专利名称：一种黑曲霉及其发酵竹笋或竹笋残渣提高植物甾醇含量的方法竹笋，别名笋或闽笋，为多年生常绿草本植物，食用部分为初生、嫩肥、短壮的芽或鞭。竹舆，在我国自古被当作“菜中珍品”，制作出的菜肴风味独特，烟笋烧肉、烟笋烧鸭、油焖烟笋、烟笋火锅等菜深受广大食客朋友的喜爱和青睐。传统中医认为竹笋味甘、微寒，无毒，具有清热化痰、益气和胃、治消渴、利水道、利膈爽胃等功效。现代营养学研究也表明，竹笋富含蛋白质、胡萝卜素、多种维生素及铁、磷、镁等无机盐和有益健康的18种氨基酸。竹笋还具有低脂肪、低糖、多纤维的特点，食用竹笋不仅能促进肠道蠕动，帮助消化，去积食， 防便秘，并有预防大肠癌的功效，竹笋还可以减少人体对脂肪的吸收，减少与高血脂有关疾病的发病率。此外，竹笋含脂肪、淀粉很少，属天然低脂、低热量食品，是肥胖者减肥的佳品。近年来随着人们物质生活水平的日益提高和保健意识的增强，竹笋的需求量越来越大，同时产生了大量竹笋残渣。竹笋残渣是竹笋加工过程产生的剩余物，包括笋头和笋衣，占竹笋的50 70%。2010年我国产生的竹笋残渣为150 200万吨，其中仅重庆地区就高达30万吨，大量的竹笋残渣未经充分利用便遭丢弃，不仅造成资源的浪费，而且对环境和生态造成严重影响，其所带来的环境生态问题亟待解决。现代营养学研究表明竹笋残渣并不是毫无益处的废弃物，其含有丰富的次生代谢产物，其中以植物留醇含量最高。植物留醇是一种存在于植物中的天然活性物质，具备无毒无害、乳化、稳定等特性，不仅可直接用于消炎、降血脂、抗溃疡和防治癌症等，也是生产甾体药物的重要原料，随着生命科学、油脂科学与工程技术的迅速发展，植物留醇在医药、食品、化工和饲料等领域得到了关注和重视。竹笋中的植物留醇含量随竹笋品种及部位的不同存在明显差异，其中谷甾醇、豆留醇及胆留醇占95%以上。药理药效研究结果表明，竹笋中的植物留醇能显著降低高脂血症大鼠血清总TC、TG、LDL-C含量和动脉粥样硬化指数，而对HDL-C含量没有影响；能有效降低大鼠肝脏TC、TG水平，减轻脂肪肝和降低肝指数，对肝脏的色泽、质地、体积有显著改善作用；同时，还具有显著的抗炎作用；并且对白血病细胞有明显的抑制功能。我国有着丰富竹笋资源及竹笋加工下脚料-竹笋残渣，可作为制取植物留醇开发研究的理想资源。因此，随着植物留醇制取方法研究的深入，竹笋及其残渣中高含量植物甾醇的药用价值将越来越受到人们的重视，特别是当前天然功能性制品深受消费者青睐，所以利用竹笋及竹笋残渣开发制取植物留醇及其功能性制品的前景非常广阔。目前，在竹笋植物留醇的制取方法方面，主要有溶剂萃取法、超临界流体萃取法、 短分子蒸馏法、发酵法等。超临界ω2流体萃取竹笋中植物留醇的工艺研究表明，无论在萃取率还是制剂精度上均优于传统溶剂(正己烷)提取。国外研究者KanarAala Sarangthem等采用从发酵的竹笋汁中分离鉴定的B. subtilis菌种进行发酵，最终留醇含量可达发酵前的2倍，但由于其发酵周期较长，无法满足大规模工业化生产的需要，未得到广泛应用。
有鉴于此，本发明目的是提供一种发酵时间短、发酵制取植物留醇能力高的黑曲毒ο本发明所述黑曲霉，是从腐烂的方竹笋残渣中分离筛选出发酵竹笋残渣后植物甾醇含量高的黑曲霉，然后通过对所得黑曲霉进行驯化，获得的一株新型的高产竹笋留醇的漂曲毒。本发明所述经驯化获得的黑曲霉菌株已于2011年11月29日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行了保藏，保藏中心地址为武汉省武昌市珞珈山武汉大学校内，保藏编号为 CCTCC No. M2011428。试验表明，未经驯化的黑曲霉菌液的活菌数量为6. 2X IO3个/mL时，发酵竹笋残渣制取植物甾醇含量为816.6mg/100g.