专利名称：减毒的人－牛嵌合呼吸道合胞病毒疫苗的生产的制作方法人呼吸道合胞病毒(HRSV)是世界范围内严重儿科呼吸道疾病的首要病毒(Collins等，Fields Virology 21313-1352，1996)。作为1岁以下婴儿中肺炎和支气管炎的发病原因，RSV位列所有其他微生物病原体之前。事实上到2岁时所有儿童均受过感染，而且在年龄较大的儿童和青年中再感染频率也很高(Chanock等，in Viral Infections of人s，3rd ed.，A.S.Evans，ed.，Plenum Press，N.Y.，1989)。在因呼吸道疾病住入儿童医院的患者中，1/5以上由RSV引起的，仅在美国每年导致近100,000人住院和4,500例死亡。(Heilman，J.Infect Dis 161402-6，1990)。另外，有证据表明在生命早期的严重呼吸道感染可能引起或加剧哮喘(Sigurs等，Pediatrics 95500-5，1995)。尽管通常认为人RSV是在儿童人群中，但也认识到它是老年人中的一种严重疾病(Falsey等，J.Infect.Dis.172389-394，1995)。在特定的免疫受损个体例如骨髓移植受体中，人RSV还会引起威胁生命的疾病(Fouillard，et al.，Bone Marrow Transplant 997-100，1992)。为了治疗人RSV，使用了一种化疗药物三氮唑核苷。但是其效力和应用受到质疑。还有被许可的用于RSV干扰的产品，它们是由集池的供体IgG(Groothuis等，N Engl J Med 3291524-30，1993)或者是人源化RSV特异性单克隆抗体组成。这些产品作为被动的免疫预防剂施用给高危个体。尽管这些产品是有用的，但其高成本和其他因素，例如缺乏长期效果使这些产品不适宜广泛使用。其他缺点包括可能转移血液携带的病毒，而且制备和贮存困难，费用高。此外，控制传染病，特别是病毒性疾病的历史表明疫苗是最重要的。尽管数十年来致力于开发抗RSV的有效疫苗，但尚未得到可预防与RSV感染有关的严重发病率和显著死亡率的安全有效的疫苗。不能成功地开发疫苗部分原因是由于婴儿已降低了对RSV抗原的血清和分泌性抗体反应。因此，这些个体遭受更严重的RSV感染，而累积性免疫似乎可保护年龄较大的儿童和成人抵御这种病毒更严重的冲击。最近RSV感染中免疫机理已成为关注的焦点。在保护上呼吸道的过程中分泌性抗体似乎是最重要的，而认为高水平的血清抗体在抵抗下呼吸道RSV感染中起主要作用。RSV-特异性细胞毒T作为诱导免疫的另一效应武器，在消除RSV感染中也是很重要的。但是，尽管通过预先免疫以提高对病毒攻击的抗性从而增强后一种作用，但是该效果是短期的。F和G表面糖蛋白是两种主要的RSV保护性抗原，并且是唯一两种已表明诱导RSV中和抗体和长期抵抗攻击的RSV蛋白(Collins等，Fields Virology，Fields等编，21313-1352，Lippincott-Raven，Philadelphia，1996；Connors等，J.Virol.65(3)1634-7，1991)。第3种RSV表面蛋白，SH，不会诱导RSV-中和抗体或者针对RSV攻击的显著抗性。开发活RSV疫苗的一个障碍是在减毒和免疫原性之间很难达到适宜的平衡，这部分是由于一些减毒病毒的遗传不稳定性，细胞培养中的RSV相对很难生长，以及病毒颗粒的不稳定性。；另外，由天然感染诱导的免疫对以后的感染没有完全的保护作用。这可能由许多因素造成，包括免疫系统在呼吸道腔表面上限制病毒感染的免疫系统相对无效、局部粘膜免疫的短期性质、快速和广泛的病毒复制、在青年人中由于免疫不成熟性而产生的免疫反应降低、由经胎盘衍生的母体血清抗体的免疫抑制，以及所述病毒的特定性质例如G蛋白的高度糖基化。另外，下文还将描述人RSV作为A和B两种抗原亚型存在，抗一个亚型的免疫会降低抗另一亚型的效果。尽管在一生中RSV可再感染多次，但由于以前感染诱导的保护性免疫使得再感染的严重性通常会降低，因此，免疫预防是可行的。经鼻内施用活减毒RSV疫苗以启动中等程度的免疫感染。这与胃肠外途径相比既简单又安全。还提供了直接刺激局部呼吸道免疫，其在针对RSV的抗性中起主要作用。这样还消除了RSV-特异性母体衍生的血清抗体(常见于很小的婴儿体内)的免疫抑制作用。另外，尽管胃肠外施用RSV抗原有时能产生免疫病理学并发症(Murphy等，疫苗8(5)497-502，1990)，这在用活病毒时从未观察到。在60年代中期检测了福尔马林灭活的病毒疫苗对RSV的作用，但所述病毒疫苗不能抵御RSV感染或疾病，而且实际上随后的病毒感染还加剧了症状。(Kim等，Am.J.Epidemiol.，89422-434，1969；Chin等，Am J.Epidemiol.，89449-463，1969；Kapikian等，Am.J.Epidemiol.，89405-421，1969)。最近RSV疫苗的开发集中在减毒RSV突变株。Friedewald等(J.Amer.Med.Assoc.204690-694，1968)报道了冷传代的RSV突变株(cpRSV)，该突变株似乎是足够减毒的，可以作为候选疫苗。该突变株与野生型(wt)亲本病毒相比，在26℃生长效率有所提高，但其复制既不是温度敏感型的，也不是显著冷适应型的。但是所述冷传代的突变株对于成年人是减毒的。尽管对以前已感染过RSV的婴儿和儿童(即血清反应阳性个体)有令人满意的减毒和免疫原性，但cpRSV突变株对血清反应阴性婴儿的上呼吸道保留了低水平毒力。
相似地，Gharpure等(J.Virol.3414-421，1969)报道了分离同样有前途作为疫苗候选对象的温度敏感型RSV(tsRSV)突变株。在实验室和自愿者中广泛地评估了一个突变株，ts-1。该突变株在成人自愿者中产生无症状感染，并在免疫后45天赋予对野生型病毒攻击的抗性。另外，尽管血清反应阳性婴儿和儿童经历了无症状感染，但血清反应阴性婴儿却产生鼻炎和其他轻微症状。此外，检测到ts表型不稳定。尽管表现部分或完全丧失稳定敏感型的病毒代表了一小部分可从疫苗回收的病毒，但其与轻微鼻炎以外的疾病症状无关。
这些及其他研究表明某些冷传代和稳定敏感型RSV菌株是减毒不够的，会在某些疫苗接种者，特别是血清反应阴性婴儿中引起轻微的疾病症状，而其他的是减毒过度的，因此不能充分复制以便引发保护性免疫反应，(Wright等，Infect.Immun.，37397-400，1982)。此外，候选疫苗突变株的遗传不稳定性导致丧失了其温度敏感型表型，进一步阻碍了开发有效的RSV疫苗。通常参见(Hodes等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.1451158-1164，1974；McIntosh等，Pediatr.Res.8689-696，1974；和Belshe等，J.Med.Virol.，3101-110，1978)。
作为另一种活减毒RSV疫苗，研究人员还用纯化的RSV包膜糖蛋白检测了亚单位疫苗候选物。在棉鼠肺中所述糖蛋白诱导对RS病毒感染的抗性，(Walsh等，J.Infect.Dis.1551198--1204，1987)，但所述抗体有很弱的中和抗性，而且用纯化的亚单位疫苗免疫啮齿动物会产生疾病增强作用(Murphy等，Vaccine 8497-502，1990)。
另外还探究了表达F或G包膜糖蛋白的重组牛痘病毒疫苗。这些重组体表达不能区别于真正病毒对应物的RSV糖蛋白，用牛痘-RSV F和G重组体皮内感染的啮齿动物会产生高水平的能中和病毒感染力的特异性抗体。事实上，用牛痘-F重组体感染棉鼠在下呼吸道中刺激了几乎对复制RSV的完全抗性以及在上呼吸道中的显著抗性。(Olmsted等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 837462-7466，1986)。但是，用牛痘-F和-G重组体免疫黑猩猩对在上呼吸道的RSV攻击几乎没有保护作用(Collins等，Vaccine 8164-168，1990)，而且在下呼吸道只有易变的保护作用(Crowe等，Vaccine 111395-1404，1993)。
