专利名称：嵌合蛋白的制作方法传染性支气管炎病毒(IBV)禽传染性支气管炎病毒(IBV)是家禽的具有高度传染性(infectious)和感染性 (contagious)的病原，其主要在呼吸道中复制，但也在肠、肾和输卵管的上皮细胞中复制。 IBV是冠状病毒科(Coronaviridae)的成员，而且遗传学上非常相似的冠状病毒在火鸡和雉(pheasant)中引起疾病。IB的临床症状包括打喷嚏、气管罗音、流鼻涕和气喘(wheezing)。肉禽的体重增加减缓，而蛋禽则产蛋量下降。呼吸道感染使禽类容易产生二次细菌感染，其在幼禽 (chick)中可为致命的。病毒还能引起(特别是幼禽中)输卵管永久性损害，导致产蛋数量和质量下降；以及肾永久性损害，有时引起可为致命的肾病。活疫苗和减毒疫苗两者目前都用于IB疫苗接种。至今为止，最有效的疫苗是通过经胚胎蛋盲目重复传代以经验方法产生的减毒活疫苗。这种方法的问题是，在系列传代时，病毒的免疫原性下降。必需实现可接受的减毒程度使病毒安全和可接受的免疫原性损失使病毒疫苗仍然有效两者之间的平衡。减毒的 “平衡”是试错法(trial and error approach)，使得减毒过程的结果不确定。由于通过系列传代而减毒实际上是随机事件，因为减毒的分子基础未知，所以获得的疫苗没有清楚的遗传学定义。每批减毒病毒都不同，很难实现所得疫苗的一致性和体内预防/治疗效果的再现性。另一个缺点是胚胎蛋很昂贵，而且不能用作持久的病毒来源。病毒在胚胎蛋上的生长是个棘手的过程，因为每只蛋都必须灭菌、照检、接种病毒和孵育，然后从每只蛋收获少量的尿囊液，汇集然后纯化。高质量蛋的可靠供应不足导致可产生的疫苗量受到限制，特别是在紧急情况下。除了这些物流和供应问题，胚胎蛋作为疫苗生产的宿主系统还有其它局限。例如， 越来越多的对于存在外来病毒的关注，特别是蛋中的逆转录病毒，其会危害减毒活病毒疫苗的产生。因此需要可替换的IBV疫苗及其生产方法，从而不受上述缺陷所累。冠状病毒冠状病毒是在细胞质中复制且含有27至321Λ的非节段(unsegmented)、单链、正义RNA基因组的包膜病毒。所有冠状病毒脂质包膜都含有至少三个膜蛋白刺突糖蛋白(S)、膜内在蛋白 (M)，和小膜蛋白(E)。冠状病毒S蛋白是I类糖蛋白，其在内质网中低聚化并通过与膜蛋白之间的非共价相互作用而装配入病毒体膜。在并入冠状病毒颗粒后，S蛋白负责与靶细胞受体的结合以及病毒与细胞膜的融合。S糖蛋白由四个域组成在合成过程中切割的信号序列；外功能区，其存在于病毒体颗粒之外；负责将S蛋白锚定于病毒体颗粒脂双层中的跨膜区；和胞质尾区。IBV S蛋白(1162个氨基酸)被切割成两个亚基，Sl (535个氨基酸；90kDa)，包含 S-蛋白的N-末端部分，和S2 (627个氨基酸；84kDa)，包含S蛋白的C-末端部分。S2蛋白亚基与Sl亚基非共价结合，并含有跨膜和C-末端胞质尾区域。已经广泛报道Sl亚基包含S蛋白的受体-结合活性。例如，已显示对于血清组I冠状病毒，人冠状病毒HCoV_229E而言，在Sl的N-末端结构域中有截断的三个变体中的两个不能结合受体，表明氨基酸417和547之间的区对于受体结合是重要的(Bonavia 等(2003) J. Virol 77.2530-2538)。鼠肝炎病毒(MHV) S蛋白的769个残基Sl亚基的前330个氨基酸足以结合MHV 受体(Kubo等(1994) J. Virol. 68 =5403-5410)。相似地，SARS S蛋白的193个氨基酸片段 (残基318-510)结合于受体并阻断S-蛋白介导的感染(Wong等Q004) J. Biol. Chem. 279 3197-3201)。