一种从犊牛血液中提取转移因子的方法【技术领域】，尤其涉及一种从犊牛血液中提取转移因子的方法。[0002]转移因子是一种含有多种氨基酸的低分子多肽类物质，具有无热源、无抗原性、无毒副作用以及无种属差异等优点，是一种新型安全的免疫制剂。研究表明，转移因子在增强机体免疫(增强细胞免疫、体液免疫、诱导启动干扰素)，促进机体生长发育等方面有着显著的效果，以其为活性成分制成的药物具有使用剂量小、起效快、药效持续时间长等优点，从而成为现有医药【技术领域】研究的热点之一。[0003]转移因子主要存在于动物的白细胞中，通常以富含白细胞的脾、淋巴结等器官和组织及外周血液T细胞为原料提取，如专利CN 101757029 A公开了一种从牛脾脏中提取转移因子的方法；专利CN 103027927 A公开了一种蛋鸡脾脏转移因子的生产工艺；专利CN I02198155 A公开了一种猪脾转移因子注射液的生产方法。而且，目前有关转移因子提取方法的报道也很多，如专利CN 1654477A公开了一种制备转移因子工艺方法-加热法；专利CN 101838324 A公开了一种转移因子制备的新工艺。[0004]然而，上述的转移因子提取的工艺大都采用了反复冻融的方法，存在费时费工、成本高的缺点。虽然上述专利CN 1654477A采用加热法提取转移因子，节省了反复冻融的步骤，但存在温度难以控制的缺陷，而且加热后对活性蛋白以及转移因子造成了不可逆的失活损害，导致分离时蛋白成分和转移因子分离不彻底，所得产品杂质大的缺点；上述专利CN 101838324 A采用超声裂解的方法提取转移因子，也克服了反复冻融的缺陷，但超声方法对人体伤害大，不宜大规模进行。[0005]针对传统方法中存在的反复冻融以及上述的加热法、超声裂解法存在的缺陷，本发明人经过大量实验总结，提出了一种操作步骤简单、产品易分离、产量高、转移因子活性高的提取工艺，并采用本工艺从犊牛血液中提取转移因子，具有较高的实用性并可进行大规模生产，经检索，尚未有关报道。
[0006]本发明的目的在于:提供一种从犊牛血液中提取转移因子的方法，采用冷冻乙醇低温匀浆处理，再经冰水浴以及低温过滤工艺，既达到防止提取的转移因子失活的目的，又达到降低成本、减少工艺步骤的目的。
[0007]为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
[0008]一种从犊牛血液中提取转移因子的方法，其特征在于:本发明工艺的具体步骤如下:
[0009]1)原料预处理:向采集的犊牛血液中添加肝素钠，并在低温条件下放置；
[0010]2)匀浆:经预处理的原料中加入相当于其I倍体积的体积分数为80%的冷冻乙醇及3倍体积的体积分数为40%的冷冻乙醇，然后进行高速匀浆3min ；[0011]3)酸碱度调节:将经步骤2)处理的匀浆液进行酸碱度调节，具体为调节其pH值在5.0~5.1范围内；
[0012]4)离心分离:将已调节pH值的匀浆液在冰浴中放置30~60min后，在O~4°C条件下离心20min，然后取其上清液，加等体积的去离子水冷冻干燥，即可得到干燥的提取物；
[0013]5 )超滤:将干燥的提取物溶解于去离子水中，按每克提取物加2ml去离子水的比例配制成均匀的溶液，然后用超滤膜进行超滤，超滤后得到的TF溶液再经过冷冻干燥，即可得到TF冻干粉(粗品)；
[0014]6)纯化:上述步骤所得的粗品经过琼脂糖凝胶柱sephadex G50色谱进一步纯化分离，即可得到纯度在98%以上的转移因子提取物。
[0015]进一步，步骤I)中所述的原料预处理工序中，肝素钠的添加量为12.5U/mL血液。
[0016]进一步,步骤I)中所述的原料预处理工序中，低温放置时间为30~60min。
[0017]进一步，步骤I)中所述的原料预处理工序中，所述的低温温度为-20~-10°C。
[0018]进一步，步骤4)中所述的离心分离工序中，离心机的转速为2300~2500rpm/min。
[0019]进一步，步骤5)中所述的超滤膜是孔径为0.02um的中空纤维膜。
[0020]与现有转移因子提取方法相比，本发明的有益效果在于:
[0021]I)本发明在提取过程中，所有工序过程均是在低温条件下进行的，减少反复冻融的步骤，降低成本，提高经济效益；
[0022]2)本发明工艺采用恒低温条件，保持转移因子活性，避免因温度变化引起失活的现象；
[0023]3)采用本发明提取方法从犊牛血液中提取转移因子，较动物脾脏中提取，具有原料易得、材料成本低的优点。

[0024]下面结合具体实例对本发明的技术方案作进一步说明，但不限制本发明的技术范围。
[0025]实施例1