尽管尽了许多努力去开发有效的RSV疫苗，但迄今为止经注册许可的疫苗还未得到批准。以前方法未完成的愿望使得不需要采用新的策略来开发RSV疫苗，具体地说是操作重组RSV以掺入遗传改变在活减毒RSV重组体中产生新表型的方法。但是迄今为止，操作RSV的基因组RNA和其他非区段的负义RNA病毒证明是困难的。这方面主要障碍包括这些病毒裸基因组RNA的非感染性、在组织培养中病毒生长不足、长复制循环、病毒体的不稳定性、复杂的基因组以及基因产物的难以改变的结构。
重组DNA技术使得从cDNA中回收感染性非区段的负链RNA病毒成为可能，以便遗传操作病毒纯系构建新的疫苗候选株，并迅速评估在减毒水平和表型稳定性(有关综述参见Conzelmann，J.Gen.Virol.77381-89，1996；Palese等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9311354-58，1996)。在本发明中，包括了感染性呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒(PIV)、狂犬病病毒(RaV)、水泡性口炎病毒(VSV)、麻疹病毒(MeV)、牛瘟病毒和来自存在于实质上的病毒蛋白中编码cDNA的反基因组RNA的Sendai病毒(SeV)(参见例如，Garcin等，EMBO J.146087-6094，1995；Lawson等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.924477-81，1995；Radecke等，EMBO J.145773-5784，1995；Schnell等，EMBO J.134195-203，1994；Whelan等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.928388-92，1995；Hoffman等，J Virol.714272-4277，1997；Pecters等，J.Virol.735001-5009，1999；Kato等，Genes to Cells 1569-579，1996；Roberts等，Virology 247(1)，1-6，1998；Baron等，J Virol.711265-1271，1997；国际公开号WO 97/06270；1995年9月27日提交的美国临时专利申请60/007,083；1996年9月27日提交的美国专利申请08/720,132；1996年7月15日提交的美国临时专利申请60/021,773；1997年5月9日提交的美国临时专利申请60/046,141；1997年5月23日提交的美国临时专利申请60/047,634；1999年11月30日授权的美国专利5,993,824(对应于国际公开号WO 98/02530)；Collins等在1999年4月13日提交的美国专利申请09/291,894；Murphy等在1999年4月13日提交的美国临时专利申请60/129,006；Collins等，Proc Nat.Acad.Sci.USA 9211563-11567，1995；Bukreyev等，J.Virol 706634-41，1996；Juhasz等，J.Virol.71(8)5814-5819，1997；Durbin等，Virology235323-332，1997；He等，Virology 237249-260，1997；Baron等，J.Virol.711265-1271，1997；Whitehead等，Virology 247(2)232-9，1998a；Buchholz等，J.Virol.73251-9，1999；Whitehead等，J.Virol.72(5)4467-4471，1998b；Jin等，Virology 251206-214，1998；及Whitehead等，J.Virol.73(4)3438-3442，1999，和Bukreyev等，Proc Natl Acad Sci USA962367-72，1999，为了所有目的上述各文献均全文在此引用作为参考)。
与人RSV(HRSV)抗原性相关的牛RSV(BRSV)提供了另一种开发用于HRSV活减毒病毒疫苗的方法。在人类中所用的第一个疫苗是被认为是牛源的活牛痘病毒，该疫苗是大约200年前由Jenner开发的，用于控制天花。在继后的2个世纪中，牛痘病毒成功地控制了该疾病，而且在最终根除天花的过程中起到了决定性作用。在疫苗开发的詹纳尔氏方法中，用抗原相关的动物病毒作为人疫苗。已很好适应其天然宿主的动物病毒通常不能在人体中有效复制，因此是减毒的。目前，对有关这种形式宿主范围限制的遗传基础还缺乏彻底理解。病毒在其动物或鸟宿主中的进化导致核苷酸(nt)和氨基酸序列与相关人体病毒中的相应序列具有显著的趋异性。由大量序列差异组成的这种趋异性序列说明了宿主范围减毒表型。在疫苗病毒中具有基于大量序列差异的减毒表型是合乎要求的特性，因为这应有助于在其在人体中复制后动物病毒的减毒表型的稳定性。
最近获得批准的四价轮状病毒是詹纳尔氏方法进行疫苗开发的一个实例，其中发现非人轮状病毒株，恒河猴轮状病毒(RRV)在人体中是减毒的，而且对与其有抗原高度相关性的人血清型3有保护作用(Kapikian等，Adv.Exp.Med.Biol.32759-69，1992，在此引入作为参考)。由于需要能够针对四种人轮状病毒血清型的任一种诱导抗性的多价疫苗，所以通过用基因重配的常规遗传技术，在组织培养中构建三种重排列病毒而改进了詹纳尔氏方法。每种基因重排列病毒含10个RRV基因加上一个编码血清型1、2或4的主要中和抗原(VP7)的人轮状病毒基因。所述意图是制备单个基因取代RRV重排列，所述重排列具有这种猴病毒的减毒特征和人轮状病毒血清型1、2或4的中和特异性。基于猴RRV在人体中的宿主范围限制的所述四价疫苗在婴儿和幼儿中提供了高水平的针对人轮状病毒感染的效力(Perez-Schael等，N.Engl.J.Med.3371181-7，1997，在此引入作为参考)。
但是所述被批准的疫苗在没有母体抗体的较大年龄血清反应阴性婴儿中仍有轻微的反应原性，因此，正在开发基于英国牛轮状病毒株的第二代詹纳尔氏疫苗以取代RRV疫苗。还探索了用詹纳尔氏方法开发用于1型副流感病毒和甲型肝炎病毒的疫苗(Emerson等，J.Infect.Dis.173592-7，1996；Hurwitz等，Vaccine 15，533-40，1997，所述文献在此引入作为参考)。用詹纳尔氏方法用于开发A型流感病毒的活减毒疫苗，但不能生产用于人类的持续减毒的疫苗(Steinhoff等，Journalof Infectious Diseases 1631023-1028，1991，在此引入作为参考)。
基于前面的发展，现在可以从cDNA回收感染性RSV并设计和完成针对RSV克隆子的各种遗传操作以构建新疫苗候选对象。此后，可评估并调整减毒水平和表型稳定性，以及其他所需的表型特征。由此保留的攻击开发广泛多样的可使用的遗传操作菜单，所述遗传操作可单独或与其他类型的遗传操作结合使用，以构建有广泛疫苗应用的感染性的减毒RSV克隆子。在本发明中本领域迫切需要允许进行生产安全有效疫苗的另外工具和方法以缓解由RSV引起的严重的健康问题。令人惊奇的是，本发明通过提供用于构建感染性、减毒RSV疫苗候选对象的其他工具满足了这种需要。
发明概述本发明提供在人和其他哺乳动物中是感染性且减毒的人-牛嵌合呼吸道合胞病毒(RSV)。在相关方面，本发明提供了用于设计和生产减毒的人-牛嵌合RSV的新方法，所述嵌合RSV用于各组合物中以便在对RSV感染敏感的宿主中产生所需的抗RSV免疫反应。在本发明的这些方面中包括新的分离的多核苷酸分子和掺入所述分子的载体，所述分子包括嵌合RSV基因组或反基因组，该基因组或反基因组包括了部分或完整人或牛RSV“背景”基因组或反基因组，这些基因组或反基因组与不同RSV病毒株或亚型病毒的一个或多个异源基因或基因组区段组合或整合。本发明的人-牛嵌合RSV可引发针对特定RSV亚型或病毒株的免疫反应，或者抗多种RSV亚型或病毒株的多特异性反应。还提供了用于设计和生产以减毒的人-牛嵌合RSV为载体插入其他病原体的抗原决定基以产生针对不同目的病原体的所需免疫反应的组合物和方法。本发明还提供了掺入人-牛嵌合RSV用于预防和治疗因RSV和其他病原体引起的感染和疾病的方法和组合物。
