一种具有不同刚度三维骨组织工程支架材料及其制备方法
[0004]为解决上述技术问题，本发明的具有不同刚度三维骨组织工程支架材料由脱细胞化骨和胶原/羟基磷灰石构成；其特征在于，利用脱细胞化骨保持支架材料的三维微结构，利用不同配比胶原/羟基磷灰石包被处理脱细胞化骨，形成具有不同基质刚度的三维骨组织工程支架材料，以利于诱导干细胞的特定谱系分化。[0005]本发明中，脱细胞化骨可采用常规的方法制备，简而言之为，取新鲜猪股骨头的松质骨，用4°C的0.9%盐水浸泡送至清洁条件下，清除样品上的残余肌肉和组织，根据临床骨缺损情况制成直径为2~20mm、高为2~20mm的圆柱体或者长X宽X高为2~20mmX 2~20mmX2~20mm的立方体等形状样品,冲洗,然后浸泡在蒸懼水中4°C过夜。用1%的TritonX-100处理样品48h。用甲醇对样品进行脱脂24h。DNA酶/RNA酶37°C温育样品2h后，用PBS清洗并持续晃动。将支架浸入无水乙醇中4h，以除去支架上的细胞残余物。用大量的去离子水清洗支架2h，干燥支架，获得脱细胞化骨，保存在4°C环境下。[0006]脱细胞化骨具有三维微孔结构，孔直径可控制在300~800 μ m,孔隙率可以达到80%~95%，并具有良好的联通性。将不同浓度配比的胶原和羟基磷灰石混合物通过灌流的方式对上述脱细胞化骨内部进行处理，得到具有不同梯度刚度的三维骨组织工程支架材料。[0007]本发明还提供所述的具有不同刚度的三维骨组织工程支架材料的制备方法，具体步骤如下:[0008]I)制备脱细胞骨三维支架；[0009]2)配制不同浓度比例的胶原/羟基磷灰石溶液，将步骤I)得到的支架材料浸入所配制溶液中进行灌流，轻轻振荡，保证溶液在材料表面形成均匀的涂层；
[0010]3)冷冻、干燥步骤2)得到的经不同配比胶原/羟基磷灰石包被处理的脱细胞骨三维支架；
[0011]4)将步骤3)得到的经不同配比胶原/羟基磷灰石包被处理的脱细胞骨三维支架通过 1-乙基-3-3-二甲基氨基丙基-碳化二亚氨(N-(3_dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC)和 N-羟基丁二酸亚胺(N-hydroxysuccinimide, NHS)进行交联后，通过0.lmol/L Na2HPO4*12H20将其浸泡清洗lh，然后用去离子水对其清洗，之后将其冷冻干燥得到具有不同刚度三维骨组织工程支架材料；
[0012]5)将步骤4)得到的具有不同刚度的三维骨组织工程支架材料通过6tlCo (2M rad)放射消毒后，将其无菌密封后干燥保存。
[0013]优选地，步骤I)所述的脱细胞骨三维支架制备方法，是取新鲜猪股骨头的松质骨，用4°C的0.9%盐水浸泡送至清洁条件下，清除样品上的残余肌肉和组织，根据临床骨缺损情况制成所需形状样品，冲洗，然后浸泡在蒸馏水中4°C过夜。用1%的Triton X-100处理样品48h。用甲醇对样品进行脱脂24h。DNA酶/RNA酶37°C温育样品2h后，用PBS清洗并持续晃动。将支架浸入无水乙醇中4h，以除去支架上的细胞残余物。用大量的去离子水清洗支架2h，干燥支架，获得脱细胞化骨，保存在4°C环境下。
[0014] 优选地，步骤I)所述的脱细胞骨三维支架制备成直径为2~20mm、高为2~20mm的圆柱体或者长X宽X高为2~20mmX2~20mmX2~20mm的立方体等形状样品。[0015]优选地，步骤2)所述的胶原/羟基磷灰石溶液中羟基磷灰石的质量分数为5wt%~70wt%,胶原质量分数根据所需要刚度在0.lwt%~2.0wt%间变化。
[0016]优选地，步骤2)所述的胶原/羟基磷灰石溶液混合方法为:将上述计算好质量分数的羟基磷灰石粉末缓慢加入已经完全溶解的计算好质量分数的胶原溶液中，不断搅拌，使胶原与羟基磷灰石粉末混合均匀。
[0017]综上所述，本发明的具有不同刚度三维骨组织工程支架材料通过脱细胞骨支架保证材料的三维结构不变，利用不同配比的胶原/羟基磷灰石在支架表面形成不同刚度三维支架材料。与现有的三维骨组织工程支架材料相比，本发明的三维骨组织工程支架材料克服了大多数骨组织工程支架材料在改变基质刚度的同时也改变了微结构的缺陷，这也是本发明提出的关键。本发明提供的三维骨组织工程支架材料具有良好的生物相容性，可保证骨支架的天然微结构和成分，并具有良好的联通性，有利于细胞的粘附与生长，利于营养物质的进入以及细胞代谢废物的及时排出。利用胶原/羟基磷灰石形成的不同刚度，利于不同干细胞的增殖与分化，可以促进新的骨的生成。用于制备三维骨组织工程支架材料的脱细胞骨可选择不同动物不同部分的骨作为材料，只要满足所要修复骨的要求即可。为简洁期间，本发明主要以猪股骨头的松质骨为例加以阐述，其他动物和部分骨也可以采用相同的原理。



