嵌合传染性dna克隆，嵌合猪环状病毒及其用途[0001]本申请是专利申请号为02828049.0、国际申请日为2002年12月11日(国际申请号为PCT/US02/39646)、发明名称为“嵌合传染性DNA克隆，嵌合猪环状病毒及其用途”的发明专利申请的分案申请。[0002]对相关美国专利申请的交叉引用[0003]根据35U.S.§ 119 (e)的规定，本非临时申请要求申请日为2002年11月8日的美国临时申请号60/424,840的权益，而后者根据35U.S.§ 119 (e)的规定，要求申请日为2001年12月12日的美国临时申请号60/340，775的权益。以上两份在在先的专利申请，被以它们的全文形式收作本文参考。[0004]有关联邦资助的研究或开发的声名[0005]无[0006]对“序列表”的引用[0007]在本申请中所提供的记录在包含序列表文件的一张CD上的材料被收作参考。建立日期为_，2003,文件大小为大约_。[0008]发明背景

[0010]相关领域的说明
[0011]在本说明书中所引用的所有专利和文献都被以它们的全文形式收作本文参考。
[0012]猪环状病毒(PCV)最初是以猪肾细胞系PK-15的细胞培养物的污染物形式分离的(1.TiSCher等，“具有环状单链DNA的非常小的猪病毒”Nature295:64-66 (1982)；1.Tischer等，“永久性猪肾细胞系中乳多空病毒和小RNA病毒-样颗粒的鉴定”，Zentralbl.Bakteriol.Hyg.0tg.A.226 (2):153-167 (1974))。PCV 是小型二十面体无外被病毒，它含有大约1.76kb的单链环状DNA基因组。PCV属于环状病毒科，该科包括三种其他的动物环状病毒(鸡贫血病毒(CAV)，鹦鹉喙和羽毛病病毒(PBFDV)，和最近从鸽子体内发现的鸽子环状病毒(CoCV))，以及三种植物环状病毒(香蕉蔟顶病病毒，椰子叶腐病病毒和地三叶草矮化病毒(M.R.Bassami等，“鹦鹉喙和羽毛病病毒核苷酸序列分析及其与猪环状病毒，植物环状病毒和鸡贫血病毒的关系”，Virology 249:453-459 (1998)；J.Mankertz 等，“猪环状病毒(PCV)的转录分析”，Virus Genes 16:267-276 (1998)；
A.Mankertz等，“鸽子环状病毒(CoCV)-来自鸽子的新的环状病毒的克隆和测序”，Arch.Virol.145:2469-2479 (2000) ;B.M.Meehan等，“猪环状病毒DNA的序列:与植物环状病毒的亲和力”，J.Gen.Virol.78:221-227 (1997) ;B.M.Meehan等，“与猪衰竭性综合征相关的新型环状病毒DNAs的鉴定”，J.Gen.Virol.79:2171-2179 (1998);D.Todd等，“三种动物病毒与环状单链DNA基因组的比较”，Arch.Virol.117:129-135 (1991))。以上三种以前鉴定的动物环状病毒(PCV，CAV和PBFDV)的成员，彼此之间不拥有核苷酸序列同源性或抗原决定簇(M.R.Bassami等，1998，同上；D.Todd等1991，同上)。新鉴定的CoCV的基因组与PCV的基因组拥有大约40%的核苷酸序列同一性(A.Mankertz等，“鸽子环状病毒(CoCV)——来自鸽子的新的环状病毒的克隆和测序”，Arch.Virol.145:2469-2479 (2000))。最近，从与输血后肝炎相关的个体体内鉴定了一种被命名为输血传播的病毒或TT病毒(TTV)的具有环状基因组的新型人类环状病毒(H.Miyata等，“新的富含GC的113个核苷酸区的鉴定，以便完善第一种人类环状病毒TT病毒的环状单链DNA基因组”，J.Virol.73:3582-3586
(1999)；T.Nishizawa等，“与未知病因学的输血后肝炎的较高的转氨酶水平相关的新型DNA 病毒(TTV)”，Biochem.Biophys.Res.Commun.241:92-97 (1997))。另外，从正常血液供体体内鉴定了人类TTV-样小病毒(TLMV) (P.Biagini等，“ΤΤ病毒-样小病毒人类分离物的完整基因组和亚基因组序列的遗传学分析”，J.Gen.Virol.82:379-383 (2001)；K.Takahashi等，“直接与TT病毒和鸡贫血病毒相关的新的人DNA病毒(TTV-样小病毒，TLMV)的鉴定”，Arch.Virol.145:979-93 (2000))，并且还从患有输血后肝炎的人体内发现了被称为SEN病毒(SENV)的第三种新型人类环状病毒(T.Umemura等，“SEN病毒感染及其与输血相关的肝炎的关系”，Hepathology33:1303-1311 (2001))。两种人类TTV和TLMV的基因组组构与CAV的基因组组构类似(P.Biagini等，2001，同上；H.Miyata等，1999，同上；K.Takahashi等，2000，同上)。尽管PCV的抗体是在包括人类，小鼠，牛和猪的各种动物物种中发现的(G.M.Allan等，“猪环状病毒的单克隆抗体的生产，初步鉴定和应用”，Vet.1mmunol.1mmunopathol.43:357-371 (1994)；G.C.Dulac 和 A.Afshar，“PK-15 细胞系(ATCCCCL-33)中的猪环状病毒抗原和加拿大猪体内的环状病毒抗体的证据”，"Can.J.Vet.Res.53:431-433( 1989);S.Edwards 和 J.J.Sands，“英国猪体内环状病毒感染的证据”，Vet.Rec.134:680-1 (1994) ;J.C.Harding和E.G.Clark，“ 了解和诊断断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)”，Swine Health and Production5:201-203 (1997);R.K.Hines 和 P.D.Lukert,“猪环状病毒:在美国对猪的血清学监督”，Swine Health and Production3:71-73 (1995)；G.P.Nayar等，“患有呼吸病和流产的牛胎儿的环状病毒证据”，Can.Vet.J.40:277-278
(1999);1.Tischer等，“在不同的育种场的猪群体中猪环状病毒抗体的分布”，Arch.Virol.140:737-743 (1995)；1.Tischer等，“在人，小鼠和牛血清中与猪环状病毒抗体反应的存在”，Arch.Virol.140:1427-1439 (1995))，对所述动物物种PCV的致病作用的了解很少。具有PK-15细胞衍生的PCV的猪的实验感染不能产生临床疾病，因此，这种病毒不被认为是对猪有致病性的(G.M.Allan等，“猪环状病毒的病理学:缺少初乳的小猪崽的实验感染以及猪胎材料的检查”，Vet.Microbiol.44:49-64 (1995);1.Tischer等，“对猪环状病毒的流行病学和致病性的研究”，Arch.Virol.91:271-276 (1986))。将来自污染的PK-15细胞系的非致病性PCV命名为I型猪环状病毒或PCVl。