本发明的嵌合人-牛RSV是通过重组改造以便掺入来自人和牛RSV病毒株的核苷酸序列，从而产生感染性的嵌合病毒或其亚病毒颗粒。在这种方式中，用重组技术生产候选疫苗病毒以便在对目的病原体易感的哺乳动物宿主，包括人和非人灵长目中，引出抗RSV或另一病原体的免疫反应。
本发明作例征的人-牛嵌合RSV掺入含人和牛多核苷酸序列以及主要核壳(N)蛋白质、核壳磷蛋白(P)、大聚合酶蛋白(L)和RNA聚合酶延长因子的嵌合RSV基因组或反基因组。在各种不同组合中可包括其他RSV蛋白质以提供各种感染性亚病毒颗粒，最多可提供完整的病毒颗粒或含额外的蛋白、抗原决定基或其他组分的病毒颗粒。
本发明的嵌合人-牛RSV包括衍生于或仿造自与不同RSV病毒株或亚型病毒的一个或多个异源基因或基因组区段组合的人或牛RSV病毒株或亚型病毒的部分或完整“背景”RSV基因组或反基因组以形成人-牛嵌合RSV基因组或反基因组。在本发明的特定方面，嵌合RSV掺入与来自人RSV的一个或多个异源基因或基因组区段组合的部分或完整牛RSV背景基因组或反基因组。在本发明的另一方面，嵌合RSV掺入与人RSV的一个或多个异源基因或基因组区段组合的部分或完整牛RSV背景基因组或反基因组。
在作例证的实施方案中，本发明涉及感染性嵌合呼吸道合胞病毒(RSVs)，所述RSVs含有主要的核壳(N)蛋白、核壳磷蛋白(P)、大聚合酶蛋白(L)、RNA聚合酶延长因子，以及与不同RSV的一个或多个异源基因和/或基因组区段组合的人或牛RSV的部分或完整RSV背景基因组或反基因组以形成人-牛嵌合RSV基因组或反基因组。可用于本发明的异源基因和/或基因组区段包括一个或多个RSV NS1、NS2、N、P、M、SH、M2(ORF 1)、M2(ORF2)、L、F或G基因或基因组区段。或者，掺入人-牛嵌合RSV中的异源基因和基因组区段可包括RSV基因组的前导序列、非转录尾区或基因间区或其区段。
在更详细的实施方案中，本发明的人-牛嵌合RSV掺入编码RSVF、G和/或SH糖蛋白或其免疫原性结构域或其表位的一个或多个异源基因和/或基因组区段。或者，人-牛嵌合RSV可掺入含有同时人和牛糖蛋白结构域或免疫原性表位的嵌合糖蛋白。例如通过将编码在适当阅读框架中的糖蛋白胞外结构域的异源基因组区段和编码牛基因组或反基因组中相应糖蛋白的功能剩余部分的基因组区段掺入到牛背景基因组或反基因组中以构建后一种类型的嵌合体，由此所得的嵌合病毒表达功能性的嵌合糖蛋白。
在本发明的其他实施方案中，提供人-牛嵌合RSV，其中通过掺入一个所选的牛基因、基因组区段或多数个基因或基因组区段而使人RSV减毒。在特定的实施方案中，将来自BRSV的所选的异源基因组合共同转移到HRSV背景基因组或反基因组中。从单个的或共同转移的基因组中可选择牛RSV基因包括RSV N、P、NS1、NS2、M2-1和M基因，所述基因在人RSV背景基因组或反基因组中可由来自牛RSV的一个或多个异源基因单个取代或者以任何组合取代以产生减毒的嵌合衍生物。在更详细的方面，用来自牛RSV的相应N和P基因共同取代人RSV的N和P基因。RSV基因组中特定基因间的功能协同性有助于这种共同的基因取代，在基因组中相邻基因对的情况下这样的情形会经常出现。因此，在其他可选择的实施方案中，用来自牛RSV的相应NS1和NS2基因取代人RSV的NS1和NS2基因。在其他实施方案中，用牛RSV的相应基因取代HRSV的M2-1、M2-2和L基因中的两个或多个。对于本发明中需要高水平宿主范围限制的特定疫苗候选株来说，用来自牛RSV的相应N、P、NS1、NS2、M2-1和M基因分别取代每一个人RSV的N、P、NS1、NS2、M2-1和M基因。
在本发明的不同方面，构建人-牛嵌合RSV，其中嵌合基因组或反基因组含有与来自人RSV的一个或多个异源基因和/或基因组区段组合的部分或完整牛RSV背景基因组或反基因组。在特定实施方案中，一个或多个人RSV糖蛋白基因选自F、G和SH或一个或多个编码F、G和/或SH的胞质结构域、跨膜结构域、胞外结构域或免疫原性表位部分的基因组区段，被加到或被替代在部分或完整牛RSV背景基因组或反基因组。例如，可用一个或两个人RSV糖蛋白基因F和G代替在部分牛RSV背景基因组或反基因组中的一个或两个相应F和G糖蛋白基因。在这些和相关的实施方案中，人-牛嵌合基因组或反基因组可掺入来自人RSV的A和B亚型的一个或两个抗原决定基。在更详细的方面，用人RSV糖蛋白基因F和G是同时代替在牛RSV背景基因组或反基因组中的相应F和G糖蛋白基因。在下文实施例中描述的携带这些特征的一个作例证的人-牛嵌合RSV是rBRSV/A2。
本发明的其他人-牛嵌合RSV掺入选自F、G和SH的一个或多个人RSV糖蛋白基因，在与部分或完整牛RSV背景基因组或反基因组内相应基因或基因组区段的野生型基因顺序位置相比更靠近启动子的位置将所述人RSV糖蛋白基因加入或替换。在一个这样的实施方案中，用两个人RSV糖蛋白基因G和F分别在基因顺序位置1和2代替在部分牛RSV背景基因组或反基因组中分别在野生型位置7和8缺失的相应G和F糖蛋白基因。在实施例中描述的携带这些特征的作例证的人-牛嵌合RSV是rBRSV/A2G1F2。
在人-牛嵌合RSV内的共同基因转移还涉及在牛背景基因组或反基因组中导入人抗原基因。在特定的实施方案中，用选自F、G、SH和M的一个或多个人RSV被膜—相关的基因加入或代替在部分或完整牛RSV背景基因组或反基因组内。例如用选自F、G、SH和M的一个或多个人RSV被膜—相关的基因加入或代替在牛RSV背景基因组或反基因组内，其中缺失了一个或多个选自F、G、SH和M的被膜—相关的基因。在更详细的方面，选自定义为人RSV被膜—相关基因F、G和M的一个或多个基因被加入至部分牛RSV背景基因组或反基因组中，其中缺失了被膜—相关基因F、G、SH和M。在下文实施例中所述的携带这些特征的作例证的人-牛嵌合RSV是rBRSV/A2-MGF。
本文所用″RSV基因″通常是指编码mRNA的部分RSV基因组并通常从基因起始(GS)信号上游10个核苷酸处开始，终止于基因终止(GE)信号下游12-13个核苷酸处。用于本发明的10个所述基因是RSV已知的，即NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2和L。文中所用术语″基因″指″翻译读码框″(ORF)。ORF更具体地定义为编码重要RSV蛋白的翻译读码框，这其中11个是目前已知的NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2-1(或者M2(ORF1))、M2-2(或者M2(ORF2))及L。因此，术语″基因″也可以互换地指编码亚基因组RNA的基因组RNA序列，和ORF(后者特别用于例如RSV M2基因的情况下，这里单个mRNA含有编码不同蛋白质的两个重叠ORF)。Collins等，J.Gen.Virol.71301 5-3020，1990；Bermingham和Collins，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9611259-11264，1999；Ahmadian等，EMBO J.192681-2689，2000；Jin等，J.Virol.7474-82，2000(本篇文献在此引入作为参考)。当在相对于启动子位置确定基因位置的上下文中使用术语″基因″时，该术语通常严格指转录基因—起始与基因—终止信号基元范围内的mRNA-编码序列(Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 834594-4598，1986；Kuo等，J.Virol.706892-6901，1996；每篇文献在此引入作为参考)。
″基因组区段″指来自RSV基因组的任何长度的连续核苷酸，它可以是部分ORF、部分基因或基因外区域，或其组合。
