专利名称：嵌合momp抗原、方法和使用的制作方法嵌合MOMP抗原、方法和使用技术领域本发明总体上涉及能够诱导抗沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)的保护性免疫应答(反应)的多肽类的领域。更具体地说，本发明涉及这些多肽类的生产并涉及包括它们的药用组合物。已知形成沙眼衣原体的外膜复合物的蛋白质之一的主要外膜蛋白(MOMP)能够诱导两种T-细胞应答并且中和哺乳动物(如人类)的抗衣原体感染的抗体。MOMP 蛋白质的示意性概观在图1中示出，改编自Findlay HE, McClafferty H&Ashley RH(2005)，重组沙眼衣原体主要外膜蛋白的表面表达、单通道分析和膜拓扑学(Surface expression, single-channel analysis and membranetopology of recombinant Chlamydia trachomatis major outer membrane protein)。BMCMicrobiology 5，5是一篇阐明MOMP蛋白质的拓扑学的论文。在图1中，A表示细胞膜而B表示细胞膜的外表面。将总MOMP蛋白质用作抗沙眼衣原体的疫苗已在WO 2008/040757A1中披露。不过，动物实验已表明抗-衣原体的MOMP亚单位疫苗的成功非常有限。此外，整体MOMP蛋白质的生产是繁琐的和昂贵的，更不用说还受限于某些特定的生产方法。为了克服上述的缺陷，已有人提出使用合成肽类，所述合成肽类结合了来自沙眼衣原体的特异性表位，这些表位触发免疫应答。不过，所述分离的表位在合成的背景下可能不具备功能性，并因而不能提供希望的效果。因此，用于产生抗沙眼衣原体的保护性免疫应答的改进的多肽会是有优势的，并且尤其是允许有增大的灵活性、成本效率、简化的生产和纯化同时具有保留或改进的免疫效应的多肽会是有优势的。发明内容因此，本发明优选寻求减轻、缓和或消除本领域的一个或多个上述缺陷以及单独或以任何组合形式的缺点的解决方案并且通过提供根据所附权利要求所述的多肽解决至少上面提到的问题。
本发明的一般解决方案是提供一种多肽，所述多肽易于生产和纯化，但具有保留的用于产生抗沙眼衣原体的免疫应答的能力。
因此，根据第一方面，提供了一种多肽。所述多肽包括第一氨基酸序列，所述第一氨基酸序列具有与根据SEQ ID NO 1的氨基酸序列至少90% (如至少95%)的同源性(％ — 致性)，如用标准设置通过BLAST算法进行测量；和第二氨基酸序列，所述第二氨基酸序列具有与根据SEQ ID NO 2的氨基酸序列至少90% (如至少95%)的同源性，如用标准设置通过BLAST算法进行测量；其 中所述第一和第二氨基酸序列被少于30个氨基酸残基分开。所述第一和第二氨基酸序列分别包括用于产生抗沙眼衣原体的保护性的抗原-特异性免疫应答的表位，以及沙眼衣原体的主要外膜蛋白(MOMP)的跨膜部分的一部分。所述第一和第二氨基酸序列合起来包括大约25个表位，这些表位可能刺激T细胞应答(⑶4+和⑶8+)以及B细胞应答。这样的优点是与整个(完整的)MOMP蛋白质相比，该多肽易于以纯化的形式生产，同时仍诱导可接受的免疫应答。多肽(每个包括MOMP的跨膜部分的一部分)的优点是表位的三维结构被保存(是保守的)，因为两个跨膜部分可能互相作用以形成疏水结构， 如图14中所示。包括MOMP的跨膜部分的一部分的多肽的另一个优点是在生产过程中，表位被保留在构造中。这样的另一个优点是为嵌合体的两个部分之间的疏水相互作用提供了可能，继而提供可模拟整个MOMP蛋白质的抗原特征的三维域。因此，通过去除根据第一方面的多肽中的大部分的MOMP蛋白质的膜部分，获得了比野生型MOMP更易于处理的多肽；并且通过同时保留特别选定的、在序列端部的膜螺旋(体)的最小部分，获得了与较短的人工序列相比更稳定并且可能更有效的多肽。
一并考虑，所述多肽提供了基于MOMP蛋白质的替代的合成肽，所述合成肽是抗原性的并且适用作疫苗。
具体地说，与只有两个链接(结合)表位的人工的较短的序列相比，所述多肽能够实现保留或改进的抗原性，同时与野生型MOMP相比易于生产和纯化。
在一个实施例中，所述多肽的长度在107和132个氨基酸之间，如在107和112个氨基酸之间的长度。这样的优点是所述多肽更易于表达。
在一个实施例中，所述第一氨基酸序列和第二氨基酸序列被根据SEQ IDNO 20或 SEQ ID NO 26的接头分开。
这是有优势的，因为根据SEQ ID N0:20或SEQ ID NO :26的接头是挠性的，这意味着它为嵌合体的两个部分之间随机的相互作用提供了可能，增大了三维结构形成的机率， 所述三维结构在不将蛋白质锁定在不利构象的前提下会被免疫系统认可。
挠性的接头的另一个优点是它为多肽的两个部分同时与免疫系统的不同部分发生相互作用提供了机会，因为它们可以彼此相对运动(移动)，如图15所示。
在一个实施例中，用于产生抗沙眼衣原体的保护性的抗原特异性免疫应答的表位在若干沙眼衣原体的血清(变)型中被保存。
这是有优势的，因为它能够使(对)抗一种以上的沙眼衣原体的血清(变)型的保护性应答成为可能。
在一个实施例中，所述第一和第二氨基酸序列分别是根据SEQ ID N0:21和SEQ ID NO 22的序列(沙眼衣原体，E血清型)。在另一个实施例中，所述第一和第二氨基酸序列分别是根据SEQ ID NO 23和SEQ ID NO 24的序列(沙眼衣原体，D血清型)。所述第一和第二氨基酸序列还可以由不同的血清型进行组合。