[0013]最早在1991年披露的断奶后多系统衰竭综合征(PMWS) (J.C.Harding和E.G.Clark，1997，同上)是断奶猪崽的复杂疾病，这种病正越来越广泛地传播。由于对养猪行业造成了潜在的严重经济学影响的威胁，已经迫切需要开发针对PMWS的主要致病剂PCV2的疫苗。PMWS主要影响5-18周龄的猪。PMWS的临床体征包括:进展性体重减轻，呼吸困难，呼吸急促，贫血，腹泻，和黄疸。死亡率可以在1%_2%之间波动，并且，在英国的某些复杂病例中，死亡率可以高达40% (M.Muirhead，“有关PMWS/TONS的信息来源”，Vet.Rec.150:456 (2002))。PMWS的微观病变特征包括肉芽肿性间质性肺炎，淋巴腺病，肝炎，和肾炎(G.M-Allan 和 J.A.Ellis，“猪环状病毒:概述”，J.Vet.Diagn.1nvest.12:3-14(2000) ；J.C.Hard ing和E.G.Clark，1997，同上)。PMWS现在业已在加拿大、美国的猪体内发现(G.M.Allan等，“来自患有衰竭性疾病综合征的猪体内的新型猪环状病毒”，Vet.Rec.142:467-468 (1998)；G.M.Allan等，“从美国和欧洲的患有衰竭性疾病的鸽子体内分离猪环状病毒-样病毒”，J.Vet.Diagn.1nvest.10:3-10 (1998)；G.M.Allan and J.A.Ellis,2000,同上；J.Ellis等，“从患有断奶后多系统衰竭综合征的猪的损伤中分离环状病毒”，Can.Vet.J.39:44-51 (1998)；A.L.Hamel等，“与猪断奶后多系统衰竭综合征相关的猪环状病毒的核苷酸序列”，J.Virol.72:5262-5267 (1998) ；M.Kiupel等，“与印度的断奶的猪的疾病相关的环状病毒-样病毒”，Vet.Pathol.35:303-307 (1998) ;R.Larochelle 等，“通过PCR确定的在魁北克常规养猪场中猪环状病毒发病率的鉴定”，Vet.Rec.145:140-142
(1999)；B.M.Meehan等，1998,同上；1.Morozov等，“在患有断奶后多系统衰竭综合征的猪体内检测猪环状病毒的新菌株”，J.Clin.Microbiol.36:2535-2541 (1998))，在大部分欧洲国家(G.M.A11 an等，“从美国和欧洲的患有衰竭性疾病的猪体内分离猪环状病毒样病毒”，J.Vet.Diagn.1nvest.10:3-10 (1998) ；G.M.Allan 和 J.A.Ellis, 2000,同上；
S.Edwards和J.J.Sands, 1994，同上；S.Kennedy等，“北爱尔兰的猪环状病毒感染”，Vet.Rec.142:495-4 96 (1998) ；A.Mankertz等，“来自西班牙，德国和法国的PCV-2分离物的鉴定”，Virus Res.66:65-77 (2000) ;C.Rosell等，“在患有猪皮炎的肾病综合征的猪的组织中鉴定猪环状病毒”，Vet.Rec.146:40-43 (2000);P.Spillane等，“爱尔兰共和国的猪环状病毒感染”，Vet.Rec.143:511-512 (1998);G.J.Wellenberg等，“从荷兰的具有断奶后多系统衰竭综合征的猪体内分离并且鉴定2型猪环状病毒”，Vet.Quart.22:167-72 (2000))以及在亚洲的某些国家(C.Choi等，“韩国猪的猪断奶后多系统衰竭综合征:通过免疫组织化学和聚合酶链式反应检测猪猪环状病毒感染”，J.Vet.Diagn.1nvest.12:151-153
(2000)；A.0nuki等，“从日本的患有衰竭疾病的猪的损伤中检测猪环状病毒”，J.Vet.Med.Sc1.61:1119-1123 (1999))都识别到了 PMWS。PMWS可能对世界范围内的养猪行业产生重大的经济影响。
[0014]PMWS的主要致病剂是被命名为2型猪环状病毒或PCV的PCV2致病菌株(G.M.Allan等，“来自患有衰竭性疾病综合征的新型猪环状病毒”，Vet.Rec.142:467-468
(1998)；G.M.Allan等，“从美国和欧洲的患有衰竭性疾病的猪体内分离猪环状病毒样病毒”，J.Vet.D iagn.1nvest.10:3-10 (1998) ;G.M.Allan 等，“从西班牙，丹麦和北爱尔兰的患有消瘦综合征的猪体内分离并且鉴定环状病毒”，Vet.Mi crobiol.66:115-23 (1999)；G.M.Allan 和 J.A.Ellis，2000，同上；J.Ellis 等，1998，同上；A.L.Hamel 等，1998，同上；B.M.Meehan等，1998,同上；1.Morozov等，1998,同上)。业已确定了与PMWS相关的PCV2的完整的基因组序列(M.Fenaux等，“来自北美洲不同地区的患有断奶后多系统衰竭综合征的猪的2型猪环状病毒(PCV-2)的遗传学鉴定，并且开发了示差PCV限制片段长度多形性分析，以便检测并且区分PCV-1和PCV-2 ”，J.Cl in.Mi crob i ο I.38:2494-503
(2000)；A.L.Hamel 等，1998，同上；J.Mankertz 等，1998，同上；B.M.Meehan 等，1997，同上；
B.M.Meehan 等，1998,同上;Ι.Morozov 等，1998,同上)。[0015]PCVl在猪体内是普遍存在的，但是，对猪来说不是致病性的。相反，在遗传学上相关的PCV2是致病性的，并且会导致猪出现PMWS。序列分析发现，与PMWS-相关的PCV2，和非致病性PCVl仅具有大约75%的核苷酸序列同一性。非致病性PCVl和致病性PCV2的0RF2基因编码主要免疫原性病毒衣壳蛋白(P.Nawagitgul等，“用于检测PCV抗体的修饰过的间接猪环状病毒(PCV) 2型和重组衣壳蛋白(0RF2)型ELISA)，Immunol.Clin.Diagn.LabImmunol.1:33-40 (2002)；P.Nawagitgul等，”编码主要衣壳蛋白的2型猪环状病毒的开放读框 2 “，J.Gen.Virol.81:2281-2287 (2000))。
[0016]通过接种PCV2，在常规猪体内再现临床PMWS的最初的尝试是成功的(M.Balasch等，“用来自患有断奶后多系统衰竭综合征的猪体内的组织匀浆实验接种常规猪”，J.Comp.Pathol.121:139-148 (1999);M.Fenaux 等，“克隆的 2 型猪环状病毒(PCV-2)的基因组 DNA在直接注射到SPF猪的肝脏和淋巴结中之后是传染性的:临床疾病，病毒分布和病理学损伤的鉴定”，J.Virol.76:541-551 (2002))。用来自患有天然存在的PMWS的组织匀浆和用细胞培养增殖的PCV2在限菌猪和常规猪体内进行的临床PMWS的实验性再现产生了混合的结果。在用PCV2和猪细小病毒(PPV)共同感染的限菌(SPF)猪和缺少初乳和剖腹产的猪体内再现了临床PMWS (G.M.Allan等，“通过用猪环状病毒和猪细小病毒共同感染猪实验性再现严重的衰竭性疾病”，J.Comp.Pathol.121:1-11 (1999) ;S.Krakowka等，“猪的病毒性衰竭综合征:通过用2型猪环状病毒和猪细小病毒共同感染在限菌猪体内实验性再现断奶后多系统衰竭综合征”，Vet.Pathol.37:254-263 (2000))，并且在用PCV2接种的限菌猪体内当通过用溶解在不完全弗氏佐剂中的匙孔嘁血蓝蛋白激活它们的免疫系统时，也再现了临床PMWS (S.Krakowka等，“免疫系统的激活是在受猪环状病毒_2 (PCV-2)感染的猪体内产生衰竭性疾病的关键事件”，"Vet.Pathol.38:31-42 (2001))。