部分或完整背景基因组或反基因组通常作为受体骨架或载体，人或牛RSV对应物的异源基因或基因组区段引入其中。来自人或牛RSV对应物的异源基因或基因组区段代表“供体”基因或多核苷酸，这些“供体”基因或多核苷酸与背景基因组或反基因组组合，加入或被替换到其中从而产生与一种或两种起作用的RSV相比表现出新表型特征的嵌合RSV。例如在所选的受体RSV株内加入或代替异源基因或基因组区段与未修饰的受体和/或供体的相应表型相比会导致减毒作用的增强或降低、生长变化、免疫原性改变或另一种所需的表型的改变。
在本发明中可选用作异源插入或加入的基因或基因组区段包括编码NS 1、NS2、N、P、M、SH、M2(ORF 1)、M2(ORF2)、L、F或G蛋白质或其部分的基因或基因组区段。也可考虑调节区，例如基因外前导或非转录尾区。在本发明优选的实施方案中，嵌合RSV掺入编码RSV F、G或SH糖蛋白的一个或多个异源基因。或者，嵌合RSV可掺入编码RSV F、G或SH糖蛋白的胞质结构域、跨膜结构域、胞外结构域或免疫原性表位的基因组区段。这些免疫原性蛋白、结构域和表位在人-牛嵌合RSV中特别有用，因为它们在所免疫的宿主中产生新的免疫反应。具体地说，G和F蛋白、免疫原性结构域和表位在其中提供主要中和和保护性抗原。另外，可将编码非RSV蛋白，例如在流行性腮腺炎和SV5病毒中发现的SH蛋白的基因和基因组区段掺入本发明的人-牛PIV内。调节区例如基因外3′前导或5′非转录尾区以及基因-起始、基因-终止、基因内区域或3′或5′非编码区也可用作异源取代物或加入物。
例如，加入或代替来自人RSV亚型或病毒株的一个或多个免疫原性基因或基因组区段至或在牛受体基因组或反基因组内产生能够抗人供体病毒，包括一种或多种特异性人RSV亚型或病毒株的免疫反应的重组、嵌合病毒或亚病毒颗粒，同时牛骨架赋予减毒表型使所述嵌合体可作为疫苗开发的有用的候选病毒株。在一个作例证的实施方案中，一个或多个人RSV糖蛋白基因F、SH、和/或G被加入或取代部分或完整的牛基因组或反基因组以产生减毒的感染性人-牛嵌合体，所述嵌合体在易感宿主中引发抗人RSV的免疫反应。在其他实施方案中，人-牛嵌合RSV还掺入编码来自多个人RSV病毒株的编码免疫原性蛋白、蛋白结构域或表位的基因组或基因组区段，例如来自RSV亚型A和B的两个F或G蛋白或其免疫原性部分。在其他实施方案中，人-牛嵌合RSV基因组或反基因组编码具有人和牛糖蛋白结构域或免疫原性表位的重组病毒和亚病毒颗粒中的嵌合糖蛋白。例如，可将编码人RSV F、SH或G糖蛋白的糖蛋白胞外结构域的异源基因组区段与编码在背景牛基因组或反基因组中相应牛F、SH或G糖蛋白的糖蛋白胞质结构域和胞外结构域的基因组区段相连。
根据本发明的方法，通过用异源基因或基因组区段取代部分RSV背景基因组或反基因组中的对应基因或基因组区段可构建人-牛嵌合RSV。或者，可将异源基因或基因组区段作为额外的基因或基因组区段与完整(或部分，如果另一基因或基因组区段被缺失)RSV背景基因组或反基因组结合。例如，可包括两个人RSV G或F基因或基因组区段，分别来自RSV A和B亚型。
通常，将异源基因或基因组区段加至部分或完整RSV背景基因组或反基因组的基因间位置。或者，可将基因或基因组区段放在基因组的其他非编码区内，例如放在5′或3′非编码区内或部分或完整基因组或反基因组内发生非编码核苷酸的其他位置内。在一方面，非编码调节区含有有效复制、转录和翻译所需的顺式作用信号，因此代表通过导入本文所公开的异源基因或基因组区段或其他突变而对这些功能进行修饰的靶位点。在本发明更详细的方面，将减毒突变导入顺式作用调节区以产生例如(1)组织特异性减毒作用(Gromeier等，J.Virol.73958-64，1999；Zimmermann等，J.Virol.714145-9，1997)，(2)对干扰素的敏感性增强(Zimmermann等，J.Virol.714145-9，1997)，(3)温度敏感性(Whitehead等，Virology 247232-9，1998)，(4)在复制水平的一般限制(Men等，J.Virol.703930-7，1996；Muster等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 885177-5181，1991)，和/或(5)复制的宿主特异性限制(Cahour等，Virology 20768-76，1995)。可以各种方式例如通过点突变、相关病毒间序列的交换或缺失得到这些减毒突变以产生本发明的减毒人-牛嵌合RSV。
在本发明提供的其他方法中，可以在部分或完整RSV背景基因组或反基因组内对应于相应基因或基因组区段的野生型基因顺序位置上将异源基因或基因组区段加入或替换。在其他实施方案中，在与背景基因组或反基因组内相应基因或基因组区段的野生型基因顺序位置相比更靠近或更远离启动子的位置将异源基因或基因组区段加入或替换以分别提高或降低所述异源基因或基因组区段的表达。
在本发明的一般方面，可将牛基因或基因组区段加入或替换在人RSV背景中以形成减毒的人-牛嵌合RSV。或者所述嵌合体可由一个或多个人基因或基因组区段组成，用该基因或基因组区段加入或替换在牛RSV背景中从而形成减毒的RSV疫苗候选株。在本发明中，嵌合RSV基因组或反基因组是由部分或完整牛RSV背景基因组或反基因组与来自人RSV的异源基因或基因组区段组合形成的。由此形成的嵌合RSV可掺入来自A亚型或B亚型人RSV或来自特定人RSV病毒株的异源基因或基因组区段。在优选的方面，用一个或多个人RSV糖蛋白基因F、G和SH或编码人RSV糖蛋白基因之胞质结构域、跨膜结构域、胞外结构域或免疫原性表位的基因组区段替换牛RSV背景基因组或反基因组内对应的基因或基因组区段。
在作例证的实施方案中，用一个或两个人RSV糖蛋白基因F和G代替牛RSV背景基因组或反基因组内一个或两个对应的F和G糖蛋白基因。在下文所述的具体实施例中，同时用人RSV糖蛋白基因F和G替换牛RSV背景基因组或反基因组中对应的F和G糖蛋白基因。在平行的方式中，可很容易地设计本发明的嵌合人-牛RSV以掺入来自不同RSV病毒株或亚型，例如A和B亚型人RSV两者的抗原决定基。
在本发明的其他方面，通过导入体现所得病毒或亚病毒颗粒的减毒表型的一个或多个减毒突变进一步修饰嵌合基因组或反基因组，从而生产减毒的人-牛嵌合RSV。可根据常规设计诱变策略重新产生并这些减毒突变并检测减毒效果。或者在现有的生物学衍生的突变RSV中鉴定减毒突变，然后掺入到本发明的人-牛嵌合RSV中。
本发明提供了用于使抗RSV和其他病原体的活病毒疫苗减毒的新基础，所述减毒作用部分是基于宿主范围作用。早期的研究涉及用来自HRSV(44个核苷酸)的对应序列调换BRSV(45个核苷酸)的外前导区(Buchholz等，J.Virol.73251-259，1999)。这两个序列均不编码蛋白质，也没有观察到显著的表型效果。本发明通过在HRSV和BRSV间导入基因组区段、完整基因或多基因而提供了减毒的嵌合RSV。
通过HRSV在黑猩猩中的高度自由生长，而BRSV在相同动物中几乎没有可检测的或检测不到生长举例说明了HRSV和BRSV间所宿主范围差异。黑猩猩是一种广泛接受的和可靠的在人类中RSV感染和免疫原性模型，表现出与人类似病毒复制和疾病。如下文说明，在黑猩猩中观察到的嵌合RSV的宿主范围差异与在细胞培养中观察到的宿主范围差异相关，从而提供了方便的初步检测。
在本发明嵌合人-牛RSV中观察到的宿主范围作用通常与HRSV和BRSV间观察到的核苷酸和氨基酸序列差异有关。例如，HRSV和BRSV在下列各蛋白质间的氨基酸同一性百分比是NS1(69％)、NS2(84％)、N(93％)、P(81％)、M(89％)、SH(38％)、G(30％)、F(81％)、M2-1(80％)、L(77％)。由于HRSV和BRSV间的广泛遗传差异(用BRSVN基因代替HRSV的N基因，例如涉及约26个氨基酸的差异)，本发明的嵌合牛-人RSV是特别有用的疫苗候选株。如下文举证说明，用HRSV的G和F糖蛋白代替BRSV的G和F糖蛋白提高了重组BRSV在黑猩猩中的复制许可度(permissivity)。各赋予多氨基酸或核苷酸差异的多基因和基因组区段的介入提供了广泛的减毒基础，这对回复突变是高度稳定的。这种减毒模式与通过一个或数个点突变使HRSV病毒减毒的模式明显相反，其中单个突变的回复将产生显著或完全的毒力再获得。另外，在HRSV中的已知减毒点突变通常产生温度敏感型表型。这是因为温度敏感的表型特异性地用作第一次筛选以鉴定HRSV暴露于诱变剂后改变的子代。与温度敏感性相关的有关减毒的问题是在下呼吸道中可过度限制病毒的复制，而在上呼吸道中是减毒不足的。这是因为在呼吸道内有温度梯度，在下呼吸道温度更高(较高限制性)，而在上呼吸道温度较低(较低限制性)。减毒病毒在上呼吸道中复制的能力可导致包括充血、鼻炎、发烧和中耳炎的并发症。因此，仅通过温度敏感型突变获得减毒不理想。相反，在本发明人-牛嵌合RSV中存在的宿主范围突变在大多数情况下不会赋予温度敏感性。因此，所述新的减毒方法将(i)是遗传和表型上更稳定的，和(ii)与其他活疫苗方法相比，与在上呼吸道中残留毒力有关的可能性更低。