干重，发酵所需时间为8天。而经驯化的保藏编号为CCTCC No. M2011428的黑曲霉菌液的活菌数量为5. OX IO3个/mL时，发酵竹笋残渣制取植物甾醇含量为1011.4mg/100g.干重，发酵所需时间为5天。经驯化的保藏编号为CCTCC No. M2011428的黑曲霉菌株与未经驯化的黑曲霉菌株在制取植物甾醇能力及所需发酵时间上均具有显著差异(P < 0. 05)，表明经驯化获得的保藏编号为CCTCC No. M2011428的黑曲霉菌株制取植物留醇能力显著提高。同时，按照上述实验方法分别采用未经驯化的黑曲霉菌株的菌液和经驯化的保藏编号为CCTCC No. M2011428的黑曲霉菌株的菌液发酵竹笋制取植物留醇，结果显示，经驯化的保藏编号为CCTCC NO.M2011428的黑曲霉菌株发酵竹笋制取植物留醇的含量明显高于未经驯化的黑曲霉菌株，并且发酵时间也较未经驯化的黑曲霉菌株短。因此，本发明提供了所述经驯化的保藏编号为CCTCC NO.M2011428的黑曲霉在提高竹笋及竹笋残渣中植物留醇含量中的应用。本发明还提供了一种提高竹笋或竹笋残渣中植物留醇含量的方法，即取预处理的竹笋或竹笋残渣，加入保藏编号为CCTCC NO.M2011428的黑曲霉的菌液发酵即得。本发明所述竹笋为可供食用的任一竹笋品种，包括毛竹笋、淡竹笋、麻竹笋、方竹笋、慈竹笋、绿竹笋、大头典竹笋、幼叶甜竹笋等多个品种。本发明所述竹笋残渣为上述可供食用的任一品种竹笋加工过程产生的所有剩余物，包括笋头和笋衣。作为优选，所述黑曲霉菌液中黑曲霉活菌数量为5. OX IO3 1.0 X IO4个/mL，更优选的，所述黑曲霉菌液中黑曲霉活菌数量为1. 0 X IO4个/mL。本发明所述提高竹笋或竹笋残渣中植物留醇含量的方法，所述发酵可以为固态好氧、固态厌氧、液态好氧或液态厌氧，优选的，所述发酵为固态好氧发酵。优选的，本发明所述提高竹笋或竹笋残渣中植物留醇含量的方法，所述黑曲霉菌液加入量为每IOOg竹笋或竹笋残渣加入黑曲霉菌液3. 0 5. OmL,更优选的，所述黑曲霉菌液加入量为每IOOg竹笋或竹笋残渣加入黑曲霉菌液4. OmL。作为优选，本发明所述提高竹笋或竹笋残渣中植物留醇含量的方法，所述发酵的温度为30. O 36. 0°C，更优选为33. 0°C。作为优选，本发明所述提高竹笋或竹笋残渣中植物留醇含量的方法，所述发酵的时间为4 6天，更优选为5天。优选的，本发明所述提高竹笋或竹笋残渣中植物留醇含量的方法，在发酵前还添加了氮源，所述氮源为尿素。作为优选，所述尿素的添加量以质量分数计为3. 0 5. 0%，更优选为4. 0%。本发明所述提高竹笋或竹笋残渣中植物留醇含量的方法还包括干燥、封装和灭菌的步骤。具体地，本发明提供一种提高竹笋或竹笋残渣中植物留醇含量的方法，包括对新鲜的竹笋或竹笋残渣进行预处理，粉碎成竹笋颗粒或竹笋残渣颗粒；在竹笋颗粒或竹笋残渣颗粒中按每IOOg竹笋颗粒或竹笋残渣颗粒加入保藏编号为CCTCC NO.M2011428的黑曲霉菌液3.0 5. OmL，添加3.0 5. O %的尿素作为氮源，在30. O 36.0°C的发酵温度下，进行固态好氧发酵，发酵时间为4 6天；其中，所述黑曲霉菌液的活菌数量为 5. O X IO3 1. OX IO4个/mL。发酵后，测得发酵样品中植物甾醇含量由发酵前的412. 5 523. 4mg/100g.干重提高到 701. 2 1184. 5mg/100g.干重。由以上技术方案可知，本发明从腐烂竹笋残渣中分离筛选出一种黑曲霉，通过驯化该黑曲霉，获得保藏编号为CCTCC NO.M2011428的一株高产植物留醇的新型黑曲霉菌株。本发明还提供了利用保藏编号为CCTCC NO.M2011428的黑曲霉发酵竹笋或竹笋残渣提高竹笋或竹笋残渣中植物留醇的方法，该方法能使植物留醇从发酵前的412. 