[0017]在仅接种PCV2的剖腹产/缺少初乳的猪(⑶/⑶)体内(P.A.Harms等，“在同时用2型猪环状病毒和猪生殖性和呼吸道综合征病毒感染的⑶/⑶猪体内实验性再现严重疾病”。"Vet.Pathol.38:528-539 (2001))以及在用PCV2和猪细小病毒(PPV)或猪生殖性和呼吸综合征病毒(PRRSV)共同感染的常规猪体内(A.Rivora等，“用猪生殖和呼吸综合征病毒和猪环状病毒2实验性接种常规猪”，J.Virol.76:3232-3239 (2002))也能再现PMWS。在PRRSV/PCV2共同感染的情况下，PMWS特有的病理学体征，如淋巴样衰竭，肉芽肿性炎症和坏死性肝炎是由PCV2诱导的，而不是由PRRSV诱导的(P.A.Harms等，2001，同上)。不过，在仅用PCV2感染的限菌猪体内不能再现临床PMWS(G.M.Allan等，“用猪环状病毒2 (PCV2)和猪生殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)实验性感染缺少初乳的猪崽能加强PCV2复制”，Arch.Virol.145:2421-2429 (2000) ;G.M.Allan等，“用猪环状病毒和猪细小病毒实验性感染猪的系列研究:低温冷冻切片的免疫染色和病毒分离”，J.Vet.Med.47:81-94
(2000)；G.M.Allan等，“通过用猪环状病毒和猪细小病毒共同感染猪实验性再现严重衰竭疾病”，J.Comp.Pathol.121:1-11 (1999) ；M.Balasch 等，1999，同上 J.Ellis 等，“在限菌生物猪崽体内再现断奶后多系统衰竭综合征的损伤”，J.Vet.Diagn.1nves t.11:3-14
(1999)；S.Kennedy等，“通过仅用猪环状病毒2或与猪细小病毒组合感染常规猪再现断奶后多系统衰竭综合征的损伤”，J.Comp.Pathol.122:9-24 (2000) ；S.Krakowka 等，2001，同上；S.Krakowka等,2000,同上；R.M.Pogranichnyy等,“小猪对2型猪环状病毒感染的免疫应答的鉴定”，Viral.1mmunol.13:143-153 (2000))。在这些研究中所使用的病毒接种物是来自患有天然存在的PMWS的猪的组织匀浆，或是在PK-15细胞培养物中增殖的病毒(G.M.Allan等，“用猪环状病毒2 (PCV2)和猪生殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)实验性感染缺少初乳的猪崽能加强 PCV2 复制”，Arch.Virol.145:2421-2429 (2000) ；G.M.Allan 等，“用猪环状病毒和猪细小病毒实验性感染的系列研究:低温切片的免疫染色和病毒分离”，J.Vet.Med.47:81-94 (2000)；G.M.Allan等，“通过用猪环状病毒和猪细小病毒共同感染猪实验性再现严重衰竭疾病”，J.Comp.Pathol.121:1-11 (1999) ;M.Balasch 等，1999，同上；J.Ellis 等，1999,同上；S.Kennedy 等，2000,同上；S.Krakowka 等，2001,同上；S.Krakowka等，2000，同上；R.M.Pogranichnyy等，2000，同上)。由于组织匀浆可能含有其他常见的猪的致病剂，如PPV和猪生殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)(G.Μ.Allan等，“用猪环状病毒2(PCV2)和猪生殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)实验性感染缺少初乳的猪崽能加强PCV2复制”，Arch.Virol.145:2421-2429 (2000) ;G.M.Allan等，“通过用猪环状病毒和猪细小病毒共同感染猪实验性再现严重衰竭疾病”，j.Comp.Pathol.121:1-11 (1999)；G.M.Allan 和 J.A.Ellis,2000,同上；J.A.Ellis等，〃在患有自然获得的断奶后多系统衰竭综合征的猪中通过猪环状病毒和猪细小病毒进行共感染〃J.Vet.Diagn.1nvest.12:21-27 (2000) ;C.Rosell等，2000，同上)，并且由于采用PCVl持续感染用于PCV2增殖的ATCCPK-15细胞系(G.C.Dulac和A.Afshar，1989，同上)，这些研究所再现的临床疾病和病理学病变可能不完全是由于PCV2感染(G.M.All an等，“用猪环状病毒2 (PCV2 )和猪生殖和呼吸综合征病毒(PRRSV )实验性感染缺少初乳的猪崽，加强了 PCV2复制”Arch.Virol.145:2421-2429 (2000) ;G.M.Allan等，“用猪环状病毒和猪细小病毒实验性感染猪的系列研究:冷冻切片和病毒分离物的免疫染色” J.Vet.Med.47:81-94 (2000) ;G.M.Allan等，“用猪环状病毒和猪细小病毒共同感染猪而实验性再现严重衰竭疾病” J.Comp.Pathol.121:1-11 (1999) ;G.M.Allan和J.A.Ellis, 2000,同上;J.A.Ellis 等，2000，同上)。
[0018]在用猪肺炎支原体接种时，在PCV2接种过的⑶/⑶猪体内也能再现临床PMWS(G.M.Allan 等，“免疫刺激，PCV-2 和 PMWS”，Vet.Rec.147:171-172 (2000))。最近进行的两项野外研究(G.M.Allan等，“猪肺炎支原体的新生接种和断奶后多系统衰竭综合征:野外实验”，PigJ.48:34-41 (2001)，和.C.Kyriakis等，“免疫调节对断奶后多系统衰竭综合征的临床和病理学表达的影响”，J.Comp.Pathol.126:38-46 (2002))检测了通过猪肺炎支原体疫苗对地方性兽群PMWS发展的免疫调节作用，并且与接种过的动物相比，在未接种过的小鼠中出现了 PMWS病例的显著减少。不过，使用常规SPF小猪崽在受控制的实验室条件下进行的另一项最新研究，不能再现所述作用，这表明了用猪肺炎支原体免疫有可能影响临床PMWS的发展，但是，对于PCV2感染来说，它显然是一种次要因素。基于上述和其他研究，PCV2尽管被认为是PMWS的主要致病剂，但不是唯一的致病剂。