结合在本发明人-牛嵌合RSV中提供的宿主范围表型作用，通常合乎要求的是通过导入另外的突变来提高或降低嵌合病毒减毒作用，从而调整减毒表型。因此，通过掺入至少一个，优选2个或多个不同减毒突变，例如从一组已知生物学衍生的突变RSV病毒株中鉴定的突变，可进一步使候选疫苗病毒株减毒。优选的人突变RSV病毒株是冷传代的(cp)和/或温度敏感型(ts)突变体，例如命名为″cpts RSV 248(ATCC VR 2450)、cpts RSV 248/404(ATCC VR 2454)、cpts RSV 248/955(ATCC VR 2453)、cpts RSV 530(ATCC VR 2452)、cpts RSV 530/1009(ATCC VR 2451)、cpts RSV 530/1030(ATCC VR 2455)、RSV B-1cp52/2B5(ATCC VR 2542)和RSV B-1 cp-23(ATCC VR 2579)″的突变体(均是根据布达佩斯条约保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 University Boulevard，Manassas，Virginia 20110-2209，U.S.A.，并获得了上述鉴定的保藏号)。从这组作例证的生物学衍生的突变体中，提供了减毒突变的大″菜单″，这些突变可分别与该组内的任何其他突变组合以校准用于疫苗的重组体人-牛嵌合RSV的减毒水平。其他突变可衍生于例如在小噬菌斑(sp)、冷适应的(ca)或宿主范围限制的(hr)突变病毒株中鉴定的有非-ts和非-cp减毒突变的RSV。可将突变掺入在人或牛反基因组序列中，而且可将在人、牛或其他RSV突变体中鉴定的减毒突变，通过将所述突变作图到受体基因组中的相应、同源位点，并将受体天然序列突变成突变基因型(通过相同或保守突变)，转移到异源RSV受体(例如分别为牛或人RSV)中，这些可按1999年4月13日由Murphy等申请的美国临时专利申请60/129,006所述完成，在此引入作为参考。
设计和筛选的用于疫苗的人-牛嵌合RSV通常含有至少2个，有时3个或更多个减毒突变以达到具有广泛临床应用的令人满意的减毒水平。在一实施方案中，在RSV聚合酶基因L(在供体或受体基因中)发生至少一个减毒突变，并涉及在决定减毒表型的聚合酶蛋白中体现氨基酸改变的一个或多个核苷酸替代，这种减毒表型可以或不可以涉及温度敏感型(ts)表型。本发明的嵌合RSV除L外，例如在M2基因中，还可在任何其他RSV基因中掺入减毒突变。但是在本发明优选人-牛嵌合RSV在大聚合酶基因L中掺入一个或多个核苷酸替代，从而导致在RSV聚合酶基因L中在氨基酸Asn43、Cys319、Phe 521、Gln831、Metl169、Tyr1321和/或His 1690产生氨基酸改变，例如在例证中Ile替换Asn43、Leu替换Phe521、Leu替换Gln831、Val替换Metl169和Asn替换Tyrl321。在这些位置的其他氨基酸改变，就所鉴定的突变残基而言是特别保守的改变，当然可进行以产生与所鉴定的突变替换相似的作用。为掺入到本发明人-牛嵌合RSV的其他合乎要求的突变包括在在RSV N基因中Val267、在RSV F基因中Glu218和/或Thr523具体说明氨基酸替换的减毒突变以及在M2基因的基因起始序列中的核苷酸替换。本文所鉴定的一个或多个减毒突变的任何组合，最多达和包括全部这些突变均可掺入在人-牛嵌合RSV中以产生适宜地减毒的重组病毒，用于疫苗受体的所筛选种群或广泛的种群。
用于掺入到本发明人-牛嵌合RSV中的减毒突变可被选在供体或受体RSV基因的编码部分或者非编码区例如顺调节序列。作例证的非编码突变包括在基因起始序列中的单个或多碱基改变，例如例证中在M2基因起始序列中核苷酸7605(在重组序列中核苷酸7606)中的单个或多碱基替换。
本发明的感染性嵌合RSV可掺入异源的编码或非编码核苷酸序列，这些序列来自任何RSV或RSV样病毒，例如人、牛、鼠(小鼠肺炎病毒)或鸟(火鸡鼻气管炎病毒)肺炎病毒或者来自另一个被膜病毒例如副流感病毒(PIV)。作例证的异源序列包括在人-牛嵌合RSV中来自一种人RSV病毒株的RSV序列与来自不同人RSV病毒株的序列的组合。例如，本发明的嵌合RSV可掺入来自2个或多个野生型或突变RSV病毒株，例如选自cpts RSV 248、cpts 248/404、cpts 248/955、cpts RSV 530、cpts 530/1009或cpts 530/1030的突变株。或者，人-牛嵌合RSV可掺入来自2个或多个野生型或突变人RSV亚型的序列，例如人RSV A亚型与B亚型序列的组合。在其他方面，用来自异源RSV和非RSV病毒的对应序列，单独或所选减毒突变的一个或多个组合，例如cp和/或ts突变，取代一个或多个人RSV编码或非编码多核苷酸以产生新型减毒的疫苗病毒株。
掺入在本发明嵌合cDNAs、载体和病毒颗粒中的突变可以是单个或者组合导入全长人-牛嵌合RSV cDNA，含所导入突变的获救病毒的表型很容易测定。在作例证的实施方案中，氨基酸改变由减毒的、生物学衍生的病毒对野生型RSV展现出来。例如由cpRSV或tsRSV表现的改变可以组合的方式掺入重组人-牛嵌合RSV中以达到所需的减毒水平。
在本发明的其他方面，可很容易地将嵌合人-牛RSV设计为″载体″以掺入抗原决定基，这些抗原决定基来自不同病原体，包括不同RSV病毒株或类(例如人RSV A和RSV B亚型)、包括HPIV3、HPIV2和HPIV1的人副流感病毒(HPIV)、麻疹病毒以及其他病原体(参见例如美国临时专利申请序列号60/170,195；美国专利申请号09/458,813；以及美国专利申请号09/459,062，每篇文献在此引入作为参考)。在不同实施方案中，牛-人嵌合基因组或反基因组含有部分或完整RSV“载体基因组或反基因组”，该载体基因组或反基因组与一个或多个异源基因或基因组区段相组合，该异源基因或基因组区段编码一个或多个异源病原体的一个或多个抗原决定基。异源病原体可以是异源RSV(即不同病毒株或亚型的RSV)，而且所述异源基因或基因组区段可编码RSV NS1、NS2、N、P、M、SH、M2(ORF 1)、M2(ORF2)、L、F或G蛋白质或其片段(例如免疫原性结构域或表位)。例如，载体基因组或反基因组可以是部分或完整RSV A基因组或反基因组，而且所述异源基因或基因组区段可编码RSV B亚型病毒的抗原决定基。
在其他实施方案中，人-牛嵌合RSV载体基因组或反基因组可以是部分或完整BRSV基因组或反基因组，而且编码抗原决定基的异源基因或基因组区段是一个或多个HRSV。例如，部分或完整BRSV基因组或反基因组中可掺入一个或多个编码一个或多个选自F、G和SH的HRSV糖蛋白基因的基因或基因组区段，或者一个或多个编码HRSVF、G和/或SH的胞质结构域、跨膜结构域、胞外结构域或免疫原性表位的基因组区段。
在其他实施方案中，用于携带异源抗原决定基的设计为“载体”的人-牛嵌合RSV中掺入非RSV病原体例如人副流感病毒(HPIV)的一个或多个抗原决定基。在一个作例证的实施方案中，将编码一个或多个HN和/或F糖蛋白或抗原结构域或其片段或表位的一个或多个HPIV1、HPIV2或HPIV3基因或基因组区段加入或掺入至部分或完整HRSV载体基因组或反基因组内。在更详细的实施方案中，将含HPIV1、HPIV2或HPIV3 HN或F基因的读码框(ORF)的转录单位加入或掺入嵌合HRSV载体基因组或反基因组中。