这是有优势的，因为它能够使抗一种以上沙眼衣原体的血清型的保护性应答成为可能。
在一个实施例中，如用标准设置通过BLAST算法所测量的，多肽具有与根据SEQ ID NO 3的氨基酸序列至少90% (如至少95%)的同源性。在一 个实施例中，多肽包括根据SEQ ID NO :3的氨基酸序列并且在另一个实施例中，多肽具有根据SEQ ID NO :3的氨基酸序列。
在一个实施例中，多肽被融合到一氨基酸序列，所述氨基酸序列包括根据SEQ ID NO :5的His-标签(多聚组氨酸标签)和/或根据SEQ ID NO 4的V5标签。
这样的一个优点是所述多肽更易于纯化。
在一个实施例中，所述多肽具有根据SEQ ID NO :6的氨基酸序列，即由根据SEQ ID NO 6的氨基酸序列构成。
根据第二方面，提供了包括根据第一方面的氨基酸序列的化合物。
根据第三方面，提供了一种核酸，所述核酸编码根据第一方面的多肽。
在一个实施例中，核酸具有第一核酸序列，如用标准设置通过BLAST算法所测量的，所述第一核酸序列具有与根据SEQ ID NO 7的核酸序列至少60%或至少70%，如至少 80%,或优选至少90%的同源性；以及第二核酸序列，如用标准设置通过BLAST算法所测量的，所述第二核酸序列具有与根据SEQ ID NO 8的核酸序列至少60%或至少70%，如至少 80%，或优选至少90%的同源性，其中所述第一和第二核酸序列被少于90个核酸残基分开。
在一个实施例中，所述核酸包括根据SEQ ID NO 9的核酸序列。
根据第四方面，提供了一种质粒，所述质粒包括根据第三方面的核酸。
在一个实施例中，所述质粒被用作表达载体。
根据第五方面，提供了一种通过根据第四方面的表达载体转化的细胞。
在一个实施例中，所述细胞选自由下述各项构成的组植物细胞、细菌、酵母细胞、 真菌细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
根据第六方面，提供了一种用于产生根据第一方面的多肽的方法，所述方法包括培养根据第五方面的细胞并且恢复(回收)所述多肽。
根据第七方面，提供了一种组合物，所述组合物包括根据第一方面的多肽连同药学上可接受的赋形剂。
在一个实施例中，所述组合物还包括佐剂，如霍乱毒素(CT)佐剂。
根据第八方面，提供了用作药剂的根据第一方面的多肽、根据第二方面的化合物、 或根据第七方面的组合物。
根据第九方面，提供了用作抗沙眼衣原体的疫苗的根据第一方面的多肽、根据第二方面的化合物、或根据第七方面的组合物。
根据第十方面，提供了用于防止由于沙眼衣原体感染引起的不孕的根据第一方面的多肽、根据第二方面的化合物、或根据第七方面的组合物。
根据第十一方面，提供了使用，其中根据第一方面的所述多肽、根据第二方面的所述化合物、或根据第七方面的所述组合物通过口服、肠道外给药、通过吸入喷雾给药、局部外敷、直肠给药、鼻给药、口腔(向颊)给药、舌下给药或阴道给药。
在一个实施例中，所述给药是(经)鼻给药。(经)鼻给药可以通过鼻喷雾剂或滴鼻剂实现。
与现有技术相比，本发明具有的优点是它更易于生产，具有保持的或改进的免疫效应，这继而允许更灵活的给药途径。
本发明还具有的优点是它更易于以可溶的形式纯化并且在溶液中具有增大的稳定性。



由本发明下文的实施例的描述显而易见并可阐明本发明所能够实现的这些和其它方面、特征和优点，参见附图，其中
图1是WT MOMP蛋白质的示意性图解；
图2是根据一个实施例的基因构造的PCR分析结果的图像；
图3是根据一个实施例的多肽的蛋白质印迹分析(Western blot analysis)结果的图像；
图4是根据一个实施例的纯化的MOMP蛋白质的考马斯蓝染色(Coomassie blue staining)的图像；
图5是根据另一实施例的多肽的蛋白质印迹分析结果的图像；
图6是根据一个实施例的转化的基因组DNA的Southern印迹分析结果的图像；
图7是根据另一个实施例的多肽的半定量结果的图像；
图8和9是示出根据某些实施例的免疫接种实验结果的图解；
图10是示出根据一个实施例的在小鼠上免疫接种的保护效应的图表；
图11是示出根据一个实施例的免疫接种实验结果的图解；
图12是示出根据一个实施例的在小鼠上免疫接种的保护效应的图表；
图13是示出根据一个实施例的在小鼠上免疫接种的禁止效应的图表；
图14是根据一个实施例的跨膜部分相互作用以形成疏水结构的示意性概观；和
图15是根据一个实施例的多肽的两个部分的示意性概观，它们彼此相对移动(运动)。

为了本领域的普通技术人员能够实施本发明，将在下文结合附图更详细地描述本发明的几个实施例。不过，本发明可能以许多不同的形式来体现并且不应当被解释为受限于在此所列举的实施例。相反，这些实施例提供的目的是为了使本文公开内容能详尽和完整，并且将本发明的范围完全地传达给本领域的普通技术人员。实施例不是对本发明的限制，而是本发明仅限于所附的权利要求书。此外，在附图中示出的具体实施例的详细说明所用的术语不旨在对本发明进行限制。
下文的说明书着重于本发明的一个实施例，所述实施例可应用于一种用于产生抗沙眼衣原体的保护性的免疫应答的多肽，并且特别地可适用于一种嵌合多肽，所述嵌合多肽基于沙眼衣原体E血清型多肽Μ0ΜΡ，用于产生抗沙眼衣原体的保护性的免疫应答。不过， 应当理解的是本发明并不局限于本申请的公开内容，而是可被应用到许多其他的血清型， 包括例如血清型 A-K、Ba、Da、la、Ja、L1-L3、和 L2a。