[0018]图1示出了分别由本发明提供的一种具有不同刚度三维骨组织工程支架材料制备方法中使用的不同浓度配比的胶原和羟基磷灰石所制备的支架的压缩杨氏模量。
[0019]图2是本发明提供的一种具有不同刚度三维骨组织工程支架材料制备方法中脱细胞化骨支架被0.7wt%胶原/22wt%羟基磷灰石混合溶液表衬前后的孔径分布图。
[0020]图3是本发明提供的一种具有不同刚度三维骨组织工程支架材料制备方法中脱细胞化骨支架被0.7wt%胶原/22wt%羟基磷灰石混合溶液表衬前后的壁厚分布图。

[0021]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0022]将取自新鲜猪股骨头的松质骨用4°C的0.9%盐水浸泡送至清洁条件，清除样品上的残余肌肉和组织，根据临床骨缺损情况制成直径为2~20mm、高为2~20mm的圆柱体或者2~20mm X 2~20mm X 2~20mm的立方体等形状样品，冲洗，然后浸泡在蒸馏水中4°C过夜。用l%Triton X-100处理样品48h。用甲醇对样品进行脱脂24h。DNA酶/RNA酶37°C温育样品2h后，用PBS对其清洗并持续晃动。将支架浸入无水乙醇中4h，来除去支架上的细胞残余物。用大量的去离子水清洗支架2h，干燥支架，获得脱细胞化骨，保存在4°C环境下。脱细胞化骨孔直径可控制在300~800 μ m,孔隙率可控制在80%~95%。
[0023]将计算好质量分数的羟基磷灰石粉末缓慢加入已经完全溶解的计算好质量分数的胶原溶液中，不断搅拌，使胶原与羟基磷灰石粉末混合均匀。胶原/羟基磷灰石溶液中羟基磷灰石的质量分数为5wt%~70wt%，胶原质量分数根据所需要刚度在0.lwt%~
2.0wt%间变化。 例如胶原含量为0.5wt%,羟基磷灰石为22wt%的一组，先称取胶原50mg，用IOmL0.01mol/L的HCl溶解完全溶解，然后称取羟基磷灰石粉末2.2g,缓缓加入已经溶解的胶原溶液中，4 0C下持续搅拌过夜使胶原溶液与羟基磷灰石混合均匀。
[0024]将不同浓度配比的胶原和羟基磷灰石混合物通过灌流的方式对上述三维脱细胞化骨内部进行处理，使胶原和羟基磷灰石混合物在支架表面均匀覆盖。将包被处理好的支架材料首先在-20°C条件下冷冻24h，然后在-55°C、15Pa条件下进行冷冻干燥24h。然后将冷冻干燥好的胶原/羟基磷灰石三维支架材料用溶解于无水乙醇的EDC和NHS进行交联24h，再用0.lmol/L的Na2HPO4.12H20溶液浸泡清洗支架lh，最后用去离子水清洗多次后，在-55°C、15Pa条件下进行冷冻干燥24h，得到具有不同刚度的三维骨组织工程支架材料，然后通过6tlCo (2M rad)放射消毒，之后将其无菌密封后干燥保存，备用。
[0025]为验证所使用方法的可行性，制备了胶原含量为分别为0.35wt%、0.5wt%和0.7wt%，羟基磷灰石为22wt%等的多组胶原/羟基磷灰石支架。下面将以胶原含量为分别为0.35wt%、0.5被％和0.7wt%,羟基磷灰石为22wt%的三组胶原/羟基磷灰石支架为例进行说明，如图1所示，利用美国Bose公司ELF3330力学测试仪器得到它们的平均压缩杨氏模量为6.74±1.16kPa、8.82±2.12kPa和23.61 ±8.06kPa。实验测得脱细胞化骨支架在利用
0.7wt%胶原/22wt%羟基磷灰石混合溶液表衬前后孔径、孔隙率、孔径分布和壁厚分布均没有显著性差异。图2和图3分别为脱细胞化骨支架在0.7wt%胶原/22被％羟基磷灰石混合溶液表衬前后的孔径和壁厚分布图。
[0026]本发明提供的三维骨组织工程支架材料通过脱细胞骨实现天然骨微结构和成分，利用不同配比胶原/羟基磷灰石包被处理脱细胞骨，在不改变支架微结构的情况下形成不同刚度的三维多孔支架材料。正是由于这些综合因素，使得本发明提供的三维骨组织工程支架材料良好的生物相容性，利于不同干细胞的增殖与分化，可以促进新的骨的生成。制备方法简单且成本低 ，相比以往的三维骨组织工程支架材料有明显的优势。