在其他可选择的实施方案中，载体基因组或反基因组含有部分或完整HRSV或BRSV基因组或反基因组，而且异源病原体选自麻疹病毒、A和B亚型呼吸道合胞病毒、流行性腮腺炎病毒、人乳头瘤病毒、1型和2型人免疫缺陷型病毒、单纯性疱疹病毒、巨细胞病毒、狂犬病病毒、EB病毒、线状病毒、布尼亚病毒、黄热病病毒、虫传病毒和流感病毒。以此候选病原体的作例证目录为基础，所选的异源抗原决定基可选自麻疹病毒HA和F蛋白质，A和B亚型呼吸道合胞病毒F、G、SH和M2蛋白质，流行性腮腺炎病毒HN和F蛋白质，人乳头瘤病毒LI蛋白质，1型或2型人免疫缺陷型病毒gp160蛋白，单纯性疱疹病毒和巨细胞病毒gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gJ、gK、gL及gM蛋白，狂犬病病毒G蛋白，EB病毒gp350蛋白；线状病毒G蛋白，布尼亚病毒G蛋白，黄热病病毒E和NS 1蛋白，以及虫传病毒E蛋白，和其抗原结构域、片段和表位。在一实施方案中，异源病原体是麻疹病毒，而异源抗原决定基选自麻疹病毒HA和F蛋白及其抗原结构域、片段和表位。为了获得所述嵌合构建体，可将含麻疹病毒HA基因的读码框(ORF)的转录单位加入或掺入HRSV载体基因组或反基因组内。
本发明提供人-牛嵌合RSV克隆、多核苷酸表达构建体(也称为载体)以及颗粒，这些可掺入到以所选的组合导入嵌合基因组或反基因组中的多表型—特异性突变中，从而产生减毒的感染性病毒或亚病毒颗粒。与常规表型评估联用的该方法提供了具有如减毒、温度敏感性、改变的免疫原性、冷适应性、小噬菌斑、宿主范围限制等所需特征的人-牛嵌合RSV。将由此鉴定的突变编辑到″菜单″中，然后导入不同的组合以校准疫苗病毒达到所选的减毒水平、免疫原性和稳定性。
在本发明的其他方面，构建含有或不含有减毒突变的人-牛嵌合RSV，以使其具有核苷酸修饰，从而产生所需的表型、结构或功能改变。通常，所选的核苷酸修饰将确定表型改变，例如在生长特征、减毒、温度敏感性、冷—适应性、噬菌斑大小、宿主范围限制或免疫原性方面的改变。在本发明中结构改变包括为便于操作和鉴定，将限制位点导入或切除编码CDNAs的RSV中。
在优选的实施方案中，人-牛嵌合RSV的核苷酸改变包括通过缺失基因或切除其表达来修饰病毒基因。在本发明中用于突变的靶基因包括吸附(G)蛋白、融合(F)蛋白、小疏水(SH)、RNA结合蛋白(N)、磷蛋白(P)、大聚合酶蛋白(L)、转录延长因子(M2 ORF 1)、RNA调节因子M2 ORF2、基质(M)蛋白以及两个非结构蛋白NS 1和NS2。可将这些蛋白质中的每一个，全部或部分、单独或与其他所需的修饰结合，选择性地缺失、替换或重排以获得新的嵌合RSV重组体。
在本发明的一个方面，在人-牛嵌合RSV中修饰SH、NS1、NS2、G或M2-2基因。例如，可将这些基因中的每一个缺失或除去其表达(例如通过导入终止密码子)以改变所得人-牛嵌合RSV克隆的表型，从而提高生长、减毒、免疫原性或其他所需的表型特征。例如在重组基因组或反基因组的背景或异源(即分别为受体或供体)部分缺失SH基因，将会产生具有新表型特征，例如体外生长提高和/或体内减毒的嵌合RSV。在相关方面，在人-牛嵌合RSV中，单独或与一个或多个具体说明减毒表型的不同突变组合，例如，直接采纳(或者以修饰的形式，例如通过在确定所述突变的密码子中导入多核苷酸改变)自生物学衍生的减毒RSV突变体的点突变，来构建SH基因缺失，或者缺失另一所选的非必需基因或基因组区段的缺失，例如NS1、NS2、G或M2-2基因缺失。例如可缺失SH、NS1、NS2、G或M2-2基因组合一个或多个采纳自cpts248/404、cpts530/1009、cpts530/1030或另一所选突变RSV病毒株的cp和/或ts突变，以产生嵌合RSV，所述嵌合RSV具有因不同突变的组合作用而产生的来自减毒表型的病毒产率增加、减毒作用增强、免疫原性提高以及对回复的遗传抗性改善。
可选择的核苷酸修饰包括在人-牛嵌合体中缺失、插入、增加或重排所选基因的顺式作用调节序列。在一实施例中，将一RSV基因的顺式作用调节序列改变成相应的异源调节序列，它可以是不同RSV中相同基因的对应顺式作用调节序列或不同RSV基因的顺式作用调节序列。例如，通过转变或替换成在相同RSV病毒株中不同基因的基因终止信号可修饰基因终止信号。在其他实施方案中，核苷酸修饰可在嵌合基因组或反基因组内包括插入、缺失、替换或重排翻译起始位点，例如以便切除所选蛋白质形式的其他翻译起始位点。在一实施例中，切除了RSV G蛋白质的分泌形式的翻译起始位点以修饰这种形式的G蛋白的表达，由此产生所需的体内效果。
另外，在人-牛嵌合RSV基因组或反基因组中可单独或与一种或多种采纳自生物学衍生的突变RSV的减毒突变一起产生多种其他的遗传改变。例如，可全部或部分插入来自非RSV源的基因或基因组区段。或者，改变基因的顺序、除去基因重叠或者用其反基因组对应物替换RSV基因组启动子。在嵌合基因组或反基因组中可进行不同的或另外的修饰以便有利于操作，例如在不同基因间区域(例如在G和F基因间的特有StuI位点)或在别处插入特有的限制位点。可除去非翻译基因序列以提高插入的外源序列的能力。在其他方面，能修饰编码嵌合RSV基因组或反基因组的多核苷酸分子或载体以编码非-RSV序列，例如细胞因子、T辅助细胞表位、限制位点标记或者一种能够在所需宿主中引发保护性免疫反应的微生物病原体(例如病毒、细菌或真菌蛋白。在一所述实施方案中，构建掺入了副流感病毒(PIV)的基因或基因组区段，例如PIV HN或F糖蛋白或其免疫原性结构域或表位的人-牛嵌合RSV。
在人-牛嵌合RSV基因组或反基因组内的所有前述修饰，包括产生点突变的核苷酸插入、重排、缺失或替换、点特异性核苷酸改变以及包含整个基因或基因组区段的改变均可用于异源供体基因或基因组区段或者受体背景基因组或反基因组。在每种情况中，这些改变优选将确定在所得重组RSV中的一个或多个表型改变，例如导致减毒、温度敏感性、冷适应性、小噬菌斑、宿主范围限制、基因表达改变或免疫原性表位改变的表型改变。
在本发明的另一方面，提供了生产分离的感染性人-牛嵌合RSV的组合物(例如掺入了RSV-编码cDNA的分离的多核苷酸和载体)和方法。用这些组合物和方法，从与核壳(N)蛋白质、核壳磷蛋白(P)、大(L)聚合酶蛋白以及RNA聚合酶延长因子共表达的人-牛嵌合RSV基因组或反基因组中产生感染性嵌合RSV颗粒或亚病毒颗粒。在本发明的相关方面，提供了用于将前述结构和表型改变导入重组人-牛嵌合RSV的组合物和方法以产生感染性的减毒疫苗病毒。
在一实施方案中，提供了含有编码人-牛嵌合RSV基因组或反基因组的经分离的多核苷酸分子的表达载体。还提供了相同或不同的表达载体，该载体含有一个或多个编码N、P、L和RNA聚合酶延长因子蛋白的经分离的多核苷酸分子。然后可从所述基因组或反基因组cDNA中直接表达蛋白质。该载体在细胞或无细胞溶解产物中优先表达或共表达，由此产生感染性人-牛嵌合RSV颗粒或亚病毒颗粒。
通过相同或不同的表达载体可共表达RSV基因组或反基因组和N、P、L和RNA聚合酶延长因子(优选RSV的M2(ORF1)的产物)蛋白。在某些情况下，N、P、L和RNA聚合酶延长因子蛋白是各自被不同的表达载体编码。编码人-牛嵌合RSV基因组或反基因组的多核苷酸分子是可操作相连的人和牛多核苷酸序列的嵌合体，以便由此可生产感染性病毒或病毒颗粒。在本发明其他方面，人-牛嵌合RSV基因组或反基因组可包括来自多种人RSV病毒株或亚型(A和B)的序列以及其他非人(例如鼠)RSV序列。在其他方面，人-牛嵌合RSV基因组或反基因组可掺入非-RSV序列，例如含有与编码PIV或另一负链RNA病毒的点突变、蛋白质、蛋白质结构域或免疫原性表位可操作相连的人和牛RSV的序列的多核苷酸。