本发明的发明人业已发现一种嵌合多肽，所述嵌合多肽基于MOMP蛋白质，起到抗沙眼衣原体的免疫的抗原的作用，并且还易于纯化，这是由于与WTMOMP蛋白质相比它的尺寸相对小并且疏水性降低。
如将在下文中更详细示出的，多肽可能在多种宿主中表达，如大肠杆菌 (Escherichia coli)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)和古月萝卜(Daucus carota)。不过， 任何一种宿主(如细菌酵母、真菌、植物、昆虫或哺乳动物细胞)都可用于表达。包 括两个WT MOMP蛋白质环的多肽或MOMP嵌合体比WT蛋白质更溶于水并且在抗原性方面是优化的，因为它包括T和B淋巴细胞-刺激表位，这对于免疫效应是重要的。此外，它更易于纯化并更稳定。多肽可通过对于本领域技术人员来说已知的任何方式给药给受用对象。例如，给药给人或动物可以是局部的或全身的并且通过口服、肠道外给药、通过吸入喷雾、局部外敷、直肠给药、经鼻给药、口腔(向颊)给药、舌下给药、阴道给药或经植入式储药器实现。术语“肠道外(给药)”用在本文中包括皮下、静脉注射、动脉内、肌肉、皮肤内、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内、颅内和骨内的注射和输注技术。在一个实施例中，还提供了药用组合物，所述组合物包括有效量的根据某些实施例的至少一种多肽和药学上可接受的载体。组合物可被配制成固态、液态、凝胶或悬浮液形式，用于口服给药，例如，片剂(例如，针对口腔、舌下或全身的吸收)、大丸齐U、粉齐U、颗粒齐U、施用于舌的糊剂或凝胶剂、硬胶囊剂、软胶囊、口腔喷剂、乳剂和微乳剂；通过皮下、肌肉、静脉或硬膜外注射的肠道外给药，例如，无菌溶液或悬浮液；局部外敷给药，例如，施加于皮肤的乳霜、药膏、贴剂或喷剂；阴道内或直肠内给药，例如，阴道栓、霜或泡沫剂；舌下给药；眼部给药；经皮肤给药；或经鼻给药，如鼻喷雾剂或滴鼻剂。在一个实施例中，多肽可以口服地给药给受用对象，如小鼠或人。在另一个实施例中，多肽可以经鼻给药给受用对象，如小鼠或人。经鼻给药可以通过喷雾剂或通过滴剂进行。.在另一个实施例中，多肽可以肠道外给药给受用对象，如小鼠或人。本发明的发明人发现具有根据一个实施例的表位的构造，对于CD4+T淋巴细胞、细胞毒T淋巴细胞(CTL)以及中和抗体是重要的，它们对于形成抗沙眼衣原体的保护性免疫应答是必要的。这种新的蛋白质在小鼠上诱导免疫原性应答以及保护性效应。分开表位(如分开SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2)的氨基酸残基的类型和数量可以选择，如本领域所知的，以使多肽易于被纯化，相应的核酸序列以希望的细胞类型方便表达和/或多肽可以按希望的剂型给药。优选的，进行这种选择使得多肽的产生抗沙眼衣原体的免疫应答的能力保持在高位，或至少在可接受的水平。

所设计的构造被成功地转到拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组中，并且超过至少六代证实了转基因的稳定整合，这通过免疫印迹分析得到证明。这是有优势的，因为后代中转基因的稳定性对于未来扩大转基因植物生产的可能性是重要的。由于拟南芥(A. thaliana)被小鼠生吃，在临床前试验中，它可用作模型系统。将可食用转基因植物用作接种疫苗的其它优点包括运输简单、成本效率和用于当地生产的可能性。此外，通过这种方式生产的疫苗是安全的和非传染性的并且为高频率的增涨提供了可能性。在口服(接种)疫苗期间给药方案的改进和佐剂的使用可增大可食用疫苗的功效。基于植物的可食用疫苗对于所述免疫接种是良好的候选者。它们安全、便宜并且可以在当地种植。此外，通过杂交植物产生不同的产物，转基因植物能够产生若干种不同的抗原。已知的是，转基因植物可以刺激全身和粘膜的双向免疫应答。此外,所设计的构造被成功地转到大肠杆菌(Escherichia coli)中。这是有优势的，因为大肠杆菌(E. coli)对于蛋白质生产是公知的和常用的宿主。在一个实施例中，多肽被链接至表达标签，如V5和/或His (多聚组氨酸)标签。这是有优势的，因为它简化了多肽的生产和纯化。
实施例的详细说明
以下是实施例的详细说明。提供的实施例仅用于示例目的，以便本领域的普通技术人员能够实施和使用本发明。不过，实施例不应被理解为以任何方式对本发明加以限制。
嵌合MOMP构诰根据制造商的方案，使用QlAamp DNA Mini Kit (迷你试剂盒)(Qiagen, Hilden,Germany),从源自被沙眼衣原体E血清型感染的病人的细菌悬浮液(OrebroUniversityHospital, Sweden)中分离出总基因组DNA。利用根据SEQ ID NOs : 10至13的引物(分别是VS2正向1、VS2反向1、VS4正向I和VS4反向I )，从制备好的基因组DNA起，对包含多个选定的B和T细胞表位的沙眼衣原体MOMP的两个DNA片段(如图1中的相似部分VS2和VS4所示)进行初始扩增。PCR反应利用了 Ex Taq DNA聚合酶(Takara Bio Inc, Shiga, Japan)并且由98° ((10秒)、55° C (30秒)和72° C (I分钟)35个循环组成，随后在72° C下延伸(15 分钟)。