[0019]生物学纯形式的PCV2的传染性病毒原种的缺乏，业已妨碍了对PMWS中PCV2发病机理和PCV2的流行病学作用的了解。对PPV以及可能的PRRSV的免疫，没有一致性地表现出能抑制PCV2感染过的猪的PMWS的发作。因此，发现能特异性针对PMWS的安全的但仍然有效的疫苗一直是困难的。在兽医学领域确实认识到了需要生产能抗PCV2感染和PMWS的有效的、安全的疫苗。
[0020]美国专利号6，287，856 (Poet等)和W099/45956涉及来自鹦鹉喙和羽毛病毒(BFDV)的核酸，它是一种能感染禽类的环状病毒，和来自猪环状病毒(PCV)的核酸。以上专利提供了包括裸露的DNA或mRNA的疫苗组合物，并且披露了用于在真核细胞中瞬时表达PCV的核酸载体，这种载体包括源于人巨细胞病毒立即或早期基因增强子的顺式作用转录或翻译调控序列或与序列的核酸功能性连接的启动子。不过，由于PCV DNA仅仅是源于PK-15细胞系，它有可能包括在将近30年以前由1.Tischer等(1974，同上)发现的非致病性PCVl，因此，它不大可能有效地诱导针对PCV2或由PCV2诱导的感染的免疫应答。在所述专利中还提示了用包括开放读框的载体制备的重组蛋白的亚单位疫苗，不过，来自PCV的开放读框，彼此之间不能很好地表征或区分。由于PCV DNA的来源是PK-15细胞，用包括PCVl的开放读框的载体制备的蛋白，不具备针对PCV2的可靠的免疫原性特性(如果有的话)。 [0021]美国专利号6，217，883 (Allan等)和法国专利号2，781，159B涉及从加拿大，加利弗尼亚和法国(Brittany)的感染了 PMWS的猪体内采集的肺或神经结样品中分离五种PCV菌株，以及将它们与至少一种猪细小病毒抗原组合用于免疫原性组合物中的用途。由包括0RF1-0RF13的PCV2开放读框(ORF)编码的蛋白在专利文献中有广泛的披露，不过，没有任何一种具有免疫原性特性的特定蛋白的例子。所述专利还披露了包括DNA质粒，线性DNA分子，和重组病毒的载体，这些载体包括，并且能够在体内表达编码PCV抗原的核酸分子。若干其他的参考文献，例如，美国专利号6，391，314B1 ;美国专利号6，368，601B1 ；法国专利号 2，769，321 ;法国专利号 2，769，322 ；W001/96377A2 ；W000/01409 ；W099/18214 ；W000/77216A2 ；W001/16330A2 ；W099/29871 等，也披露了施用 PCVl 或 PCV 多肽或编码各种菌株的多肽的核酸。
[0022]不过，非致病性PCVl不能用于抗PCV2感染，而现有技术中所披露的致病性PCV2菌株即使是减毒的，也可能只具有有限的价值，因为活的病毒通常具有恢复它的有毒力状态的倾向。因此，本领域长期以来一直需要用于给猪接种的活的，传染性的，非致病性抗原，以便预防由PCV2导致的严重感染或PMWS，这种抗原是有效的，并且用在兽医疫苗中仍然是安全的。通过构建本文所披露的新型活的嵌合猪环状病毒实现了上述目的，这种病毒是以由1.Tischer等在大约30年前分离的非致病性PCVl的基因组主链为基础的。本发明的新型嵌合猪环状病毒能够满足所述长期的需要，包括独特并且有利于保留PCVl的非致病性表型，而又能诱导针对致病型PCV2的特异性免疫应答。


[0023]发明概述
[0024]本发明涉及可用作疫苗的猪环状病毒(PCV)的传染性嵌合DNA克隆和源于DNA克隆的活的嵌合病毒。所述新的、活的嵌合的、遗传学上无毒的病毒，是用非致病性PCVl基因组结构制备的，其中，用致病性PCV2菌株的免疫原性基因取代了 PCVl的基因，通常是在相同的相应位置上取代。本发明包括含有本文所披露的新的重组核酸分子的具有生物学功能的质粒，病毒载体等，用包括所述DNA的载体转染过的合适的宿主细胞以及免疫原性多肽表达产物。在本发明的范围内还包括保护猪免受由PCV2导致的病毒感染或断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的新方法，该方法包括给需要所述保护的猪施用免疫有效量的疫苗，例如，所述疫苗包括质粒上的克隆的嵌合DNA，源于所述嵌合DNA的嵌合病毒，由本文所述DNA表达的多肽产物等。本发明还提供了新的传染性PCV2分子DNA，和PCV的交互(reciprocal)嵌合DNA克隆，可将它用作获得或鉴定新型减毒病毒疫苗的实验模型。



[0025]下面将结合附图，对本发明的背景及其与现有技术的差别作进一步说明，其中:
[0026]图1表示传染性PCV2分子DNA克隆的构建。用于扩增完整的PCV2基因组的引物对的相对位置用箭头标出(反向引物PCVSAC2，正向引物PCVSAC2)。用SacII限制酶消化通过PCR扩增的PCV2基因组DNA，并且纯化，连接纯化的和SaCII消化过的基因组DNA，以便构成多联体。通过凝胶电泳分离连接的多联体，纯化SaCII的串联基因组二聚体，并且克隆到预先用SaCII酶消化过的pSK载体上，以便产生分子PCV2DNA克隆。
[0027]图2A和2B表示克隆的PCV2质粒DNA在体外感染PK-15细胞时是传染性的。图2A表示通过免疫荧光测定(IFA)，在用克隆的PCV2质粒DNA转染过的PK-15细胞中检测PCV2抗原。在转染细胞的细胞核中观察到了 PCV2抗原的强的免疫标记，而在细胞质中观察到了较弱的免疫标记。图2B表示模拟转染的PK-15细胞。
[0028]图3A表示来自第21DPI的通过淋巴内途径用PCV2DNA接种过的猪的肺。所述肺是橡胶状的，不能收缩，并且呈斑点状棕红色。气管支气管淋巴结明显扩大，并且是棕色的(箭头)。图3B表示来自对照猪的正常肺的显微镜切片(25X)。图3C表示来自图3A中的猪的肺的显微镜切片。注意支气管周淋巴组织细胞炎症和中度坏死性支气管炎(25X)。图3D表示图3A中肺的免疫组织化学染色。注意巨噬细胞中的PCV2抗原(箭头)和呼吸道周围的成纤维细胞样细胞(箭头的头部)(64X)。
[0029]图4A表示来自对照猪的正常淋巴结。注意界限明确的淋巴样滤泡(箭头)(25X)。图4B表示图3A的21天前通过淋巴内途径用克隆的PCV2基因组DNA接种过的猪的气管支气管淋巴结的显微镜切片。淋巴样滤泡形成较差，存在轻度至中度淋巴衰竭，和轻度多病灶肉芽肿样炎症(25X)。图4C表示图4B中的淋巴结的显微切片的更大的放大倍数，聚焦在一个滤泡。注意用巨噬细胞和巨大细胞(箭头)代替滤泡淋巴细胞所产生的分界较差的滤泡(64X)。图4D表示与图4B相同的淋巴结中，在巨噬细胞(箭头)和巨大细胞(小箭头)，和滤泡中树突样细胞(大箭头)中，PCV2抗原的免疫组织化学检测(64X)。
[0030]图5表示用携带致病性PCV2的免疫原性0RF2衣壳基因的非致病性PCVl基因组构建嵌合PCV1-2 (PCV1/PCV2)DNA克隆。用二聚化的DNA克隆体外转染PK-15细胞，以便产生能表达PCV2的0RF2蛋白的活的嵌合病毒，并且通过体内动物实验证实它的活性。