5 523. 4mg/100g.干重，提高至701. 2 1184. 5mg/100g.干重，同时缩短发酵时间。既减少了竹笋残渣对环境的污染，又提高了竹笋经济效益，有效推进竹笋及竹笋残渣深度开发制取植物留醇的产业化进程。生物保藏说明菌株黑曲霉分类命名为黑曲霉，Aspergillus niger于2011年11月四日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏中心地址为武汉省武昌市珞珈山武汉大学校内， 保藏编号为 CCTCC NO.M2011428。
图1示黑曲霉发酵竹笋或竹笋残渣的工艺。

毒ο本发明将分离筛选所得黑曲霉接种于改良马丁斜面培养基中培养，然后制成菌液发酵竹笋残渣，待竹笋残渣上长满黑曲霉孢子后，挑取上述所得黑曲霉孢子，再次制备成菌液重复发酵竹笋残渣，进行多次驯化，结果表明，黑曲霉发酵竹笋残渣制取植物留醇时，随驯化次数的增加，植物留醇含量也随之增加，当驯化次数超过3次后，随驯化次数的增加， 植物留醇含量趋于平稳，基本保持不变。因此，本发明从腐烂方竹笋残渣中分离筛选出一种发酵竹笋残渣后植物留醇含量高的黑曲霉，通过驯化该黑曲霉，获得了一株新型的高产竹笋植物留醇的黑曲霉，该黑曲霉菌株已于2011年11月四日在中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)保藏。试验表明，未经驯化的黑曲霉菌液的活菌数量为6. 2X103f/mL时，发酵竹笋残渣制取植物甾醇含量为816. 6mg/100g.干重，发酵所需时间为8天；本发明提供的经驯化、 保藏编号为CCTCC No. M2011428的黑曲霉菌液的活菌数量为5. OX IO3个/mL时，发酵竹笋残渣制取植物甾醇含量为1011.%ig/100g.干重，发酵所需时间为5天。经驯化、保藏编号为CCTCC No. 1120114 的黑曲霉菌株与未经驯化的黑曲霉菌株在制取植物留醇能力及所需发酵时间上均具有显著差异(P < 0. 05)，表明本发明提供的经驯化的黑曲霉菌株制取植物甾醇能力显著提高。同时，经驯化的保藏编号为CCTCC NO.M2011428的黑曲霉菌株发酵竹笋制取植物留醇的含量也明显高于未经驯化的黑曲霉菌株，并且发酵时间也较未经驯化的黑曲霉菌株短。因此，本发明提供了所述经驯化的、保藏编号为CCTCC No. 1120114 的黑曲霉在提高竹笋或竹笋残渣中植物留醇含量中的应用。本发明同时还提供了一种提高竹笋或竹笋残渣中植物留醇含量的方法，为取预处理的竹笋或竹笋残渣，加入保藏编号为CCTCC NO.M2011428的黑曲霉的菌液发酵即得。作为优选，所述黑曲霉菌液中黑曲霉活菌数量为5. OX IO3 1.0 X IO4个/mL，更优选的，所述黑曲霉菌液中黑曲霉活菌数量为1. 0 X IO4个/mL。在具体实施例中，本发明通过在IOOg经预处理的竹笋残渣加入不同量保藏编号为CCTCC NO.M2011428的黑曲霉的菌液，在附加4%尿素氮源的条件下，33°C下固态好氧发酵5天，分析发酵后的竹笋残渣样品中植物留醇含量，结果表明随接种量的增加，植物甾醇含量也随之增加，当接种量超过5mL后，随接种量的增加，含量反而减少。因此，所述黑曲霉菌液加入量优选为每IOOg竹笋残渣加入黑曲霉菌液3. 0 5. OmL,更优选为每IOOg竹笋残渣加入黑曲霉菌液4. OmL。发酵是指生物体对于有机物的某种分解过程，根据发酵的特点和微生物对氧的不同需要，可以将发酵分成若干类型，如按发酵形式来区分，则有固态发酵和液体发酵；按发酵过程中对氧的不同需求来分，一般可分为厌氧发酵和好氧发酵两大类型。