还据报道SARS-CoV S糖蛋白的氨基酸1_510代表含有受体结合位点(氨基酸 270-510)的域，所述位点类似于其它冠状病毒S糖蛋白的Sl亚基(Babcock等^)04) J. Virol. 4552-4560)。S蛋白是病毒的细胞嗜性的决定因素(Casias等Q003) J. Virol. 77 :9084-9089)。 已显示Sl蛋白的N-末端区中的氨基酸取代与鼠肝炎病毒(MHV)的病毒变体的扩展宿主范围相关(Thackray和Holmes Q004) Virology 324 :510-524)。而且，通常认为感染的种特异性是由于病毒-受体相互作用的特异性而产生的(Compton等(199 J. Virol. 7420-7428 ； Gagneten 等(1995)J. Virol. 69 :889-895)。因此，至今为止已经普遍认为细胞嗜性是冠状病毒的S蛋白的Sl域的性质。发明简述本发明的发明人令人惊讶地显示了冠状病毒的细胞嗜性由S2蛋白决定，并且用另一种冠状病毒的全部或部分取代S2蛋白能改变(扩展或缩小)病毒的细胞嗜性，取决于 S2蛋白所来源的病毒的细胞嗜性。这意味着不能在细胞系上生长的免疫原病毒疫苗可以通过取代其S2蛋白的全部或部分而诱导生长。因此，在第一方面，本发明提供嵌合冠状病毒S蛋白，其基于来自具有限制组织嗜性的冠状病毒株的S蛋白，但是包含来自具有扩展组织嗜性的冠状病毒株的至少部分S2亚基，使包含所述嵌合S蛋白的病毒具有扩展组织嗜性。嵌合S蛋白可以包含来自具有扩展组织嗜性的冠状病毒株的全部或部分S2亚基。例如，嵌合传染性支气管炎病毒(IBV)S蛋白可以包含部分S2序列，其在S2蛋白的对应于作为SEQ ID No. 1给出的序列的残基686和691之间的部分中包含序列XBBXBX， 其中B是碱性残基而X是任何氨基酸。序列XBBXBX可以，例如，是序列SRRKRS或SRRRRS。嵌合S蛋白可以在S2蛋白的对应于作为SEQ ID No. 1给出的序列的残基686和694之间的部分中包含序列SRRKRSLIE或 SRRRRSVIE。冠状病毒可以，例如是传染性支气管炎病毒(IBV)；犬冠状病毒(CCoV)；猫冠状病毒O^eCoV)；人冠状病毒229E(HCoV-2^E)；猪流行性腹泻病毒(PEDV)；传染性胃肠炎病毒(TGEV)；人冠状病毒NL63 (NL或New Haven)；牛冠状病毒(BCoV)；犬呼吸道冠状病毒(CRCoV)；人冠状病毒OC43(HCoV-OC4;3)；小鼠肝炎病毒(MHV)；猪血凝性脑脊髓炎病毒 (HEV)；大鼠冠状病毒(RCV)；火鸡冠状病毒(TCoV) ；HCoV-HKUI ；严重急性呼吸道综合征冠状病毒(SARS-CoV)；或火鸡冠状病毒(蓝冠病病毒(Bluecomb disease virus))。其中所述冠状病毒是IBV，具有扩展组织嗜性的IBV株可以是IBV Beaudette0在第二方面，本发明提供能编码根据本发明第一方面的嵌合S蛋白的核苷酸序列。本发明还提供包含根据本发明第二方面的核苷酸序列的质粒。在第三方面，本发明提供病毒颗粒，其包含根据本发明第一方面的嵌合S蛋白，和 /或根据本发明第二方面的核苷酸序列。病毒颗粒可以是重组痘苗病毒(rVV)或冠状病毒。病毒颗粒可为能在细胞系如Vero细胞上生长的。根据本发明第三方面的病毒颗粒对Vero细胞的感染可通过可溶性肝素阻断。在第四方面，本发明提供产生根据本发明第三方面的病毒颗粒的方法，所述方法通过下述步骤产生病毒颗粒(i)将如前面部分所述的质粒转染入宿主细胞；(ii)用重组病毒感染宿主细胞，所述重组病毒包含具有限制组织嗜性的冠状病毒株的基因组，缺少至少部分S2亚基；(iii)允许在质粒中的S基因序列和重组病毒基因组中的相应序列之间发生同源重组以产生嵌合S基因；和(iv)选择包含嵌合S基因的重组病毒。