[0031]图6表示传染性PCV1，PCV2，嵌合PCV1-2和交互的嵌合PCV2-1分子DNA克隆的构建和组构。PCV2DNA克隆是通过以前所披露的通用方法，将两个完整长度的线性PCV2基因组串联连接在pBluescriptSK载体(pSK)上而构建的(M.Fenaux等,2002,同上)。PCV1DNA克隆是通过将两个完整长度的PCVl基因组串联连接在pSK载体上而构建的。嵌合PCV1-2DNA克隆是通过用PCV2的0RF2衣壳基因取代pSK载体的非致病性PCVl基因组主链上的PCV10RF2衣壳基因而构建的。交互的嵌合PCV2-1DNA克隆是通过用非致病性PCVl的0RF2衣壳基因取代pSK载体的致病性PCV2基因组上的致病性PCV2的0RF2衣壳基因而构建的。在PSK载体上，两种嵌合克隆都是二聚体。箭头表示PCR引物的相对位置，用于检测接种动物的PCVl，PCV2，PCV1-2和PCV2-1的病毒血症。
[0032]图7A-7J表示PCV1，PCV2，嵌合PCV1-2和交互的嵌合PCV2-1DNA克隆是传染性的，并且在体外转染到PK-15细胞时能表达相应的病毒抗原。左侧的照片(7A，7C，7E，7G和7I)是用抗PCV10RF2的单克隆抗体染色的。右侧的照片(7B，7D，7F，7H和7J)是用抗PCV2的抗体染色的。照片7A和7B是模拟转染的PK-15细胞。照片7C和7D是用PCV1DNA克隆转染过的PK-15细胞。照片7E和7F是用PCV2DNA克隆转染过的PK-15细胞。照片7G和7H是用嵌合PCV1-2DNA克隆转染过的PK-15细胞。照片71和7J是用交互PCV2-1DNA克隆转染过的PK-15细胞。[0033]图8表示克隆的PCV2分子DNA的完整长度DNA序列(它相当于SEQ ID NO:1)。
[0034]图9表示克隆的PCV1-2DNA的完整长度DNA序列(它相当于SEQ ID NO: 2)。
[0035]图10表示克隆的PCV1-2DNA的免疫原性0RF2衣壳基因的DNA序列(它相当于SEQID N0:3)。
[0036]图11表示嵌合的PCV1-2DNA的免疫原性0RF2衣壳基因的推测的氨基酸翻译(它相当于 SEQ ID N0:4)。

[0037]发明详述
[0038]根据本发明，提供了猪环状病毒(PCV)的传染性分子和嵌合核酸分子，由所述嵌合核酸分子生产的活的嵌合病毒，以及用于保护猪免受病毒感染或由PCV2引起的断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的影响的兽医疫苗。本发明还提供了可用作疫苗的免疫原性多肽表达产物。
[0039]PCV的新的、无毒的、传染性嵌合DNA分子(PCV1-2)，包括编码传染性，非致病性PCVl的核酸分子，它包括取代了 PCVl基因组中的ORF基因的致病性PCV2的免疫原性开放读框(ORF)基因。这种传染性嵌合PCV1-2DNA克隆优选包括克隆在传染性，非致病性PCV1DNA克隆的基因组主链上的PCV2DNA的免疫原性衣壳基因(0RF2)。一般来说，PCV2DNA的衣壳基因取代了非致病性PCVl基因组结构上的PCV1DNA的0RF2基因，但是，可以理解的是，能够通过遗传工程构建多种位置置换，以获得其它无毒或减毒的嵌合DNA克隆。PCVl和PCV2之间的交互的嵌合传感性PCV2-1DNA克隆作为对照分析本发明的嵌合PCV1-2克隆，并且是通过用PCVl的衣壳基因取代致病性PCV2传染性DNA克隆主链上的PCV2的衣壳基因而构建的。除了作为实验模型之外，所述交互嵌合PCV2-1DNA克隆可用于制备专门修饰过的疫苗。
[0040]本文所披露的克隆的PCV2的基因组DNA，在转染到PK-15细胞中并且给猪使用时，表现出体外和体内传染性。传染性PCV2DNA克隆在猪体内产生了 PMWS所特有的病理学损伤，使得能够更好地鉴定临床疾病，并且了解在所述组织细胞中的病毒分布。这种新的便于复制的致病剂，导致了它本身可以发展成用于防止猪出现PMWS的合适的接种过程。
[0041]通过体外转染PK-15细胞和给猪体内施用，所述新的嵌合PCV1-2DNA克隆同样是传染性的。在转染过的PK-15细胞中，嵌合的PCV1-2DNA克隆，能表达PCV2衣壳抗原(PCV2的免疫原性衣壳蛋白)，而所述交互嵌合PCV2-1DNA克隆能表达PCVl衣壳抗原。这一结果是通过用对PCVl或PCV2衣壳抗原特异的抗体通过免疫荧光测定(IFA)证实的。在用传染性PCV2克隆以及嵌合PCV1-2克隆接种过的猪体内检测到了 PCV2-特异性抗体的血清转变。PCV2-特异性抗体的血清转变的检测，确定了嵌合PCV1-2DNA克隆能在受感染的猪体内诱导PCV2-特异性抗体，并因此发挥保护接种过的猪免受PCV2感染的作用。
[0042]下面的实施例更详细地披露了所述嵌合DNA克隆在接种过的猪体内免疫原性和致病性的评估。大体上讲，向抗PCV20RF2抗原的抗体的血清转变，是在用PCV2DNA克隆(第3组)和嵌合PCV1-2DNA克隆(第4组)接种过的猪体内检测到的。用PCVl克隆和交互嵌合PCV2-1DNA克隆接种过的所有的猪(分别为第2和第5组)都能血清转变成PCVl抗体。从每一个组中选择的猪体内回收的病毒进行了部分测序，并且证实是用于所述接种的真实的相应的传染性DNA克隆。与用PCV1，嵌合PCV1-2和交互嵌合PCV2-1DNA克隆接种过的猪相比，用PCV2DNA克隆接种过的动物的各种组织中的肉眼可见和显微镜下的病变明显更严重。
[0043]令人吃惊的并且有利的是，具有克隆到非致病性PCVl基因组主链上的致病性PCV2的免疫原性衣壳基因(0RF2)的嵌合PCV1-2传染性DNA克隆，能诱导针对致病性PCV2衣壳抗原的特异性抗体应答，同时，它在猪体内独特地保留了 PCVl的非致病性性质。用嵌合PCV1-2传染性DNA克隆接种过的动物，发生了类似于PCVl接种动物的轻度感染，同时，发生了抗致病性PCV2的0RF2衣壳蛋白的抗体的血清转变。在用PCVl和嵌合PCV1-2接种过的动物体内观察到的病毒血症的平均长度，分别比致病性PCV2接种过的动物短0.625周和I周，后者的平均长度为大约2.12周。在某些接种过的动物体内缺乏可检测的嵌合PCV1-2病毒血症，并不影响在PCV1-2接种过的猪(第4组)体内向抗PCV20RF2衣壳蛋白的抗体的血清转变。以上结果表明，即使在某些接种过的动物体内嵌合PCV1-2病毒血症时间短或者是无法检测，但嵌合PCV1-2病毒仍然能够诱导针对PCV20RF2衣壳蛋白的抗体应答。嵌合的PCV1-2传染性DNA克隆诱导特 异于致病性PCV2免疫原性0RF2衣壳蛋白的免疫应答的特殊能力，对猪来说仍然是非致病性的，这使得这种嵌合PCV1-2克隆特别适合用作遗传学工程改造过的减毒活疫苗和其他类型的疫苗。
[0044]本发明的新的，纯化的，和分离的核酸分子，包括在SEQID NO: 2中和在图9中示出的克隆的嵌合PCV1-2DNA的完整长度DNA序列，并且以专利保藏号PTA-3912在美国典型培养物保藏中心保藏；它的互补链(即，反向和相对的碱基对)或与所述嵌合核苷酸序列具有至少95%的同源性的核苷酸序列(即完整基因的主要活性部分)。可以用本领域所熟知的常规方法，制备具有高度同源性的互补链或核苷酸序列，例如，通过本领域公知的标准或高严格性杂交技术制备。在SEQ ID N0:3和图10中同样示出了包括克隆的嵌合PCV1-2DNA的免疫原性衣壳基因的DNA序列的纯化的和分离的核酸分子。