PCR 产物通过 QIAquick PCR Purification Kit (纯化试剂盒)(Qiagen,Hilden, Germany)进行纯化,并且在与第一次PCR相同的条件下通过用于VS2延伸的片段的根据SEQ ID NOs :14至15的引物(分别是VS2正向2&3和VS2反向2)以及用于VS4延伸的片段的根据SEQ ID NOs 16至17的引物(分别是VS4正向2和VS4反向2&3)进行第二次PCR0用于扩增VS2和VS4片段的PCR引物外加接头序列[(Gly4Ser)3](根据SEQ ID NO:20)或接头序列[(Gly4Ser)2Gly4](根据SEQID NO :26)是基于接头和选定的MOMP片段的核苷酸序列设计的。纯化的片段被提供为SEQ ID NOs :1和2，并且与根据图1的VS2和VS4片段相似。纯化的片段通过对于本领域技术人员已知的重叠延伸利用下述条件进行拼接95° C(1分钟)、55° ((1分钟)、72° C (2分钟)循环10次，接着在72° C下延伸15分钟。拼接的产物被用于第三次PCR,其中使用Pfx Taq-聚合酶(Invitrogen, Carlsbad, CA)和94° C (15秒)、55° C (30秒)、72° C (2分钟)循环25次，接着是在72° C下单个延伸步骤(30分钟)。扩增通过引物SEQ ID N0:14和SEQ ID N0:17进行。如上文所述对所获得的根据SEQ ID NO 9的PCR产物进行纯化。纯化的片段SEQ ID NOs :1和2包括用于产生抗沙眼衣原体的保护性的抗原特异性免疫应答的表位，以及沙眼衣原体的主要外膜蛋白(MOMP)的跨膜部分的部分。SEQ IDNO 1的跨膜部分由氨基酸编号22 至27来表示，并且SEQID NO 2的跨膜部分分别由氨基酸编号3至9和17至23来表示。只使用MOMP的片段的一个优点是与整个MOMP蛋白质相t匕，多肽更易于以纯化的形成生产。多肽包括MOMP的跨膜部分的部分的一个优点是表位的三维结构被保存(是保守的)。多肽包括MOMP的跨膜部分的部分的另一个优点是在生产过程中表位被保留在构造中。这种结构的另一个优点是它为嵌合体的两个部分之间的疏水性相互作用提供了可能，继而提供可以模拟整个MOMP蛋白质的抗原特征的三维域。相信跨膜部分是螺旋构象。在一个实施例中，每个片段，如SEQ ID NOs 1和2，包括两个螺旋。这是有利的，因为它进一步增强了上述优点。—并考虑，多肽使保留或改进的抗原性成为可能，同时易于生产和纯化。在一个实施例中，用于产生抗沙眼衣原体的保护性的抗原特异性免疫应答的表位在若干沙眼衣原体的血清型中被保存(是保守的)。这是有利的，因为它使抗一种以上的沙眼衣原体的血清型的保护性应答成为可倉泛。大肠杆菌m.coli)中MOMP嵌合体的克隆和表达根据制造商的方案，利用Champion pET Directional TQPO ExpressionKit (表达试剂盒)(Invitrogen, Groningen, The Netherlands)将纯化的 MOMP 嵌合体克隆到 pET101/D-TOPOr载体。通过测序(ABI PRISM 310 Genetic Analyser, AppliedBiosystems,Foster City, CA)确认我们的构造与C-端V5和6xHis融合标签在框架中。嵌合蛋白质在BL21 StarTM(DE3)大肠杆菌(E. coli)菌株中表达。用IOml的源自大肠杆菌单菌落的新鲜的过夜培养物接种体积为IOOOml的包含50 u g/ml羧苄西林和2. 5mM甜菜碱的LB培养基(Sigma, Steinheim, Germany)并且在 600nm 下 0. 72 的光密度(OD)在 37° C 下生长。加入异丙基 -D-硫代半乳糖苷(IPTG, Invitrogen, Groningen, The Netherlands)到最终浓度为0. 15mM，并且将培养物再孵育4小时。细菌通过离心作用(5000 x g，15分钟)被收集并且根据针对它们的N1-NTA树脂的Sigma-Aldrich的方案进行蛋白质纯化。
MOMP嵌合体的钝化将细菌沉淀物(粒料)重悬在裂解液中(50mM磷酸钾，pH 7. 8,400mMNaCl, IOOmM此1，10%甘油，0. 5%Triton X-100, IOmM L-组胺酸，ImM苯甲基磺酰氟(PMSF))，在液氮中冷冻并随后在42° C下解冻。重复冷冻和解冻三次，接着在冰上超声处理(35W，6 X 30秒)以便裂解。超速离心后(45000 X g，45分钟)获得两个部分-可溶部分和不可溶部分。根据制造商的方案，在天然条件下·利用HIS-Select镍亲和凝胶(HIS-Select Nickel AffinityGel) (Sigma, Saint Louis, Missouri)纯化可溶部分。沉淀物(粒料)被重悬在0.1M磷酸钠(pH为8.0)，8M尿素中并且经声波处理，如上文所述。通过超速离心(50000 x g，60分钟)除去不可溶物质。根据制造商的建议，通过固定化的金属-离子亲和层析在变性条件下对上层清液进行纯化。将洗脱的蛋白质的已收集的部分汇集起来(分别对于天然蛋白质和对于变性蛋白质)并且通过截留分子量为IOKDa的Amicon Ultra离心过滤器装置(Millipore, Billerica, MA)进行浓缩。