其中固态发酵是指利用自然底物做碳源及能源，或利用惰性底物做固体支持物，其体系无水或接近于无水的任何发酵过程。液态发酵是指在生化反应器中，模仿自然界将微生物在生育过程中所必需的糖类、有机和无机含有氮素的化合物、无机盐等一些微量元素以及其它营养物质溶解在水中作为培养基，灭菌后接入菌种，通入无菌空气并加以搅拌，提供微生物菌体呼吸代谢所需要的氧气，并控制适宜的外界条件，进行菌丝大量培养繁殖的过程。厌氧发酵是复杂有机物在无氧条件下利用厌氧微生物发酵性细菌、产氢产乙酸菌、耗氢耗乙酸菌、食氢产甲烷菌、食乙酸产甲烷菌等降解生成N、P等无机化合物和甲烷、二氧化碳等气体的过程。而好氧发酵则是在有氧的条件下进行有机物降解的过程。本发明通过在IOOg经预处理的竹笋残渣加入一定量保藏编号为CCTCC NO.M2011428的黑曲霉的菌液，在附加4%尿素氮源的条件下，分别采用固态好氧、固态厌氧、液态好氧和液态厌氧的发酵方式，在33°C下发酵5天，分析发酵后的竹笋残渣样品中植物留醇含量，结果表明无论采取哪种发酵方式均能有效提高植物留醇含量，由发酵前的 523. 4mg/100g.干重提高到876. 2 1184. 5mg/100g.干重，其中，采用固态好氧发酵方式后植物甾醇含量提高最多，为1184. 5mg/100g.干重。因此，本发明所述提高竹笋残渣中植物甾醇含量的方法，所述发酵可以为固态好氧、固态厌氧、液态好氧或液态厌氧，优选为固态好氧发酵。在具体实施例中，本发明通过在IOOg经预处理的竹笋残渣加入一定量保藏编号为CCTCC NO.M2011428的黑曲霉的菌液，在附加4%尿素氮源的条件下，采用固态好氧的发酵方式，在不同的温度下发酵5天，分析发酵后的竹笋残渣样品中植物留醇含量，结果表明随发酵温度的增加，植物留醇含量也随之增加，当发酵温度超过33°C后，随发酵温度的增加，植物留醇含量反而减少。因此，作为优选，本发明所述提高竹笋残渣中植物留醇含量的方法，所述发酵的温度为30. 0 36. 0°C，更优选为33. 0°C。本发明通过在IOOg经预处理的竹笋残渣加入一定量保藏编号为CCTCC NO.M2011428的黑曲霉的菌液，在附加4%尿素氮源的条件下，采用固态好氧发酵方式，在 33°C下分别发酵不同时间，分析发酵后的竹笋残渣样品中植物留醇含量，结果表明随发酵时间的增加，植物留醇含量也随之增加，当发酵时间超过5天后，随发酵温度的增加植物甾醇含量趋于平稳，变化不明显。因此，本发明所述提高竹笋残渣中植物留醇含量的方法，所述发酵的时间优选为4 6天，更优选为5天。在一具体实施例中本发明通过在IOOg经预处理的竹笋残渣加入一定量保藏编号为CCTCC No. M2011428的黑曲霉的菌液，然后分别在不含氮源和附加不同氮源的条件下，采用固态好氧发酵方式，在33°C下发酵5天，分析发酵后的竹笋残渣样品中植物留醇含量，结果表明以尿素或氯化铵作为氮源能提高植物留醇含量，其中以尿素作为氮源时，植物甾醇含量提高最大。而以硫酸铵或硝酸钾作为氮源反而使植物留醇含量减少，植物留醇含量低于不含氮源的情况。因此，作为优选，本发明所述提高竹笋残渣中植物留醇含量的方法，在发酵前还添加氮源，所述氮源优选为尿素。在另一具体实施例中本发明还通过按照上述方法采用不同尿素添加量分析发酵后的竹笋残渣样品中植物留醇含量，结果表明随尿素添加量的增加，植物留醇含量也随之增加，当尿素添加量超过4%后，随尿素添加量的增加，植物留醇含量反而有所减少。因此， 所述尿素的添加量以质量分数计优选为3. 0 5. 0%，更优选为4. 0%。具体地，本发明提供的一种提高竹笋或竹笋残渣中植物留醇含量的方法包括对新鲜的竹笋或竹笋残渣进行预处理，粉碎成竹笋颗粒或竹笋残渣颗粒；在竹笋颗粒或竹笋残渣颗粒中按每IOOg加入菌液3. 