引用在此作为参考文献。
下列实施例进一步阐述本发明，它们不应当被解释为进一步的限制。
实施例实施例1可溶性共同刺激分子增强CTL应答最佳的T细胞活化作用既要求通过T细胞受体发信号，也要求共同刺激作用。B7-1和B7-2是APC表面上的两种有力的共同刺激分子。已经检查了B7-