对于棺物转化的DNA构律利用引物SEQ ID N0:14和18 (STOP密码子被引入根据SEQ ID N0:18的引物)以及Pfx Taq-聚合酶(Invitrogen, Carlsbad, CA),由先前获得的构造再扩增嵌合M0MP,以便产生钝端PCR产物。利用以下条件进行PCR :94° C下15秒、55° C下30秒、72° C下2秒循环35次，接着72° C下单个延伸步骤达30分钟。PCR产物如前所述被纯化并用于亚克隆到植物表达载体。作为植物表达载体，我们使用了 pGreen0229 (www. pgreen, ac. uk),由Dr.P. MulIineaux 和 Dr.R.Hellens, John Innes Centre 和 Biotechnology andBiologicalSciences Research Council (Norwich Research Park, UK)惠赠。表达盒包含了 CaMV35S启动子和CaMV聚腺苷酸终止(子)序列，由多克隆位点分开。载体由SmaI酶在多克隆位点线性化并且用于克隆嵌合MOMP构造。通过测序核实所得到的质粒以确定插入物的正确定向(ABI PRISM 310GeneticAnalyser, Applied Biosystems, Foster City,CA)。
拟南芥中的植物转化通过电穿孔,利用pGreen0229/嵌合MOMP来转化根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens) (EHA105),由 E. E. Hood (Department of Biology, UtahState University)惠赠。在添加有卡那霉素(50 U g/ml)和四环素(5 ii g/ml)的LB培养基上选择阳性克隆(系)。拟南芥生态型Columbia-0 (Col-O) (The European Arabidopsis StockCentre, Loughborough, UK)被用作植物转化的背景。在施肥的土壤珍珠岩蛭石混合物(1:1:1)上播种后，种子在4° C下(黑暗)保持5天，然后转移到生长室(22° C，16小时光照，8小时黑暗，70%湿度)。白光的荧光率是100 u mo I光子HT2JT1 (PAR)。转基因植物通过本领域已知的四周龄拟南芥属植物的简化的花序浸溃(floral dip)法产生并且通过在包含草铵勝(glufosinate-ammonium) (BASTA) (10 U g/ml) (Riedel-de Haen, Seelze, Germany)^Psephatoxime (400 u g/ml) (Sigma, Steinheim, Germany)的 Murashige and Skog(MS)培养基上发芽进行选择。抗性植物被转移到盆栽混合土(potting mix),以便分析、自体受粉和种子生产。由产生100%BASTA-抗性后代的各植物所获得的种子被用于进一步的实验。
胡萝卜中的植物转化在一个替代性实施例中，通过电穿孔，利用pGreen0229/嵌合MOMP来转化根癌土壤杆菌(EHA105),该菌株由 E. E. Hood (Department of Biology, UtahState University)惠赠。在添加有卡那霉素(50 g/ml)和四环素(5 g/ml)的LB培养基上选择阳性克隆(系)。胡萝卜(Daucus carota (carrot) (L. ) ssp. sativus cv Napoli Fl)(Weibullstradgard AB, Hammenhog, Sweden)的种子在 25%[v/v]氯中消毒 45 分钟又在
2.5%[v/v]氯中消毒2小时，70%乙醇中I分钟，并最终在I小时内在水中洗三次。无菌的胡萝卜(D. carota)种子在 没有生长调节剂的MS培养基上发芽并且通过用2，4- 二氯苯氧乙酸(lmg/1)在MS培养基上培养由切断的下胚轴开始生长愈伤组织细胞。将愈伤组织细胞悬浮在相同类型的液态培养基中并且在25° C下在黑暗中的摇床(90rpm)上生长。为了产生体细胞胚，细胞被转移到无生长调节剂的MS培养基。为了转化，在添加了新鲜的生长培养基后的10-14天取胡萝卜细胞。通过离心作用(在IOOg达I分钟)将胡萝卜细胞进行浓集，4-5ml浓集的细胞在可达到20ml的液态MS培养基中被稀释并且添加600 的LB培养基(在600nm下1. 5的光密度)中携带载体的根癌土壤杆菌(A. tumefaciens)。利用摇床(90rpm)在25° C下在黑暗中将细胞和细菌共培养3天。为了选择转基因胡萝卜细胞，它们通过离心作用在液态MS培养基中被重复洗三次以便除去细菌，并且随后在25° C下在弱光(lu E/m2/s)中在添加有BASTA(0、1、5、* 10 u g/ml)以及头孢噻月亏(cephotaxime)(500 u g/ml)的无生长调节剂的培养基中埋入并进一步培养。胡萝卜细胞的密度为0. 1-0. 9ml浓集细胞/IOml的培养基。生长聚集物以及某些情况下植物被转移到没有BASTA的无生长调节剂的MS培养基。体外植物在薄雾-房子(mist-house)中在11 (个)塑料罐(PhytoTechnology Laboratories, Terrace Lenexa, KS, USA)中被培养并适应环境达大致 2 周，在弱光下给予18h/6h光/黑暗，并随后利用相等的光周期但用50 u E/m2/s的光强在盆中培养。