重组病毒可为痘苗病毒。为了产生重组冠状病毒颗粒，可以使用来自步骤(iv)的病毒DNA采用反向遗传系统(reverse genetics system)原位产生冠状病毒RNA0因此上述方法任选地包括步骤(ν)从来自步骤(iv)的重组病毒的DNA回收包含嵌合S基因的重组冠状病毒。在第五方面，本发明提供能够产生根据本发明第四方面的病毒颗粒的细胞。所述细胞可以，例如，是能使用反向遗传系统产生重组病毒的细胞，如原代鸡肾细胞，或者用根据本发明第四方面的病毒颗粒感染的细胞。用根据本发明第四方面的病毒颗粒感染的细胞可以源自细胞系，如Vero细胞。在第六方面，本发明提供包含本发明第四方面的病毒颗粒的疫苗。本发明进一步的方面提供(i)用于治疗和/或预防受试者中的疾病的方法，其包括对受试者施用根据本发明第六方面的疫苗的步骤；(ii)根据本发明第六方面的疫苗，用于治疗和/或预防受试者中的疾病；(iii)根据本发明第四方面的病毒颗粒在制造用于治疗和/或预防受试者中的疾病的疫苗中的用途。(iv)用于产生根据本发明第六方面的疫苗的方法，其包括用根据本发明第四方面的病毒颗粒感染Vero细胞的步骤；(ν)用于改变冠状病毒的细胞嗜性的方法，其包括用来自不同株的S2蛋白或其相应部分取代至少部分S2蛋白的步骤；和(vi)细胞培养物，所述培养物包含根据本发明第五方面的细胞或细胞群体。由于嵌合基因的存在而赋予病毒的扩展细胞嗜性意指用于疫苗产生的病毒储液可以通过在细胞系，而不是胚胎蛋或原代细胞上生长而产生。细胞系如Vero细胞的使用具有很多优势(i)先前已经对于病毒的生长和诊断目的进行了确证；(ii)细胞(并且因此病毒)能够在悬液而不是平板(flat bed)中生长；和(iii)可能实现一致的得率(yield)。附图简述图I-IBV S蛋白的示意图。功能S蛋白被糖基化并作为同源三聚体存在于病毒体膜中。Sl亚基的三聚形式构成受体结合结构域。图 2-显示来自 Beaudette(Beau-R)和M41 的 S 蛋白和嵌合 S 蛋白 BeauR_MlB2 (S)、 BeauR-B 1M2 (S)、Beau_S_M41-Hep 和 M41-S-Beau-Hep 的示意图。所有嵌合 S 蛋白的跨膜 (TM)结构域和胞质(胞)尾域均源自Beaudette S蛋白。S2亚基中硫酸乙酰肝素-结合位点的位置用HSBS表示。图3-含有嵌合S糖蛋白基因的质粒的产生。使用位于复制酶基因中的引物，跨越S1/S2接合点和基因3，通过PCR从两个质粒pGPT-M41S和pGPT-IBV4tuI-BamHI扩增 Beau-R和M41的Sl和S2亚基。使用重叠PCR合并亚基，形成嵌合S基因，然后用NsiI (位于复制酶基因中的限制位点)和BspEI (位于基因3中的限制位点)剪切所述基因。受体质粒pGPT-IBV-MuI-BamHI也用NsiI和BspEI剪切，并且通过凝胶提取而去除Beaudette S基因。将嵌合S基因连接入包含大肠杆菌鸟嘌呤黄嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)基因的残余 pGPT-IBV-MuI-BamHI 骨架中。图 4-pGPT-IBV4tuI-BamHI 和 pGPT_M41S 的图。使用质粒pGPT-IBV-MuI-BamHI 和 pGPT_M41S 通过 PCR 扩增 Beau-R 和 M41S1 和 S2亚基。S基因附近的复制酶基因和基因3源自Beaudette。