0 5. OmL的接种量加入保藏编号为CCTCC No. M2011428 的黑曲霉菌液，按质量分数计添加3. 0 5. 0%的尿素作为氮源，在30. 0 36. 0°C的发酵温度下，进行固态好氧发酵，发酵时间为4 6天；其中，所述黑曲霉菌液的活菌数量为 5. OX IO3 1. OX IO4个/mL。发酵后，测得发酵样品中植物甾醇含量由发酵前的412. 5 523. 4mg/100g.干重提高到 701. 2 1184. 5mg/100g.干重。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。实施例1 分离筛选发酵竹笋残渣后植物留醇含量高的黑曲霉(1)菌种源的选择通过利用方竹笋残渣设计8组不同堆积方式进行腐烂，待一段时间后，各取出部分腐烂样品进行植物留醇含量测定，选择植物留醇含量最高的那组作为菌种源。(2)特异性培养基的配制①牛肉膏蛋白胨培养基取牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂20g、蒸馏水 IOOOmL,调节PH至7. 3左右，在121°C灭菌30min，用于筛选细菌类微生物。②高氏一号培养基取可溶性淀粉20g、氯化钠0. 5g、硝酸钾lg、磷酸氢二钾0. 5g、 硫酸亚铁0. Olg、琼脂20g、蒸馏水lOOOmL，121°C灭菌30min，用于筛选放线菌类微生物。③改良马丁培养基取蛋白胨5g、酵母粉2g、葡萄糖20g、磷酸氢二钾lg、硫酸镁 0. 5g、琼脂20g、蒸馏水lOOOmL，121°C高压灭菌30min，用于筛选真菌类微生物。(3)菌种的分离将所得菌种源分别用上述3种特异性液体培养基进行多次分类传代培养，所得菌液分别采用特异性琼脂培养基进行培养、分离、继续培养、分离，直至分离到单菌落菌种。(4)最佳菌种的选择通过对分离得到的单菌落菌种进行发酵竹笋残渣实验，比较发酵样品中得植物留醇含量，从中筛选出植物留醇含量最高的那组作为最佳菌种。(5)最佳菌种送北京三博远志生物技术有限责任公司进行种属鉴定，鉴定结果为
漂曲毒。实施例2 本发明分离筛选所得黑曲霉的驯化次数对发酵竹笋残渣制取植物甾醇能力的检测(1)活化菌种挑取上述分离筛选所得黑曲霉接种于改良马丁斜面培养基中，于 33 °C培养箱下培养3 4d。(2)配制菌液用无菌水将斜面上的黑曲霉孢子洗下，震荡制成黑曲霉菌液，活菌数量为 5. 0 X IO3 1. 0 X IO4 个 /mL。(3)发酵竹笋残渣取IOOg竹笋残渣，加入上述菌液4mL，混勻后，于33°C恒温箱中培养，待竹笋残渣上长满黑曲霉孢子后，停止培养。(4)黑曲霉驯化挑取上述所得黑曲霉孢子，用无菌水配制成约活菌数量为 5. OX IO3 1.0 X IO4个/mL的菌液，按照上述( 发酵竹笋残渣所示方法，直接将菌液与竹笋残渣混勻，进行发酵，待竹笋残渣上长满黑曲霉孢子后，停止培养；重复操作进行多次驯化，将每次驯化的黑曲霉进行发酵竹笋残渣，测定发酵后的样品中植物留醇含量，结果见表1。表1不同驯化次数的黑曲霉发酵竹笋残渣制取植物留醇情况


本发明涉及微生物发酵领域，具体的说是涉及一种黑曲霉及其发酵竹笋或竹笋残渣提高植物甾醇含量的方法。本发明从腐烂竹笋残渣中分离筛选出一种黑曲霉，通过驯化该黑曲霉，获得保藏编号为CCTCC No.M2011428的一株高产植物甾醇的新型黑曲霉菌株。本发明还提供了利用保藏编号为CCTCC No.M2011428的黑曲霉发酵竹笋或竹笋残渣提高植物甾醇含量的方法，该方法能使植物甾醇从发酵前的412.5～523.4mg/100g.干重，提高至701.2～1184.5mg/100g.干重，同时缩短发酵时间。既减少了竹笋残渣对环境的污染，又提高了竹笋经济效益，有效的推进竹笋残渣深度开发制取植物甾醇的产业化进程。