专利名称：一种SecA ATPase抑制剂的筛选方法铜绿假单胞菌(I^eudomonas aeruginosa, PA)，又名绿脓杆菌，是假单胞菌属中的代表菌种。绿脓杆菌是一种非发酵革兰氏阴性细菌，其营养要求不高，广泛分布于医院内各种环境。它可以引起多种类型的感染，如菌血症、肺炎、腹内感染、伤口感染、烧伤感染、尿路感染等。由于其外膜通透性低并存在着外排多种物质的主动外排系统(Active Efflux Systems)，因此多为天然耐多种抗生素菌株，感染后不易被控制。绿脓杆菌对有并发症、使用插入式导管、进行外科手术后的病人感染力特别强。研究显示，医院感染中超过60%的死亡率都与绿脓杆菌相关。绿脓杆菌通过感染病人，毒力可以增强；它甚至能攻击原是健康的人们，引起败血症、心内膜炎、脑脊髓膜炎、胸膜炎、盆腔炎、肾炎、胰腺炎等。由此可见，绿脓杆菌是一种重要的院内感染条件致病菌，是烧伤、外科手术后呼吸道感染中的主要因素。 目前的临床治疗策略包括广谱抗生素的使用(如氟喹诺酮类、氨基糖苷类、碳青霉烯类、三代头孢菌素)和革兰氏阴性菌选择性药物的使用(如氨曲南和哌拉西林)，近年来又推出了 内酰胺类抗生素联合氨基糖苷类或者氟喹诺酮类联合治疗。但是，广谱抗生素的大量使用以及药物的联合治疗导致了多药耐药株以及泛耐药株的急速出现。近年来，除了多尼培南外没有新的抗绿脓杆菌药物入市。因此，迫切需要发现新型低毒、高效抗绿脓杆菌药物。从成千上万个微生物代谢产物或其它来源的天然产物中筛选所需的抗菌药物是非常艰难的一个过程。目前开发新型有用的天然产物药物，虽然仍有很大的潜力，但研究工作的难度越来越大，耗时越来越长，需要的资金也越来越多。为摆脱筛选的盲目性，提高效率，有必要进行定靶筛选，从细菌生存所必须的组成成分或者临床有效抗生素的作用机理和细菌的耐药机理来设计筛选模型，有目的地筛选具有某种作用机理的抗生素，试图获得抗菌作用强、对耐药菌有效、毒性小的新抗生素。Sec途径(即分泌途径secretion pattiway)是蛋白质转运的主要途径。其中，SecA ATPase是蛋白质转运途径中的“动力泵”，它通过ATP的水解循环驱使蛋白质前体穿过细菌内膜，在细菌中是独有且不可缺少的。将^cA作为筛选抗菌药物的靶点，有望建立有效的抗菌药物筛选模型。然而，该项工作进展缓慢，到目前为止仍然没有有关可行方案的报道。
针对上述不足，本发明提供一种kcA ATPase抑制剂的筛选方法。本发明方法包括如下步骤1)配置如下反应体系反应物终浓度Hepes90 IlOmM4MgCl29 ‘ IlmMMnCl21.8 2. 2mMATP9 IlmMPEP0.9 1. ImM
NADH1.3 1. 7mM
SecAATPase2.5 3· 5μ g/ΙΟΟμ 1
丙酮酸激酶1.6 2. OU/lOOy 1
乳酸脱氢酶1.6 2. OU/lOOy 1
2)设置如下各反应组
i)样品实验组向1)所述反应体系中加入适量已知浓度的样品溶液；
ii)阳性对照组-J毛等体积ddH20代替1)所述反应体系中的kcAATPase，抑制率
设为100%，该组表征kcA ATPase的活性被完全抑制；iii)阴性对照组向1)所述反应体系中加入等量的i)所述样品溶液中除样品本身外的溶剂及溶质；3)反应开始后，测定各反应组OD340吸光值变化量，计算反应抑制率，对反应具有抑制作用的即为阳性样品。上述步骤1)优选反应体系为
反应物终浓度
HepesIOOmM
MgCl2IOmM
MnCl22mM
ATPIOmM
PEPImM
NADHCl. 5mM
SecA ATPase3μ g/ΙΟΟμ 1
丙酮酸激酶1. 8U/100y 1
乳酸脱氢酶1. 8U/100y 1
上述步骤2)中样品为化合物时，优选向200 μ 1反应体系中加入1 μ 1
样品溶液作为样品实验组；当样品为发酵液时，优选按照10μ 1发酵液挥干后制成1的样品溶液，加入反应体系作为样品实验组。 上述步骤3)从各组反应体系分别混合均勻后开始测定OD34tl吸光值。具体可按照以下方法进行将2)各组反应体系分别混勻后加入同一块96孔板中，置于酶标仪内，开启温控为37°C进行反应。以反应起始时间为0时刻，每隔2分钟检测一次各孔反应体系在 340nm波长处的吸光值OD34tl,连续检测50min (25次)。
结果分析
分别计算各孔的A0D34(1/min，
AN-AS
再依公式抑制率IR = 其中
AN-AP
χ 100%计算各孔的抑制率。
Δ N是阴性对照孔平均每分钟吸光值的变化量。Δ P是阳性对照孔平均每分钟吸光值的变化量。Δ S是样品实验孔平均每分钟吸光值的变化量。在本发明实施方案中，通过体外表达绿脓杆菌kcAN68蛋白，分离纯化得到 I^kCAN68蛋白，按照上述方法从组合化学库、微生物次级代谢产物库以及天然产物库中共筛选5316个样品，其中3220个化合物，2096个发酵液样品，初筛阳性率79/5316 = 1.5%, 复筛阳性率49/5316 = 0.9% (以抑制率大于30 %为筛选阳性标准)。其中，活性化合物三个，分别为 IMB202950U IMB2030271 和 IMB2039021，抑制率分别为 32. 8%、43. 0%和 66. 8%。抑菌试验表明这三个化合物对绿脓杆菌均具有良好的抑制作用。本发明kcA ATPase抑制剂的筛选方法简单可靠，效率高，成本低，是一种理想的抗生素筛选方法。
在不背离

模板(基因组DNA)1 μ 1
上游引物(20pM)1 μ 1
下游引物(20pM)1 μ 1
2XPfu Mixture25 μ 1
无核酸酶ddH2022 μ 1
总体积50 μ 1
PCR反应的条件为
95°C预变性5min


本发明提供了一种筛选SecA ATPase抑制剂的方法，该方法提供了一种优化的ATPase酶活测定体系，建立了SecA蛋白ATPase活性抑制剂的蛋白水平筛选模型。本发明方法简单可靠，效率高，成本低，是一种理想的抗生素筛选方法。运用该筛选方法从化合物库的3220个样品中筛选得到可抑制绿脓杆菌SecA ATP酶的活性阳性化合物3个。从2096个微生物代谢粗提物中得到45个阳性样品，筛选阳性率为0.9％(以抑制率大于30％为筛选阳性标准)。