[0045]含有所述嵌合核酸分子的合适的细胞，能独特地产生活的传染性嵌合猪环状病毒。正如本文所披露的,所述活的,传染性嵌合病毒是通过体外和体内转染PK-15细胞，由所述嵌合DNA克隆衍生的。克隆的嵌合PCVl-2DNA的优选例子，是在SEQ ID N0:2和图9中所示出的核苷酸序列。本发明还预计所述嵌合病毒源于所述嵌合核苷酸序列的互补链或与所述嵌合核苷酸序列具有至少95%同源性的高同源性的核苷酸序列。
[0046]本发明的范围还包括含有本文所披露的新的重组核酸分子的具有生物学功能的质粒，和病毒载体等，用包括所述嵌合的和分子DNA克隆的载体转染过的合适的宿主细胞以及免疫原性多肽表达产物。特别优选的免疫原性蛋白具有在SEQ ID N0:4和图11中所示出的氨基酸序列。本发明还包括它的生物学活性变体。本领域普通技术人员无需过多的努力，就可以了解如何修饰，取代，缺失来自所述多肽序列的氨基酸，并且生产保留了与亲本序列相同或大体上相同的活性的生物学活性变体等。
[0047]为了生产本发明的免疫原性多肽产物，所述方法可以包括以下步骤:以允许表达多肽产物的方式，在合适的营养条件下生长用本文所披露的新的重组核酸分子转染过的原核或真核宿主细胞，并且通过本领域已知的标准方法分离由所述核酸分子表达的需要的多肽产物。可以理解的是，所述免疫原性蛋白可以通过其他技术制备，例如，通过生物化学合成等。
[0048]嵌合病毒和分子DNA克隆的疫苗以及使用它们的方法同样包括在本发明范围内。接种过的猪能够免受严重病毒感染和由PCV2导致的PMWS。通过给猪施用免疫有效量的本发明的疫苗，所述新方法能够保护需要保护的猪免受病毒感染或PMWS，例如，包括免疫原性量的嵌合PCV1-2DNA的疫苗，克隆的嵌合病毒，含有PCV1-2的嵌合DNA的质粒或病毒载体，多肽表达产物，重组PCV2DNA等。可以将诸如PRRSV，PPV，其他传染性猪致病剂和免疫刺激剂的其他抗原同时提供给猪，以便提供针对病毒感染的广谱性保护。[0049]例如，所述疫苗包括传染性嵌合PCV1-2DNA，存在于合适的质粒或载体上的克隆的PCV嵌合DNA基因组，例如，PSK载体，无毒的、活的嵌合病毒，失活的嵌合病毒等，它们与无毒性的生理学上可接受的载体组合，并且任选与一种或多种佐剂组合。所述疫苗还可以包括本文所披露的传染性PCV2分子DNA克隆。传染性嵌合PCV1-2DNA，含有传染性嵌合病毒基因组的质粒DNA以及活的嵌合病毒是优选的，而活的嵌合病毒是最优选的。本发明的无毒的，活的病毒疫苗与使用减毒的，活的病毒的传统病毒疫苗相比具有优点，后者存在恢复有毒力状态的危险，或者杀伤细胞培养物增殖的所有病毒，可能不能诱导用于预防病毒性疾病的足够的抗体免疫应答。
[0050]可以与本发明的疫苗组合使用的佐剂是能增强所述猪对所述疫苗的免疫应答的佐剂。所述佐剂可以在与所述疫苗相同的时间和相同的部位使用，或者在不同的时间施用，例如，作为加强剂使用。佐剂还可优选以与施用疫苗不同的方式和部位给所述猪施用。合适的佐剂包括，但不局限于氢氧化铝(明矾)，免疫刺激复合物(ISC0MS),非离子嵌段聚合物或共聚物，细胞因子(如IL-1，IL-2，IL-1, IFN-α，IFN-β，IFN-Y等)，皂苷，单磷酰脂质A(MLA)，和胞壁酰二肽(MDP)等。其他合适的佐剂包括，例如，硫酸铝钾，从大肠杆菌中分离的热不稳定性或热稳定性肠毒素，霍乱毒素或它的B亚基，白喉毒素，破伤风毒素，百日咳毒素，弗氏不完全或完全佐剂等。在使用之前，可以使诸如白喉毒素，破伤风毒素和百日咳毒素的基于毒素的佐剂失活，例如，通过用甲醛处理使它失活。
[0051]所述疫苗还可以包括其他抗原，以便增强传染性嵌合PCV DNA克隆的免疫学活性，所述克隆如猪生殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)，猪细小病毒(PPV)，其他传染性猪致病剂和免疫刺激剂。
[0052]本发明的新的疫苗不局限于任何特定类型或制备方法。所述克隆的病毒疫苗包括，但不局限于传染性DNA疫苗(即利用质粒，载体或其他常规载体将DNA直接注射到猪体内)，活的疫苗，修饰过的活的疫苗，失活的疫苗，亚单位疫苗，减毒疫苗，遗传工程疫苗等。所述疫苗是通过本领域已知的标准方法制备的。
[0053]所述活的病毒疫苗通常是最需要的疫苗，就是说，能在所述疫苗受体内激活所有可能的免疫应答，包括系统性，局部，体液和细胞介导的免疫应答。另一方面，灭活的疫苗只能诱导体液免疫应答。不过，虽然活的病毒疫苗是最理想的，但是它具有若干缺陷，例如，受活的意外病毒剂污染的潜在危险或所述病毒在野外恢复毒力的危险。值得注意的是，本发明的独特的PCV1-2嵌合DNA克服了所述缺陷。仅使用致病性PCV2的免疫原性基因，所述嵌合DNA构成了活的，复制的嵌合病毒，它是非致病性的，但仍然能诱导活的病毒疫苗针对致病性PCV2病毒的全面的，有利的免疫应答。基于所述嵌合病毒的活的病毒疫苗，基本上少有恢复成致病性表型的机会(如果有)。因此，基于非致病性的PCVl的结构的新的嵌合病毒，与重组PCV2DNA病毒，任何活的，减毒的PCV2疫苗或任何其他类型的用于诱导针对PCV2感染的免疫的用于PCV2的疫苗相比，具有巨大的优点。
[0054]尽管活的病毒疫苗是最优选的，可用于接种猪的其他类型的疫苗具有本文所披露的新嵌合病毒和其他抗原。为了制备失活的病毒疫苗，例如，来自传染性DNA克隆的病毒增殖，是通过本领域已知方法或本文所披露的方法进行的。然后，通过本领域普通技术人员所普遍公知的方法优化系列病毒灭活。
[0055]失活的病毒疫苗可以通过用诸如福尔马林或疏水性溶剂，酸之类的灭活剂处理衍生自克隆的PCV DNA的嵌合病毒，通过用紫外线或X-射线辐射，通过加热等方法制备。灭活是通过本领域所了解的方法进行的。例如，在化学灭活中，用足够数量或浓度的灭活剂，在足够高(或低，这取决于所述灭活剂)的温度下或PH下，处理合适的病毒样品或含有所述病毒的血清样品足够的时间，以便使所述病毒失活。热灭活是在一定温度下进行足够长的时间以灭活病毒。辐射灭活是通过使用一定波长的光或其他能源进行足以使所述病毒失活的时间而进行的。如果所述病毒不能够感染易受感染的细胞的话，就认为所述病毒是失活的。
[0056]亚单位疫苗的制备通常不同于修饰过的活疫苗或失活的疫苗的制备。在制备亚单位疫苗之前，必须确定所述疫苗的保护性或抗原性成分。所述保护性或抗原性成分包括病毒衣壳蛋白的某些氨基酸区段或片段，它们能在猪体内产生特别强的保护性或免疫应答；单个或多个病毒衣壳蛋白本身，它们的寡聚体，以及病毒衣壳蛋白的高级缔合物(这种缔合物形成了病毒的亚结构或所 述亚结构的可识别的部分或单位)；存在于病毒表面上或病毒表面附近，或存在于病毒亚结构中的寡糖苷，糖脂或糖蛋白，如与病毒缔合的脂蛋白或脂基等。优选将衣壳蛋白，如由0RF2基因编码的蛋白用作所述亚单位疫苗的抗原性成分。还可以使用由所述传染性DNA克隆编码的其他蛋白。这些免疫原性成分可以通过本领域已知的方法方便地鉴定。一旦鉴定所述病毒的保护性或抗原性部分(即“亚基”)之后，就可以用本领域已知的方法纯化和/或克隆。所述亚单位疫苗与基于活病毒的其他疫苗相比具有优点，因为所述亚基，如病毒的高度纯化的亚基，与完整的病毒相比具有较弱的毒性。