[0026]一种从犊牛血液中提取转移因子的方法，具体步骤如下:
[0027]I)原料预处理:向采集的1000mL犊牛血液中，添加相当量的肝素钠抗凝，然后在_15°C的低温条件下放置45min ；
[0028]2)匀浆:经预处理的原料中加入1000mL体积分数为80%的冷冻乙醇及3000mL体积分数为40%的冷冻乙醇，然后进行高速匀浆3min ；
[0029]3)酸碱度调节:将经步骤2)处理的匀浆液进行酸碱度调节，具体为调节其pH值在5.0~5.1范围内；
[0030]4)离心分离:将已调节pH值的匀浆液在冰浴中放置40min后，在O~4°C条件下离心20min，然后取其上清液，加4930mL的去离子水冷冻干燥，得到8.50g干燥的提取物，其中，离心机的转速为2500rpm/min ；
[0031]5)超滤:将干燥的提取物溶解于去离子水中，按每克提取物加2mL去离子水的比例配制成均匀的溶液，然后用超滤膜进行超滤，超滤后得到的TF溶液再经过冷冻干燥，SP可得到TF冻干粉(粗品)；
[0032]6)上述步骤所得的粗品经过琼脂糖凝胶柱s印hadex G50色谱进一步纯化分离，得到纯度为98.75%的转移因子提取物。
[0033]实施例2
[0034]一种从犊牛血液中提取转移因子的方法，具体步骤如下:
[0035]I)原料预处理:向采集的500mL犊牛血液中，添加相当量的肝素钠抗凝，然后在_20°C的低温条件下放置30min ；
[0036]2)匀浆:经预处理的原料中加入500mL体积分数为80%的冷冻乙醇及1500mL体积分数为40%的冷冻乙醇，然后进行高速匀浆3min ；
[0037]3)酸碱度调节:将经步骤2)处理的匀浆液进行酸碱度调节，具体为调节其pH值在5.0~5.1范围内；
[0038]4)离心分离:将已调节pH值的匀浆液在冰浴中放置40min后，在O~4°C条件下离心20min，然后取其上清液，加2465mL的去离子水冷冻干燥，得到4.12g干燥的提取物，其中，离心机的转速为2400rpm/min ；
[0039]5)超滤:将干燥的提取物溶解于去离子水中，按每克提取物加2mL去离子水的比例配制成均匀的溶液，然后用 超滤膜进行超滤，超滤后得到的TF溶液再经过冷冻干燥，即可得到TF冻干粉(粗品)；
[0040]6 )上述步骤所得的粗品经过琼脂糖凝胶柱sephadex G50色谱进一步纯化分离,得到纯度为99.20%的转移因子提取物。
[0041]实施例3
[0042]一种从犊牛血液中提取转移因子的方法，具体步骤如下:
[0043]I)原料预处理:向采集的IOOmL犊牛血液中，添加相当量的肝素钠抗凝，然后在-10°C的低温条件下放置60min ；
[0044]2)匀浆:经预处理的原料中加入IOOmL体积分数为80%的冷冻乙醇及300mL体积分数为40%的冷冻乙醇，然后进行高速匀浆3min ；
[0045]3)酸碱度调节:将经步骤2)处理的匀浆液进行酸碱度调节，具体为调节其pH值在5.0~5.1范围内；
[0046]4)离心分离:将已调节pH值的匀浆液在冰浴中放置40min后，在O~4°C条件下离心20min，然后取其上清液，加493mL的去离子水冷冻干燥，得到0.85g干燥的提取物，其中，离心机的转速为2300rpm/min ；
[0047]5)超滤:将干燥的提取物溶解于去离子水中，按每克提取物加2mL去离子水的比例配制成均匀的溶液，然后用超滤膜进行超滤，超滤后得到的TF溶液再经过冷冻干燥，即可得到TF冻干粉(粗品)；
[0048]6 )上述步骤所得的粗品经过琼脂糖凝胶柱sephadex G50色谱进一步纯化分离,得到纯度为99.75%的转移因子提取物。
[0049]对实施例1~3所提取的转移因子按照国家药品管理WS1-XG-036-2000进行检测，其结果为:
[0050]1、外观性状:本发明制得的转移因子溶液及冻干粉为淡黄色，符合转移因子溶液及冻干粉的外观性状。[0051]2、氨基酸鉴别反应为正反应。
[0052]3、蛋白反应检测中无浑浊和沉淀，说明蛋白反应均为阴性，其不含大分子蛋白质。
[0053]4、细菌学检验:上述所得样品中无需氧、厌氧、腐生菌和真菌存在。
[0054]5、过敏性、毒性试验:取健康小白鼠雌雄各5只，口服本品冻干粉，相当于正常口服剂量的20倍，观察小白鼠生存能力的变化，结果:无任何过敏、毒性反应，也无任何死亡出现，说明本品是安全的，无任何过敏性、毒性等副作用。
[0055]通过上述实例及产品检测说明，本发明方法从犊牛血液中提取转移因子具有产量高、产品活性高、工艺简单等优点，同时，提取的转移因子符合国家标准要求，可进行大规模生产。