pGPT_M41S中M41S基因的 C-末端已对Beau-R S基因C-末端进行交换，因为这是与M蛋白相互作用的区域。M41和 Beau-R S蛋白的C-末端彼此差别非常大，使嵌合S蛋白可与来自Beau-R的其它结构蛋白相互作用，决定保留Beau-R S基因C-末端。从pGPT-IBV4tuI-BamHI去除Beau-R S基因并将嵌合S基因插入到其位置，以生成质粒pGPT-SlM41S4eau和pGPT-SlBeauS2M41。图5-IBV反向遗传系统。由嵌合S基因和IBV基因组中部分相邻基因构建包含gpt的质粒载体。将质粒转染入用含有IBV基因组(缺少S基因)的rVV感染的Vero细胞中。在存在和不存在gpt 选择元件的情况下各进行三轮噬斑纯化，以选择含有嵌合S基因的rVV。在BHK-21细胞中制备大量病毒储液，从所述细胞纯化病毒并进行DNA提取。将VV基因组中的重组IBV cDNA 和表达IBV N蛋白的质粒转染入用rFPV-T7感染的CK细胞中。过滤上清并用于在CK细胞上的传代，并回收具有嵌合S基因的rIBV。图6-用多种IBV感染后48小时的感染Vero细胞。图7-Vero细胞上的rIBV生长的共焦显微术。用rIBV感染Vero细胞，并在感染后固定M小时，并用小鼠抗-dsRNA、二抗AlexaFluor 488羊抗-小鼠(绿色，Invitrogen) 免疫标记以检测IBV感染的细胞。所有细胞的细胞核用DAPI (蓝色)标记。图 8-rIBV 在 Vero 细胞上的生长动力学。用 Beau-R、M41-CK、BeauR_M41 (S)、 BeauR-MlB2 (S)、BeauR-B 1M2 (S)、Beau-S-M41-Hep 和 M41-S-Beau_H印以 0· 1 的多重性感染(multiplicity of infection)感染Vero细胞。在感染后1、12、24、48和72小时收获上清并在CK细胞上测滴度。进行三次重复并取平均值。误差线表示平均值的标准偏差。图9-用渐增量的可溶性肝素预处理的IBV在Vero细胞上的噬斑减少试验 (plaque reduction assay) 0图10-比较可溶性肝素对IBV感染的Vero细胞百分比的影响的柱状图。在感染Vero细胞之前，用PBS(-)或可溶性肝素，15mg/ml (+)在室温将IBV株Beau-R和 BeauR-MlB2(S)温育30分钟。感染后将细胞固定M小时，然后用小鼠α-dsRNA、二抗羊 α -小鼠IgG (绿色，Invitrogen)进行免疫标记，并用DAPI将核染成蓝色。通过40倍放大的共焦显微术每个样品分析十个视野，并计算感染细胞的百分比。图11-Beaudette (Beau-R)、Μ41、具有将硫酸乙酰肝素结合位点修饰成相应 Μ41序列的Beaudette (Beau-S-M41_H印)和具有Beaudette硫酸乙酰肝素结合位点的 M41(M41-S-Beau-Hep)。图12-Beaudette和M41的比较。a) S蛋白序列，和b) S2区。图13-M41和Beaudette S蛋白之间的氨基酸差异。图14-M41和Beaudette S2区之间的氨基酸差异。发明详述冠状病毒冠状病毒是属于冠状病毒科的动物病毒属。冠状病毒是具有正义单链RNA基因组和螺旋对称性的包膜病毒。冠状病毒的基因组大小从约27至32千碱基，是任何已知RNA 病毒中最长的。冠状病毒主要感染哺乳动物和鸟类的上呼吸道和胃肠道。冠状病毒的四至五种不同的目前已知的株感染人。最广为人知的人冠状病毒，可引起SARS的SARS-CoV，具有独特的发病机理，因为它可以引起上呼吸道和下呼吸道感染，还能引起肠胃炎。