免疫印迹为了制备蛋白质样本，通过研钵和研件在包含50mM Tris、8M尿素、l%TritonX_100和ImM DTT (pH 7. 5)的提取缓冲液中研磨拟南芥属组织。蛋白质提取物通过SDS-PAGE被分离并且被印迹到硝化纤维素膜Hybond-C上(Amersham Biosciences, Buckinghamshire, England)。所述膜在 TBS (0. 02MTris_HCl、0. 15M NaCl, pH 7. 4)中的 3%BSA(Sigma, Steinheim, Germany)中封闭I小时并且用稀释了 1:2500倍的小鼠抗沙眼衣原体MOMP的单克隆抗体(AcrisAntibodies Gmbh, Germany)探测I小时。用结合了碱性磷酸酶(AP)的抗-鼠抗体(Promega，Madison, WI)检测嵌合MOMPE并且用NBT和BCIP(Promega, Madison, WI)进行可视化。
基因组DNA提耳又和Southern印迹分析利用JETFLEX 基因组 DNA 纯化试剂盒(JETFLEX Genomic DNAPurification Kit)(GENOMED GmbH, Lohne, Germany)隔离植物基因组 DNA,并通过 DraI,NdeI 或 NotI (Sigma)裂解15 ii g DNA。这些酶不裂解嵌合MOMP序列。裂解的DNA通过在1%琼脂糖凝胶上进行电泳分离被分离并被转移到Hybond-N膜(GE Healthcare)。膜通过利用随机引物DNA标记系统(Invitrogen, Carlsbad, CA)标记有32P_dCTP的嵌合MOMP DNA进行探测。在X-射线胶片上观察到的带的数量与植物基因组中T-DNA插入物的数量相对应。
构建的免疫基因的验证进行了中间试验。用鼻内给药通过重组MOMP嵌合体使五只小鼠(C57/bl6)得到免疫，每次免疫启动之间有10天间隔。给药剂量是10 ii g的纯化的重组MOMP嵌合体。小鼠在免疫接种开始前和每次免疫启动后被采集血液，并且通过ELISA分析血清抗-MOMP嵌合体 IgG。ELISA 板(Nunc Maxisorp, Odense, Denmark)覆有重组 MOMP 嵌合蛋白质(2 u g/ml)。血清在PBS中被稀释。抗嵌合体抗体(Abs)之后是HRP-标记的兔抗鼠Ig Abs并利用柠檬酸盐缓冲液(pH 4. 5)中的邻苯二胺底物/0. 04%H202进行可视化。在450nm下通过分光光度法读取(这些)反应。抗-MOMP嵌合体血清效价Iogltl滴度，表明了有希望的结果(数据末示出)。
嵌合MOMP构造及其在大肠杆菌中的过表达用于PCR以便扩增用于组装嵌合体的MOMP的VS2和VS4可变区的反向和正向引物是从核苷酸序列数据设计的。根据SEQ ID NO :19、编码根据SEQ IDNO :20的共同挠性接头(Gly4Ser3)3的序列被分别引入根据SEQ ID NOs 14和15的引物的5’ -端。在一个实施例中，根据SEQ ID NO :25、编码根据SEQ ID NO :26的另一共同挠性接头(Gly4Ser)2Gly4的序列被分别引入根据SEQ ID NOs :14和15的引物的5’-端。随后沿以下方向组装扩增的 VS2-和 VS4-类片段(分别是 SEQ IDNOs :1 和 2):5’-SEQ ID NOs :1:接头SEQ ID NOs 2-3’。所产生的嵌合体显示351bp的预期尺寸，如图2中L道中的强带所示出。图2示出了组装的基因构造的PCR分析的结果。N表示PCR-反应的阴性对照，L表示DNA尺寸标记物。产物通过测序进行验证并且克隆到PETlOl载体。过表达的蛋白质通过抗-His Abs(数据未不出)和抗-MOMP Abs (Acris Antibodies Gmbh, Germany)进行检测,如图3中所见，图3示出了在大肠杆菌中表达的并利用N1-NTA技术纯化的重组嵌合MOMP蛋白质的蛋白质印迹分析(Western blot analysis)的结果。通过对沙眼衣原体MOMP的小鼠单克隆抗体(Acris Antibodies Gmbh, Germany)检测预期尺寸(17kD)的带。L表示蛋白质尺寸标记物。我们将MOMP嵌合体的表达扩大到2000ml细菌培养物，以便利用N1-NTA亲和技术进行纯化。用考马斯蓝(Coomassie Blue)染色的纯化的嵌合体蛋白质在图4中示出。在天然条件下纯化的蛋白质被用在以后的免疫接种实验中，用于验证所设计的构造的免疫原性特征和用于产生抗-MOMP嵌合体多克隆抗血清。在变性条件下纯化的蛋白质被用于覆盖(包被)ELISA板，(所述ELISA板)用于检测小鼠血清中的特异性Abs。
植物中转基因插入物和嵌合体产生的分析所设计的MOMP嵌合体被连接到pGreen载体的SacI克隆位点，并且克隆片段的序列被验证。重组表达载体被用于转化Col-O生态型的拟南芥植物。在用双丙氨磷进行初始幼苗筛选后选定四十株转基因植物。三个选定的转基因系编号9、15和25被用于进一步的分析，并且已经证实可达到第六代的转基因的稳定整合，如图4中所见。未分级(段)的叶提取物中的组成性表达的嵌合MOMP蛋白质的蛋白质印迹检测在图5中示出三个转基因系(一式二份“a”和“b”)与未转化的植物(WT，作为阴性对照)的比较揭示了适当尺寸的特异性带，所述尺寸完全符合嵌合体和大肠杆菌表达的重组蛋白质的计算尺寸。将选定的转基因植物进行Southern印迹分析以便估算转基因的数量。限制性酶Dra1.Nde I和Mlu I被用于植物基因组DNA的裂解。用Dra I和Nde I所获得的结果在图6中示出。不同数量的转基因插入物出现在不同的系中系9包含一个插入物，系12-三个，系15-两个，而系25-四个插入物。尽管在不同的系中存在不同数量的转基因，但这并没有在视觉上影响植物的显型(表现型)。与拟南芥野生型(WT)植物相比，所述转化株具有相同的形态学的外观。通过用研钵和研棒在液氮中研磨大约200mg胡萝卜(根)来分析使用胡萝卜的替代性实施例的结果。冷冻的粉末在冰上被解冻并用200 ill的50mM Tris-HCl缓冲液(pH