用于生产人-牛嵌合RSV的上述方法和组合物产生感染性病毒或亚病毒颗粒，或其衍生物。感染性病毒类似真正的RSV病毒颗粒是感染性的。它可以直接感染新鲜细胞。感染性亚病毒颗粒通常是在适宜条件下可引起感染的病毒颗粒的亚组分。例如，含基因组或反基因组RNA和N、P、L和M2(ORF 1)蛋白质的核壳就是亚病毒颗粒的实例，如果导入到细胞胞质中它可引起感染。本发明中提供的亚病毒颗粒包括缺少对感染性非必需的一种或多种蛋白质、蛋白质片段或其他病毒组分的病毒颗粒。
在其他实施方案中，本发明提供含表达载体的细胞或无细胞溶解产物，一种表达载体含有编码上述人-牛嵌合RSV基因组或反基因组的分离的多核苷酸分子，和另一种表达载体(相同或不同载体)还可含有一个或多个编码RSV N、P、L和RNA聚合酶延长因子蛋白的分离的多核苷酸分子。还可从基因组或反基因组cDNA中表达这些蛋白质中的一种或多种。表达后，基因组或反基因组与N、P、L和RNA聚合酶延长因子蛋白组合产生感染性人-牛嵌合RSV病毒或亚病毒颗粒。
本发明减毒的人-牛嵌合RSV能够在所感染的人宿主中引发有效的免疫反应，该嵌合RSV还是充分减毒的以便在所免疫的宿主中不会引起不可接受的严重呼吸疾病症状。所述减毒嵌合病毒或亚病毒颗粒可存在于细胞培养上清液中，从培养液中分离，或者部分或完整纯化。还可将所述病毒冻干，与各种其他组分组合便于按需要贮存或传递给宿主。
本发明进一步提供了含生理学可接受载体和/或佐剂以及分离的减毒人-牛嵌合RSV的新疫苗。在一实施方案中，所述疫苗由含有至少一种，优选两种或多种上述减毒突变或其他核苷酸修饰的人-牛嵌合RSV组成。可将所述疫苗配制成103-106剂量PFU的减毒病毒。所述疫苗可含有引发针对一种RSV病毒株或抗原亚型，例如A或B或者针对多种RSV病毒株或亚型的免疫反应的减毒嵌合病毒。就此而言，本发明的人-牛嵌合RSV可单独引发非特异性免疫反应或者针对多种RSV病毒株或亚型的多特异性免疫反应。可将人-牛嵌合RSV与其他具有不同免疫原性特征的嵌合RSV或非嵌合RSV组合在疫苗制剂中以便产生针对一种或多种RSV病毒株或亚型的更有效的保护作用。
在相关方面，本发明提供了在哺乳动物中刺激个体的免疫系统以引发针对一种或多种RSV病毒株或亚型的免疫反应的方法。该方法包括在生理学可接受载体和/或佐剂中施用免疫学足够剂量的减毒、人-牛嵌合RSV的制剂。在一个实施方案中，免疫原性组合物是由人-牛嵌合RSV组成的疫苗，该嵌合RSV含有上述至少一个，优选2个或多个减毒突变或具体说明所需表型的其他核苷酸修饰。可将所述疫苗配制成103-106剂量PFU的减毒病毒。该疫苗可含有引发针对一种RSV病毒株或抗原亚型，例如A或B，或者针对多种RSV病毒株或亚型的免疫反应的减毒人-牛嵌合RSV病毒。在本发明中，人-牛嵌合RSV可引发单特异性免疫反应或者针对多种RSV病毒株或亚型的多特异性免疫反应。或者可将具有不同免疫原性特征的人-牛嵌合RSV组合在疫苗混合物中或者以协调的治疗方式分别施用以便引发针对一种RSV病毒株，或针对多种RSV病毒株或亚型的更有效的保护作用。优选将免疫原性组合物施用到上呼吸道，例如通过喷雾、小滴或气雾剂。通常，可将组合物施用给RSV抗体血清反应阴性的个体或者具有经胎盘针对RSV获得的母体抗体的个体。
附图简述

图1A和1B描述了用人RSV(HRSV)病毒株A2的G和F基因替换重组(r)牛RSV(BRSV)病毒株ATue51908的G和F基因以产生重组嵌合病毒rBRSV/A2。
图1A是rBRSV的基因组图，说明用HRSV的F和G基因替换F和G基因。读码框(ORFs)的位置用阴影(BRSV)或空白(HRSV)长方形表示。G和F基因为扩展部分，其中基因终止/多腺苷酸化信号由棒形表示，基因起始信号为实心三角，作为遗传标记或作为替换的限制片段边界的合成限制位点的位置由箭头与下方所示的在完整反基因组序列中的位置一起表示。括号中表示由标记限制位点构成的片段大小。左侧表示重组病毒的基因组长度。罗马数字(I、II和III)指图1B中展开的基因间区域。
图1B说明生物学衍生的BRSV病毒株ATue51908(顶线)的SH/G(I)、G/F(II)和F/M2(III)基因间区域的排列；重组版本rBRSVATue51908(第二条线)、重组嵌合病毒rBRSV/A2(第三条线)和生物学衍生的HRSV病毒株A2(底线)。图1B，I组SH/G基因间区域ATue51908(顶线)(SEQ ID NO1)；rBRSV(第二条线)(SEQ ID NO2)；rBRSV/A2(第三条线)(SEQ ID NO3)；HRSV病毒株A2(底线)(SEQID NO4)。图1B，II组G/F基因间区域ATue 51908(顶线)(SEQ IDNO5)；rBRSV(第二条线)(SEQ ID NO6)；rBRSV/A2(第三条线)(SEQID NO7)；HRSV A2(底线)(SEQ ID NO8)。图1B，3组F/M2基因间区域ATue51908(顶线)(SEQ ID NO9)；rBRSV(第二条线)(SEQID NO10)；rBRSV/A2(第三条线)(SEQ ID NO11)；HRSV A2(SEQID NO12)。将序列表示为DNA正链。缺口用点表示，基因起始和基因终止信号用阴影表示，翻译起始密码子用黑体字表示。斜条纹标记表示核苷酸同一性。通过将识别序列划为阴影来表示限制位点。Orf是读码框。数字指基因组位置(对于BRSV，病毒株ATue51908GenBank登记号为AF092942；对于HRSV病毒株A2GenBank登记号为M74568)。
图2A-2C说明在生物学衍生的BRSV(ATue51908)；其重组版本rBRSV、和重组嵌合体rBRSV-A2的基因组中的标记限制位点。用所示的病毒感染BSR T7/5细胞的总RNA完成RT-PCR。对PCR产物进行限制分析，然后在2％(图2A，2B)或3％琼脂糖凝胶(图2C)上分析。以计算的大小估计核苷酸长度。在所有情况下，当省略了RT步骤时就不用检测PCR产物。标记为梯度1kb的DNA(Life Technologies，Gaithersburg，Maryland)。一些标记片段的大小显示在右侧。
图2A表示对应于位置3612-4886(ATue51908和rBRSV)或位置3612-4885(rBRSV/A2)和包含在重组病毒分离物的SH/G基因间区域中的SalI位点(位置4673)的RT-PCR产物分析。用SalI消化对应于预测大小约为1,273-1,274bp的PCR产物。酶切消化不会切开生物学衍生的ATue51908，因它缺乏一种导入的位点，而对于重组病毒，酶切消化会产生1,061bp(两种病毒)和213bp(rBRSV)或212bp(rBRSV/A2)的带。
图2B表示对应于位置5372-5964(ATue51908和rBRSV)或位置5452-6062(rBRSV/A2)的，含重组病毒中的G/F基因间区域和相应标记限制位点(在rBRSV位置5539的SphI位点或者在rBRSV-A2位置5619的StuI位点)的RT-PCR产物的分析。PCR产物的预期大小约为592(ATue51908和rBRSV)或610(rBRSV/A2)。按照预测，SphI仅消化rBRSV，产生425bp和167bp的片段；而StuI仅消化rBRSV/A2，产生443bp和167bp的片段。
图2C表示跨位置7218-7852(ATue51908和rBRSV)或7316-7939(rBRSV/A2)的，含F/M2基因间区域的RT-PCR产物的分析。按照预测，用Xhol消化不会切开ATue51908，但在rBRSV和rBRSV/A2的情况下，产生395bp(两种病毒)和267bp(rBRSV)或256 bp(rBRSV/A2)的片段。这表明在重组病毒的基因组中存在导入的Xhol位点(rBRSV位置7471，rBRSV-A2位置7558)。
图3表明在人HEp-2细胞(A组)和牛MDBK细胞(B组)中rBRSV、rBRSV/A2和HRSV病毒株Long的生长比较。用MOI为0.1的任一种病毒感染两份在24孔平板中的细胞单层。在所标明的时间取上清液样品，在-70℃冷冻，然后一式两份滴定。每个值是来自两个孔的感染细胞的平均滴度。
图4A提供了选用戊二醛固定，再用免疫金标记并负染的(一般观察和放大)重组BRSV的病毒体的电子显微镜检查。图4B提供了在超薄切片中检测的病毒体的电子显微镜检查。通过制备技术保存在病毒体表面上的长丝状病毒体形状和抗原表位。(图4A棒2μ，放大棒100nm，图4B棒150nm.)。