人们相信冠状病毒引起成年人中所有普通感冒的大部分。冠状病毒还引起农场动物和驯养宠物中的多种疾病，其中有些可为非常严重，且为对农业生产的威胁。农场动物的经济上重要的冠状病毒包括传染性支气管炎病毒(IBV)， 其主要引起鸟类中的呼吸道疾病，并严重影响全世界的家禽业；猪冠状病毒(感染性肠胃炎，TGE)和牛冠状病毒，两者均导致年幼动物中的腹泻。猫冠状病毒有两种形式，猫肠冠状病毒是临床影响较小的病原，但是这种病毒的自发突变能引起猫传染性腹膜炎(FIP)，一种与高死亡率相关的疾病。还有两类犬冠状病毒(CCoV)，一种引起轻微肠胃疾病，一种已发现引起呼吸疾病。鼠肝炎病毒(MHV)是引起具有高死亡率的流行性鼠病的冠状病毒，特别是在实验室小鼠群体中。冠状病毒可分成三组，如下所示第1 组 犬冠状病毒(CCoV) 猫冠状病毒(FeCoV)·人冠状病毒 229E (HCoV-229E) 猪流行性腹泻病毒(PEDV) 传染性胃肠炎病毒(TGEV) 人冠状病毒 NL63 (NL 或 New Haven)第2 组 牛冠状病毒(BCoV) 犬呼吸道冠状病毒(CRCoV)-常见于东南亚(SE Asia)和密克罗尼西亚(Micronesia)·人冠状病毒 0C43 (HCoV-0C43) 小鼠肝炎病毒(MHV) 猪血凝性脑脊髓炎病毒(HEV) 大鼠冠状病毒(RCV)。大鼠冠状病毒在东澳大利亚非常普遍，2008年三/四月， 在天然和野生啮齿动物群落中发现。 火鸡冠状病毒(TCoV)·(尚无通用名)(HCoV-HKUI) 严重急性呼吸道综合征冠状病毒(SARS-CoV)第3组 传染性支气管炎病毒(IBV)·火鸡冠状病毒(蓝冠病病毒)本发明的病毒可以是第1组冠状病毒如TGEV ；第2组冠状病毒如MHV ；或者第3组冠状病毒如IBV。IBV禽类传染性支气管炎(IB)是急性并且高传染性的鸟类呼吸道疾病，其引起严重的经济损失。疾病的特征为呼吸道症状，包括气喘、咳嗽、打喷嚏、气管罗音和流鼻涕。在年幼鸟类中，可发生严重的呼吸困难。在蛋禽中，呼吸困难、肾炎、产蛋量下降，和蛋内部品质与蛋壳品质降低是常见的。在肉禽中，咳嗽和发出咕噜声(rattling)是常见的临床症状，可在舍内所有禽只中快速传播。在未接种疫苗的群体中发病率为100%。发病率依赖于年龄、病毒株和二次感染而不同，但是在未接种疫苗的群体中可以达到60%。鉴定的第一种IBV血清型是Massachusetts (马萨诸塞型)，但是除了最初鉴定的马萨诸塞型，几种血清型包括Arkansas (阿肯色型)和Delaware (特拉华型)，目前正在美国传播。在禽胚中至少150次传代后得到IBV株Beaudette。对于成年鸟类，IBV Beaudette 不再是病原性的，但是能迅速杀死胚胎。图12和表1显示了 IBV Beaudette和M41之间的氨基酸差异。H120是商业化的活IBV Massachusetts血清型疫苗株，通过在胚胎禽蛋中约120 次传代而减毒。H52是另一 Massachusetts株，且代表在H120发展过程中更早且病原性略强的传代病毒(52代)。通常使用基于H120和H52的疫苗。S-蛋白冠状病毒S蛋白包含大量重度糖基化的外功能区，其在生物合成过程中由高尔基体中的弗林样酶(furin-like enzyme)切割为两个亚基(Si和S2)。并非所有冠状病毒都被切割，即使未切割，S蛋白的基本亚基结构仍是保守的。Sl包含受体结合域(1^等Q005) Science 309 1864-1868)，而S2包含融合体域。IBV的S蛋白在S1/S2边界被完全切割， 特别是在禽胚胎系统中。