7.3)进行涡流， 并随后如上所述进行分析。图7示出了根据上文所述利用胡萝卜产生的MOMP嵌合体的量的半定量分析的结果，用栽培种Karotan (系+ ;图7中表示为Kar)和栽培种Napoli (系313/3 ;图7中表示为313/3)，并与我们的MOMP嵌合蛋白质的标准量(180、300、600、和1200ng)进行比较。系Kar+每40 y g总可溶蛋白质(TSP)产生450ng M0MP，这对应于 1%。系 Napoli313/l 每 20 y g TSP 产生 600ng M0MP，这对应于 3%。
通过具有His/V 5标签的重组嵌合MOMP蛋白质在小鼠诱导的免疫应答四组10只小鼠被给予根据SEQ ID NO 6的构建的MOMP嵌合体。根据下述进行给药给予第一组10 i! g纯化的MOMP嵌合体和I U g霍乱毒素(CT)佐剂的混合物，鼻内给药(1. n. )20 u I三次，有10天间隔。在MOMP嵌合体+CT佐剂的末次给药十天后，给小鼠皮下(s. c)注射 Depo-Provera (Pfizer)。在 Depo-Provera 注射后七天，经阴道(1. vag)给药40 ill的10 ii g MOMP嵌合体+1 ii g CT佐剂的混合物的后续给药(加强)。给予第二组根据上文所述转化的转基因拟南芥，口服三次，有十天的间隔。每次，除常规饲料(喂料)之外，给予小鼠过量的新鲜的转基因拟南芥。在转基因拟南芥的末次给药后十天，给小鼠皮下(s. c)注射 Depo-Provera (Pfizer)。在 Depo-Provera (Pfizer)注射后七天，经阴道(1. vag)给予40 ill的10 ii g MOMP嵌合体+1 y g CT佐剂的混合物的后续给药(加强)。给予第三组根据上文所述转化的转基因拟南芥，口服三次，有十天的间隔。每次，除常规饲料(喂料)之外，给予小鼠过量的新鲜的转基因拟南芥。在转基因拟南芥的末次给药后十天，给小鼠皮下(s. c.)注射 Depo-Provera (Pfizer)。在 Depo-Provera (Pfizer)注射后七天，经阴道(1. vag)给予40iU的PBS缓冲剂的后续给药(加强)。第四组被用作阴性对照，g卩，没有任何给药。通过ELISA针对抗原特异性抗体(IgG和IgA)分析小鼠的免疫应答。然后，通过用沙眼衣原体入侵(挑战)小鼠来测试免疫应答的强度，以查看是否获得了保护性免疫或保护性免疫应答。末次处理后十天，采集血液和阴道样本。在七天过程中再次用Depo-Provera(Pfizer)处理小鼠，然后受(沙眼衣原体的)入侵。血液和阴道液体的样本被采集并通过ELISA进行分析，如上文“构建的免疫基因的验证”中所描述。当分析血清和阴道分泌物中的免疫应答时，第一组小鼠的免疫应答最强。第二和第三组显示较低一些的应答(某些小鼠是阴性的)。在阴道分泌物中可检测到低水平的抗体，主要是来自第一组中的小鼠。结果总结在图8和图9中。图8是示出分别在上述组一( )、组二( 口)和组三(A)的小鼠的免疫应答(IgG的Iogltl滴度)的图表。结果被分段以显示(从左到右)I次给药后、2次给药后、3次给药后、3次给药加上加强后、由独立的抗原破伤风类毒素刺激(以确保小鼠不是反应过度的)以及只由V5表位刺激的免疫应答。上述的组四(对照)不显示任何应答(数据未示出)。图9A和9B是示出分别在上述的组一( )、组二( 口)和组三(▲))中的小鼠的免疫应答(A-1gG的Iogltl滴度；B-1gA的Iogltl滴度)的图表。结果被分段以显示(从左到右)3次给药加上加强后的免疫应答，如用ELISA分别靶向MOMP嵌合体和V5表位所测量的。此外，研究了被沙眼衣原体血清型D感染的小鼠中用所构建的MOMP嵌合体进行免疫接种引起的保护效应。在图10中示出的结果根据标准的方法进行测量，即，分别在感染后携带细菌8((18)、16((116)、32((132)和40 (d40)天的小鼠的数量。黑条表示没有被免疫接种的小鼠(第四组)，白 条表示用根据上文所述的大肠杆菌产生的MOMP嵌合体处理的小鼠(鼻内给药和阴道内加强)(第一组)，而灰条表示用根据上文所述的拟南芥产生的MOMP嵌合体处理的小鼠(口服给药和阴道内加强)(第二组)。可以看到，免疫接种明显地提供了保护效应。第一组的小鼠部分得到了保护，比对照组更快的恢复。
通过没有His/V 5标签的重组嵌合MOMP蛋白质在小鼠中诱导的免疫应答给予三组10龄对照小鼠根据SEQ ID NO 3的所构建的MOMP嵌合体，即，没有His/V5标签。根据下述进行给药给予第一组10 ii g纯化的MOMP嵌合体+1 ii g CT佐剂的混合物，鼻内(1. n.)给药20 ill三次，有10天时间间隔。MOMP嵌合体+CT佐剂的末次给药后的十天，给小鼠皮下(s. c)注射 Depo_Provera(Pfizer)。在 Depo-Provera (Pfizer)注射后七天，经阴道(1. vag)给予40 ill的10 ii g MOMP嵌合体+1 ii g CT佐剂的混合物的后续给药(加强)。经鼻内给予第二组20 ill PBS缓冲液三次，有十天的时间间隔。在PBS缓冲液末次给药后十天，给小鼠皮下(s. c.)注射 Depo-Provera (Pfizer)。