[0057]如果所述亚单位疫苗是通过重组遗传学技术生产的话，举例来说，通过诸如0RF2 (衣壳)基因的克隆的亚单位的表达，可以通过本领域所公知的方法优化(例如，参见 Maniatis 等，^MolecularCloningiALaboratory Manual, 〃Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,MA.,1989)。如果所使用的亚单位体现了所述病毒的完整的结构特征，如作为完整的衣壳蛋白的话，从病毒中分离它的方法必须进行优化。在任何场合下，在对所述失活方法进行优化之后，在生产之前，可以对亚单位纯化方法进行优化。
[0058]为了用致病性克隆制备减毒的疫苗，首先通过本领域已知的方法对适应组织培养物的，活的，致病性的PCV2进行减毒(使它变成非致病性的或无害的)，通常是通过细胞培养而连续传代。致病性克隆的减毒，还可以通过基因缺失或病毒生产基因的突变而完成。然后，可以将减毒的PCV2用于构建其他嵌合的PCV1-2病毒，所述病毒保留了 PCVl的非致病表型，不过，在免疫原性性状的强度方面可以改变，所述性状是通过重组技术从PCV2基因组中选择的。
[0059]最优选的疫苗利用了活的嵌合病毒DNA克隆，特别是含有克隆在非致病性PCVl主链上的PCV2的免疫原性基因的克隆。有利的是，通过遗传工程构建的天然无毒的所述活的嵌合病毒，不需要花费时间的减毒过程。所述病毒能独特地用作活的，但是非致病性的复制型病毒，它能在病毒复制期间产生针对PCV2的免疫原性蛋白，所述蛋白随后能诱导针对致病性PCV2的完整范围的免疫应答。
[0060]作为另一个优点，本发明的优选的活的嵌合病毒提供了遗传学稳定的疫苗，所述疫苗比其他类型的减毒疫苗更便于制备，保存和送递。基于嵌合病毒的无毒和减毒疫苗，一般被认为是与传统的修饰的活的疫苗同样安全(如果不是更安全)(J.Airoyo等，“使黄热病毒/日本脑炎病毒嵌合疫苗(ChimeriVax-JE)的神经毒性减弱的分子基础”，J.Virol.75(2):934-942(2001)；F.Guirakhoo等，“在非人灵长类中重组嵌合黄热-2型登革热病毒是免疫原性的和保护性的”，J.Virol.74(12):5477-5485(2000)；S.Tang等，“针对脊髓灰质炎型猴免疫缺陷病毒疫苗:遗传稳定性和免疫原性之间的相关性”，J.Virol.71 (10):7841-7850(1997 ))。例如，针对日本脑炎 病毒(JEV)的ChimeriVax-JE疫苗，它是黄热病毒疫苗YFV17D的遗传工程衍生物，其中，编码YFV17D的结构蛋白prM和E的基因被减毒的JEV SA14-14-2株的相应的基因所取代，在体外和体内长期传代之后表现出遗传学稳定性(J.Airoyo等，2001,同上)。针对2型登革热的另一种嵌合病毒疫苗ChimeriVax-D2 (它是减毒的嵌合黄热病(YF))2型登革热(登革热-2)病毒是遗传学稳定的；据报导，它的序列在Veix)细胞中经过18次传代之后没有改变(F.Guirakhoo等，2000，同上)。
[0061]本发明的另一种优选的疫苗，利用合适的质粒将非致病性嵌合DNA克隆送递到猪体内。与使用活的或灭活的细胞培养物增殖的完整病毒的传统疫苗相反，本发明提供了用含有传染性嵌合病毒基因组的质粒DNA直接接种猪的方法。
[0062]本发明另一种需要的遗传工程疫苗是通过本领域已知技术生产的。所述技术包括，但不局限于进一步操作重组DNA，修饰或取代重组蛋白的氨基酸序列等。
[0063]例如，基于重组DNA技术的遗传工程疫苗，是通过鉴定编码负责诱导猪体内的较强的免疫或保护反应的蛋白的病毒基因的替代部分制备的(例如，源于0RF3，0RF4等的蛋白)。可以将所述鉴定的基因或免疫显性片段克隆到诸如杆状病毒载体的标准蛋白表达载体上，并且用于感染合适的宿主细胞(例如，参见O’ Reilly等，“杆状病毒表达载体:实验室手册”，〃Freeman & C0.，1992)。培养所述宿主细胞，以便表达所需要的疫苗蛋白，可以将所述疫苗蛋白纯化到需要的程度，并且配制成合适的疫苗产品。
[0064]如果所述克隆保持了任何不希望的导致发病的天然能力的话，还可以标出病毒基因组中决定毒力的核苷酸序列的位置，并且，通过诸如定点诱变的方法，对通过遗传工程改造使所述病毒无毒。定点诱变能够添加，缺失或改变一个或多个核苷酸(例如，参见Zoller等，DNA3:479-488，1984)。合成含有所需突变的寡核苷酸，并且与单链病毒DNA的一部分退火。将通过这种方法得到的杂合分子用于转化细菌。然后将分离的含有合适突变的双链DNA用于通过与后者的限制片段连接，生产完整长度的DNA，然后将所得到的DNA转染到合适的细胞培养物中。将所述基因组连接到合适的载体上，以便可以通过本领域普通技术人员所公知的任何标准技术实现转移。将所述载体转染到宿主细胞中，以便生产病毒后代，这一目的可以使用任何常规方法实现，如磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染，电穿孔，原生质体融合和其他众所周知的技术(例如，Sambrook等，"Molecular Cloning:A LaboratoryManual, "Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)。这样，克隆的病毒具有需要的突变。另外，可以合成包括所述合适的突变的两种寡核苷酸。可以让以上两种寡核苷酸退火，以便形成能够插入所述病毒DNA的双链DNA，从而生产完整长度的DNA。
[0065]例如，可用于疫苗中的遗传工程蛋白可以在昆虫细胞，酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。可以通过常规方法纯化或分离的所述遗传工程蛋白，能够直接接种到猪体内，以便产生对由PCV2导致的病毒感染或断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的预防作用。 [0066]可以用含有从病毒中获得的或由病毒基因组拷贝的编码所述病毒的一种或多种免疫显性蛋白的核酸分子的转移载体转化昆虫细胞系(如H1-FIVE)。例如，所述转移载体包括线性化的杆状病毒DNA和含有所需多核苷酸的质粒。可以用线性化的杆状DNA和质粒共同转染所述宿主细胞系，以便制备所述重组杆状病毒。
[0067]另外，可以将来自患有PMWS猪体内的，编码一种或多种衣壳蛋白的DNA，传染性PCV2分子DNA克隆或克隆的PCV嵌合DNA基因组，插入诸如痘病毒或腺病毒的活的载体内，并用作疫苗。
[0068]给需要预防病毒感染或PMWS的猪施用免疫有效量的本发明的疫苗。用于接种所述猪的免疫有效量或免疫原性量，可以通过常规实验方便地确定或方便地滴定。有效量是这样一种量:其中，获得了对所述疫苗的足够的免疫应答，以便保护接触能导致PMWS的病毒的猪。优选在一定程度上对所述猪提供保护，其中，所述病毒性疾病的一种至所有的不良生理学症状或作用均被明显减弱，缓解或完全抑制。