S2结构域含有五个域或功能区，如图1所示两个域，HRl和HR2形成螺旋结构，产生蛋白的杆状结构(stalk structure)；负责将蛋白锚定至病毒体膜的跨膜域；富含半胱氨酸的胞质域，负责与其它病毒结构蛋白相互作用；和第五个域，融合肽，负责病毒-细胞融合或细胞与细胞融合。M41和Beaudette S蛋白之间的氨基酸差异和S2区分别如图13和14所示。组织嗜性冠状病毒表现出强的物种和组织嗜性。同样地，IBV的临床分离株在体内和细胞培养物中显示不同的嗜性。M41株已经适应了在原代幼禽肾(CK)细胞上的生长，并且仅限于感染原代禽细胞，因此需要在胚胎蛋或CK细胞上生长。另一方面，已知Beaudette株能够感染培养物中的多种细胞，包括Vero和幼仓鼠肾(BHK)细胞。具有限制组织嗜性的冠状病毒能感染的细胞类型比具有扩展组织嗜性的冠状病毒少。具有限制组织嗜性的冠状病毒可以，例如仅限于感染原代细胞，而具有扩展组织嗜性的冠状病毒可(除了能够感染原代细胞之外)能够感染一种或多种细胞系。具有扩展组织嗜性的冠状病毒可以，例如，具有感染Vero细胞的能力。Vero细胞谱系1962年分离自从非洲绿猴(Cercopithecus aethiops)提取的肾上皮细胞。Vero细胞用于很多实验和临床目的，包括用作生长病毒的宿主细胞。Vero细胞谱系是连续的，可通过多次分化循环复制并且不会衰老。Vero细胞已被许可用于制造疫苗，并且目前用于生产脊髓灰质炎和狂犬病疫苗。具有限制组织嗜性的株可为免疫原性的并且能够诱导体内预防性或治疗性免疫应答。具有限制组织嗜性的株可为，例如，目前用于疫苗生产的株。对于IBV，其包括株如 H52、H120、Ma5、4/91、D41、D274*W93。具有限制组织嗜性的株可为或源自“野外”分离株如 BJl、BJ2 或 BJ3 (Li 禾口 Yang QOOl)Avian Pathol 30:535-541)。对于IBV，具有扩展组织嗜性的株可为，例如，IBV Beaudette，使得本发明的嵌合蛋白包含全部或部分IBV Beaudette S2蛋白。细胞嗜性可以通过用经病毒感染简单刺激给定的细胞类型而由实验建立。然后可以在一定传代次数后分析细胞病理效应(cpe)和合胞体形成程度，如实施例中所述。可以使用显微术分析感染细胞形态学上的变化。嵌合蛋白本发明涉及嵌合冠状病毒刺突蛋白(S蛋白)，其基于来自具有限制组织嗜性的冠状病毒株的S蛋白，但是其包含来自具有扩展组织嗜性的冠状病毒株的至少部分S2亚基。术语“基于”表示至少Sl域源自或可源自具有限制组织嗜性的株。嵌合蛋白还可以包含来自具有限制组织嗜性的株的部分S2域。例如，跨膜和/或胞质域可为源自或可源自具有限制组织嗜性的株。嵌合蛋白可包含来自具有扩展组织嗜性的冠状病毒株的全部或部分S2亚基。嵌合蛋白可包含位于，例如，IBV Beaudette的S2亚基中的硫酸乙酰肝素结合位点ο嵌合传染性支气管炎病毒(IBV)S蛋白可，例如，在S2蛋白的对应于如SEQ ID No. 1给出的序列的残基686和691之间的部分中包含序列XBBXBX(图12ABEAU-CK序列)， 其中B是碱性碱基，而X是任何氨基酸。例如，蛋白可在S2蛋白的对应于如SEQ ID No. 1给出的序列的残基686和691之间的部分中包含序列SRRKRS或SRRRRS。例如，蛋白可在S2蛋白的对应于如SEQ ID No. 1给出的序列的残基686和694之间的部分中包含序列SRRKRSLIE或SRRRRSVIE。嵌合蛋白可包含基本上全部S2序列部分，其是来自具有扩展组织嗜性的株的 N-末端至HRl域。嵌合蛋白可包含部分S2序列，其是来自具有扩展组织嗜性的株的N-末端至HRl域，以及HRl域。