在 Depo-Provera (Pfizer)注射后七天，经阴道(1. vag)给予40 ill的10 ii g MOMP嵌合体+1 y g CT佐剂的混合物的后续给药(加强)。第三组被用作阴性对照，即，没有任何给药。通过使小鼠受沙眼衣原体的入侵来测量小鼠的免疫应答。末次处理后十天，采集血液和阴道样本。在七天过程中再次用Depo-Provera (Pfizer)处理小鼠，并随后受(沙眼衣原体的)入侵。取血液和阴道液体的样本并用如上文“所构建的免疫基因的验证”所述的ELISA分析。图11示出每次给药后第一组小鼠(黑点)的血清中逐渐增加的免疫应答。第三组的小鼠(对照组)显示为白色方块。研究了被沙眼衣原体血清型D感染的小鼠中用所构建的MOMP嵌合体免疫接种引起的保护效应。在图12中示出的结果根据标准化的方法进行测量，S卩，分别在感染后携带细菌7或14天的小鼠的数量。.白条表示没有被免疫接种的小鼠(第三组)，灰条表示用根据上文所述的大肠杆菌中产生的MOMP嵌合体处理的小鼠(鼻内给药和阴道内加强)(第一组)，而黑条表示用根据上文所述的大肠杆菌中产生的MOMP嵌合体处理的小鼠(只有阴道内加强)(第二组)。可以看到，免疫接种明显地提供了保护效应。
用没有His/V5标签的重组嵌合MOMP蛋白质诱导的小鼠的生育力研究与上文所讨论的免疫接种研究同时，进行了生育力研究。进一步研究了四组10只小鼠中，预先用根据SEQ ID NO 3 (即没有His/V5标签)的重组嵌合MOMP蛋白质进行免疫接种的雌性小鼠，其中每组如下第一组是没有被免疫接种并且健康的小鼠。第二组是被免疫接种的小鼠，但感染了沙眼衣原体血清型D。第三组的小鼠经鼻给予20 ill的10 ii g纯化的MOMP嵌合体+1 U g CT佐剂的混合物三次，有十天时间间隔。MOMP嵌合体+CT佐剂的末次给药后的十天，给小鼠皮下(s. c.)注射 Depo-Provera ( Pfizer)。在 Depo-Provera (Pfizer)注射后七天，经阴道(1. vag)给予40 ill的10 ii g MOMP嵌合体+1 ii g CT佐剂的混合物的后续给药(加强)。然后使小鼠受沙眼衣原体的入侵。给第四组的小鼠皮下(s.c.)注射 Depo-Provera (Pfizer)。Depo-Provera(Pfizer)注射后七天,经阴道(1. vag)给予40 ii I的IOii g MOMP嵌合体+1 y g CT佐剂的混合物的后续给药(加强)。然后使小鼠受沙眼衣原体的入侵。所有小鼠进行交配，然后称重以确定是否怀孕。将怀孕的小鼠处死并且计算胚胎的数量。研究的目的是调查所构建的MOMP抗原对小鼠生育力的影响。将受沙眼衣原体入侵的被免疫接种和未被免疫接种的小鼠的胚胎的数量进行比较。结果表现为受沙眼衣原体血清型D感染并且感染后交配产生后代的小鼠的数量。如在图13中可见，所有的未受感染和接种过疫苗的小鼠怀孕了，而40%的受感染的雌性小鼠是不孕的。因此，该研究表明沙眼衣原体导致40%的受感染的雌性小鼠不孕，而未受感染的小鼠和受感染的小鼠在给药根据SEQ ID NO :3的所构建的MOMP嵌合体后是100%有能生育的。在一个实施例中，提供了一种用于在哺乳动物中诱导抗沙眼衣原体的保护性免疫应答的方法，所述方法包括给药给所述哺乳动物根据第一方面的治疗有效量的多肽或根据第二方面的化合物或根据第七方面的组合物。在一个实施例中，所述哺乳动物是人。尽管本发明已在上文结合具体实施例进行了描述，但它不旨在受限于本文所述的特定形式。相反，本发明仅受限于所附的权利要求书，并且以上特定的实施例以外的其它实施例在这些所附权利要求的范围内是等同可能的。在权利要求中，术语“包括(comprises)/包括(comprising) ”不排除其它元件或步骤的存在。此外，尽管单独列出，但多个装置、元件或方法步骤可以通过例如单个单元来实现。另外，尽管各个特征可以包括在不同的权利要求中，但这些特征可能可进行有利的组合，并且纳入在不同的权利要求中并不意味着特征的组合是不可行的和/或不利的。此外，单数引用不排除多个。术语“一个(a)”、“一个(an) ”、“第一”、“第二”等等不排除多个。权利要求中的附图标记仅用作阐明示例，而不应被解释为以任何方式限制权利要求的范围。
序列表自由文本在序列表中，以下人工序列具有自由文本信息
SEQ ID NO 4V5 标签
SEQ ID NO 5His 标签
SEQ ID NO 10VS2 引物，正向 I
SEQ ID NO 11VS2 引物，反向 I
SEQ ID NO 12VS4 引物，正向 I
SEQ ID NO 13VS4 引物，反向 I
SEQ ID NO 14VS2 引物，正向 2&3
SEQ ID NO 15VS2 引 物，反向 2
SEQ ID NO 16VS4 引物，正向 2
SEQ ID NO 17VS4 引物，反向 2&3
SEQ ID NO 18VS4 引物，反向，STOP(终止)
SEQ ID NO: 19接头序列
SEQ ID NO 20接头序列
SEQ ID NO 25接头序列
SEQ ID NO 26接头序列


本发明涉及能够诱导抗沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)的保护性免疫应答的多肽。所述多肽包括具有与根据SEQ ID NO1的氨基酸序列至少90%同源性的第一氨基酸序列和具有与根据SEQ ID NO2的氨基酸序列至少90%同源性的第二氨基酸序列。此外，还提供了产生这些多肽以及包含它们的药用组合物。