图5表示利用单克隆抗体与HRSV F和BRSV F蛋白(A、C和E组)或仅仅与HRSV F蛋白(B、D和F组)反应的免疫金标记。rBRSV(A和B组)、rBRSV/A2(C和D组)以及HRSV病毒株Long(E和F组)的制备物标记。棒150nm。
图6表示利用单克隆抗体与BRSV G蛋白质(A、C和E组)或HRSVG蛋白(B、D和F组)反应的免疫金标记。rBRSV(A和B组)、rBRSV/A2(C和D组)以及HRSV病毒株Long(E和F组)的制备物标记。棒150nm。
图7A和7B描述了用HRSV病毒株Long的F基因替换rBRSV病毒株ATue51908的F基因以产生重组嵌合病毒rBRSV/LongF。
图7A是rBRSV基因组的示意图，表示用HRSV病毒株Long的F基因替换F基因。读码框(ORFs)的位置用阴影(BRSV)或空白长方形(HRSV)表示。将F基因放大表示，其中基因终止/多腺苷酸化信号用棒表示，基因起始信号用实心三角表示，作为遗传标记或作为替换的限制片段边界的合成限制位点的位置由箭头与下方所示的在完整反基因组序列中的位置一起表示。括号中表示由标记限制位点构成的片段大小。左侧表示重组病毒的基因组长度。罗马数字(I、II和III)指图8B中展开的基因间区域。
图7B说明生物学衍生的BRSV病毒株ATue51908(顶线)的SH/G(I)、G/F(II)和F/M2(III)基因间区域的排列；重组版本rBRSVATue51908(第二条线)、重组嵌合病毒rBRSV/LongF(底线)。图1B，图7B注解如下I组SH/G基因间区域ATue5 1908(顶线)(SEQ IDNO1)；rBRSV(第二条线)(SEQ ID NO2)；rBRSV/LongF(第三条线)(SEQ ID NO2)。图7B，II组G/F基因间区域ATue 51908(顶线)(SEQ ID NO5)；rBRSV(第二条线)(SEQ ID NO6)；rBRSV/LongF(第三条线)(SEQ ID NO13)。图7B，3组F/M2基因间区域ATue5 1908(顶线)(SEQ ID NO9)；rBRSV(第二条线)(SEQ ID NO10)；rBRSV/A2(第三条线)(SEQ ID NO11)。
图8提供了确定重组病毒分离物rBRSV/LongF的同一性的RT-PCR和限制分析。用来自所标示病毒分离物感染的细胞总RNA完成两个RT-PCR。在0.8％琼脂糖凝胶上分析PCR产物。如果删除RT步骤，就不会得到PCR产物。以计算的大小估计核苷酸长度。标记为1kb梯度的DNA(Life Technologies，Gaithersburg，MD)。在左侧为一些标记片段的大小。用与F基因的上游和下游的BRSV骨架之序列(ATue51908核苷酸5380-5397(BRSV G基因)，和ATue51908核苷酸7567-7550(BRSV M2基因)杂交的引物对完成PCR1。PCR1对于BRSV病毒株ATue51908和重组类似物rBRSV来说产生2,187核苷酸的产物，对于rBRSV/LongF产生2,161核苷酸的产物(在这些条件下用电泳无法区分这些带)。按照预期，用上述BRSV引物对不能从HRSV病毒株Long RNA中获得PCR产物。对PCR 1产物进行限制分析。按照预期，通过SphI可切割重组病毒，但不切割标准BRSV病毒株ATue51908(对于rBRSV产生2,028bp和159bp的带，对于rBRSV/LongF产生2,002bp和159bp)，这说明存在合成的SphI标记限制位点(rBRSV和rBRSV/LongF基因组位置5539)。按照预期，EcoRI在BRSV ATue51908和rBRSV F基因的EcoRI位点(基因组位置6233)切割，产生1,334核苷酸和853核苷酸的两个片段，而EcoRI不切割源自rBRSV/LongF片段。按照预期，当用PstI消化时，含BRSV F基因的片段仍不切割，而rBRSV/LongF产物切割成1,351bp、586bp和224bp的片段，这表明在HRSV Long F基因中存在两个天然PstI位点(位置63和649)。用与HRSV病毒株Long F基因杂交的引物对(引物FL，3′-GGGGCAAATAACAATGGAGTTGCCAATC-5′(SEQ IDNO19)，HRSV病毒株Long F基因序列的核苷酸1-28，和引物FLr，5′-TTTTTATATAACTATAAACTAGGAATCTAC-3′(SEQ ID NO20)，HRSV病毒株Long F基因核苷酸1903-1874)完成PCR 2，对于rBRSV/LongF和HRSV病毒株Long亲本病毒来说产生1,903bp的PCR产物。按照预期，从rBRSV得不到产物。用EcoRI和PstI消化产生预期的切割图。
图9提供了rBRSV/LongF的表面蛋白的免疫电子显微镜分析。A组BRSV G蛋白的mab G66；B组BRSV G蛋白的mab 021/21G；C组与HRSV和BRSV的F蛋白均反应的mab 2F；以及D组HRSVF蛋白特异性的mab 44F。棒150nm。
图10嵌合rBRSV/HRSV基因组的详细构建，其中已缺失了BRSVG和F基因，并将HRSV的G和F基因放在靠近启动子的位置。BRSV基因用阴影表示；HRSV基因用空白表示。核苷酸序列位置数字是相对于完整rBRSV反基因组而言的(Buchholz等，J.Virol.73251-259，1999；Buchholz等，J.Virol.741187-1199，2000；GenBank登记号AF092942或者在Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9211563-11567，1995中的rHRSV反基因组；每篇文献在此引入作为参考)；涉及HRSV序列的序列位置编号有下划线。图10，A组含有在以前的工作中加入的NotI、SalI和XhoI位点的rBRSV的详细结构(Buchholz等，J.Virol.73251-259，1999；Buchholz等，J.Virol.741187-1199，2000)。图10，B组描述了对rBRSV的修饰以产生rBRSV/A2-G1F2。通过用SalI和XhoI消化和再连接所得的相容性粘性末端，缺失BRSV G和F基因。通过含有掺入到各cDNA末端之所需改变的引物，经PCR扩增来自核苷酸4692-7557含有G和F基因HRSV基因组区域。扩增的PCR产物含有(按从上游到下游的顺序)NotI位点、BlpI位点、完整HRSV G ORF、其下游非编码和GE信号、HRSV G-F IG序列、完整HRSV F基因、来自HRSV F-M2 IG序列的6个核苷酸(CACAAT)、NS 1 GS信号、BlpI位点和NotI位点。将该cDNA克隆到rBRSV位置67的特有Notl位点。图10，C组说明rBRSV/A2-G1 F2的基因组RNA的结构。
图11描述在人HEp-2(左组)和牛MDBK(右组)细胞中RBRSV、rHRSV(rA2)、rBRSV/A2、和rBRSV/A2-G1 F2的多轮生长。在0.1 MOI时用所标名的病毒感染两份细胞单层，然后在37℃保温，在所标示的时间收集培养基样品，快速冷冻，贮存于-70℃，然后一式两份滴定。每个值均为两个孔的平均值。
图12表明用rBRSV/A2-G 1 F2、rBRSV/A2或rA2感染的HEp-2细胞的间接免疫荧光。在0.1 MOI时感染细胞，在37℃保温96小时，用丙酮固定，透化，然后与HRSV G蛋白特异性的单克隆抗体021/1G或者与HRSV F蛋白特异性的单克隆抗44F反应。通过与标记的对鼠IgG特异性抗体反应肉眼观察抗体结合。
图13含HRSV的M、G和F基因的嵌合rBRSV/HRSV的详细构建。BRSV基因用阴影表示；HRSV基因用空白表示。指称HRSV基因的序列位置编号有下划线。图13，A组描述了rBRSV/A2的修饰，从而在P和M基因间的基因间区域(P-M IG)，在位置3204含有一个独特MluI位点。用表明源核苷酸排列的小写字母表示IG序