嵌合蛋白可包含部分S2序列，其是来自具有扩展组织嗜性的株的N-末端至HRl域，HRl域和HRl与HR2域之间的序列的部分。嵌合蛋白可包含部分S2序列，其是来自具有扩展组织嗜性的株的N-末端至HRl域，HRl域，HRl与HR2域之间的序列的部分和HR2域。嵌合蛋白可包含来自具有扩展组织嗜性的冠状病毒株的基本上全部S2亚基。嵌合蛋白可包含表1和图14中所示的S2区十九种氨基酸变化中的一种或多种。 具体地，嵌合蛋白可在位置687包含精氨酸残基，在位置689包含赖氨酸残基。嵌合蛋白还可在位置692包含亮氨酸残基。术语“基本上全部”表示嵌合蛋白包含野生型序列的相应部分的至少95%。缺失的氨基酸可以位于序列中任何位置，并且可为成组在一起(从而缺失序列的小部分)或单独的。当部分嵌合蛋白可源自给定株的S蛋白时，所述部分可具有与野生型序列的相应部分相同的氨基酸序列，或者与野生型序列相比，它可具有一个或多个氨基酸取代、添加或缺失，只要保留序列该部分的初始功能即可。术语“野生型”用于意指具有与天然蛋白(即病毒蛋白)相同的一级氨基酸序列的多肽。突变体序列可以天然产生，或者人工生成(例如通过定点突变)。突变体可与野生型序列的相应部分具有至少70、80、90或95%的序列同一性。突变体在野生型序列的相应部分可具有少于20、10或5个突变。同一性比较可通过目测进行，或者更通常地，在容易可用的序列比较程序的帮助下进行。这些商业上可得到的计算机程序可计算两个或多个序列之间的％同一性。进行这种比对的合适的计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit软件包(Unviersity of Wisconsin, U. S. Α. ；Devereux 等，1984，Nucleic Acids Research 12 :387)。能进行序列比较的其它软件的实例包括，但不限于，BLAST软件包(参见Ausubel等，1999ibid_第18章)、 FASTA (Atschul 等，1990，J. Mol. Biol.，403-410)和比较工具的 GENEffORKS 套装。BLAST 禾口 FASTA可用于离线和在线检索(参见Ausubel等，1999ibid，7-58至7-60页)。然而，对于有些应用，优选使用GCG Bestfit程序。一个新工具，称作BLAST 2 kquences也可用于比较蛋白和核苷酸序列(参见 FEMS Microbiol Lett 1999174(2) :247-50 ；FEMS Microbiol Lett 1999177(1) 187—8 禾口 tatianaOncbi. nlm. nih. gov)。序列可以具有一个或多个氨基酸残基的缺失、插入或取代，产生沉默变化并得到功能上等同的分子。只要能够保留活性，可基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两性性质的相似性进行故意的氨基酸取代。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；带有具有相似亲水性值的不带电的极性头基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可以，例如根据下表，进行保守取代。第二列中相同单元格内的氨基酸，并且优选第三列中相同行的氨基酸，可以互相取代。

本发明提供嵌合冠状病毒S蛋白，所述蛋白基于来自具有限制组织嗜性的冠状病毒株的S蛋白，但是其包含来自具有扩展组织嗜性的冠状病毒株的至少部分S2亚基，使包含所述嵌合S蛋白的病毒具有扩展组织嗜性。本发明还提供包含这种嵌合S蛋白的病毒。