[0069]所述疫苗可以用单一剂量施用或用重复的剂量施用。例如，剂量可以为1-1000微克含有所述传染性嵌合DNA基因组的质粒DNA (取决于所述疫苗的免疫活性成分的浓度)，不过，应当不包括足以导致病毒感染的不良反应或生理学症状的量的基于病毒的抗原。根据猪的体重，抗原的浓度和其他常见因素确定或滴定活性抗原性制剂的剂量的方法，为本领域所公知。优选将所述传染性嵌合病毒DNA克隆用作疫苗，或在体外制备活的传染性嵌合病毒，然后将所述活的嵌合病毒用作疫苗。在这种情况下，可以给猪提供100-200微克克隆的嵌合PCV DNA，或活的嵌合病毒的大约10000 50%组织培养感染剂量(TCID5tl)。
[0070]所述疫苗优选给尚未接触PCV病毒的猪施用。含有所述嵌合PCV1-2传染性DNA克隆或其他抗原性形式的疫苗，可以方便地通过鼻内，经皮(即涂在皮肤表面上以便系统吸收)，肠胃外等途径施用。肠胃外施用途径包括，但不局限于肌内，静脉内，腹膜内，真皮内(即注射或以其他方式放置在皮肤下面)途径等。由于肌内和真皮内接种途径在使用病毒传染性DNA克隆的其他研究中业已获得成功(E.E.Sparger等，“通过注射猫免疫缺陷病毒分子克隆的DNA感染猫”，Virology 238:157-160 (1997);L.Willems等，“将牛白血病原病毒转染到绵羊体内”，Virology 189:775-777 (1992))，除了实际的鼻内施用途径之外，所述途径是最优选的。尽管不够方便，但也可以通过淋巴内接种途径将所述疫苗接种到猪体内。一种独特的，高度优选的施用方法，包括将含有PCV1-2嵌合体的质粒DNA通过肌内，真皮内，淋巴内途径等直接注射到猪体内。
[0071]在以液体形式施用时，本发明的疫苗可以水溶液，糖浆，酏剂，和酊剂形式制备。所述制剂为本领域所公知，并且通常是通过将抗原和其他常见的添加剂溶解在合适的载体或溶剂系统中制备的。合适的载体或溶剂包括，但不局限于水，盐溶液，乙醇，乙二醇，甘油等。例如，典型的添加剂是得到认证的染料，芳香剂，甜味剂，和抗微生物防腐剂，如硫柳汞(乙基汞硫代水杨酸钠)。所述溶液可以是稳定化的，例如，通过添加部分水解的明胶，山梨醇或细胞培养基，并且可以通过常规方法，用本领域已知的试剂缓冲，如磷酸氢钠，磷酸二氢钠，磷酸氢钾，磷酸二氢钾，以及它们的混合物等。
[0072]液体制剂可以包括含有与其他标准共同制备制剂组合的悬浮或乳化剂的悬浮液或乳液。以上类型的液体制剂可以通过常规方法制备。例如，悬浮液可以用胶体磨制备。例如，乳液可以用匀浆机制备。
[0073]为了注射到体液系统中而设计的肠胃外制剂，需要合适的等渗性并且将pH缓冲到与猪体液相当的水平。根据需要，可以用氯化钠和其他盐适当调整等渗性。可以将诸如乙醇或丙二醇的合适溶剂用于提高所述成分在制剂中的溶解度和所述液体制剂的稳定性。可用于本发明疫苗中的其他添加剂包括，但不局限于葡萄糖，常规抗氧化剂和常规螯合剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)。在使用之前，还必须对肠胃外剂型进行消毒。
[0074]本发明的另一种实施方案包括制备PCV1-2的传染性，非致病性嵌合核酸分子的新方法，该方法包括除去编码传染性非致病性PCVl的核酸分子的开放读框(ORF)基因，用编码传染性致病性PCV 2的核酸分子的免疫原性ORF基因取代所述相同的位点，并且回收所述嵌合核酸分子。所述核酸分子通常是DNA。优选的方法是用本文所披露的PCV2的传染性致病性分子DNA的免疫原性0RF2衣壳基因取代非致病性PCV IDNA的0RF2基因。可以理解的是，其他ORF位点或它的免疫原性片段，可以在PCV I和PCV 2DNA之间交换，以便按照本文所披露的方法构建减毒的传染性嵌合DNA克隆。
[0075]然后将所述重组核酸分子用于构建本发明的活的，传染性的，复制型嵌合病毒，所述病毒有利地保留了 PCV I的非致病性性质，并仍然能表达致病性PCV 2的免疫原性0RF2蛋白，并且诱导针对致病性PCV2的完整的免疫应答。所述PCV 1-2DNA克隆优选起着遗传工程改造的无毒的，活的疫苗的作用，可以在猪体内抗PCV 2感染和PMWS。
[0076]按本文所述方法，构建了 PCV 2的传染性DNA克隆，以便可以制备生物学纯的和均匀的传染性病毒原种，用于病理学研究和开发非致病性嵌合疫苗。与以往观察到的结果相比，通过使用这种分子DNA克隆和源于所述分子DNA克隆的生物学纯的和均匀的传染性PCV2病毒原种，可以更明显地表征与PCV2感染相关的临床疾病进程、病毒分布和病理学病变，这使得它本身可用于开发本发明需要的疫苗制品。
[0077]PCV2分子克隆是通过将两个拷贝的完整PCV2基因组串联在pSK载体上而制备的。与现有技术中所披露的单一拷贝基因组形成鲜明对照的是，通过本文所披露的方法制备的传染性DNA PCV2克隆包括以串联重复形式连接在一起的两个完整拷贝的PCV2基因组。将两个拷贝的基因组串联在一起，提供了模拟PCV2的常见环状基因组的类似的环状基因组。在传染性DNA PCV2克隆中具有两个串联的基因组拷贝的优点是，当所述传染性DNA克隆在体外和体内转染时，能够增强复制。因此，本发明的克隆能够比现有的单拷贝基因组更有效并且更经济地工作。
[0078]为了研究病毒复制的遗传决定因素和在宿主体内的毒力，用所述分子病毒克隆感染动物是极为有效的。业已将2型猪环状病毒(PCV2)认定为断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的致病剂。PMWS是猪的一种复杂的疾病综合征，并且在PMWS的临床表现方面涉及到多种因素。不过，由于其他常见的猪致病剂在患病猪的组织匀浆中的存在而导致的生产生物学纯形式的PCV2的难度，业已妨碍了仅仅由于PCV2感染所造成的临床疾病和病理学病变的明确表征。这是第一次构建了 PCV2的传染性分子DNA克隆，并用于表征通过用所述分子克隆直接体内转染猪而导致的与PCV2感染相关的疾病和病理学损伤。
[0079]在转染到PK-15细胞中时，证实了源于所述分子克隆的均匀的PCV2活的病毒原种是传染性的。所述克隆的PCV2基因组DNA在直接注射到无特定病原体(SPF)猪的肝脏和表浅回肠淋巴结中时，也是传染性的。用所述克隆的PCV2质粒DNA注射过的动物，出现了类似于通过鼻内接种均匀的，传染性PCV2活的病毒原种所诱导的感染和疾病。在接种后第35天(DPI)，来自接种过的组的大部分猪体内检测到向PCV2-特异性抗体的血清转变。
[0080]在用嵌合PCV1-2DNA克隆接种过的猪体内的病毒血症的发作和持续，类似于用非致病性PCV1DNA克隆接种过的猪，而在用PCV2克隆接种过的猪病毒血症比后者出现的更早并且持续更长时间。在大部分PCV2接种的动物体内检测到病毒血症始于第14DPI，并且持续大约2-4周。类似地，在35DPI进行尸体剖检的大部分接种过的猪，都发生了向PCV2-抗体的血清转变。在接种过的猪的各种组织和器官中都检测到PCV2抗原。肉眼可见的病变局限于肺和淋巴结，并且以全身增大的棕色淋巴结，不能收缩的肺和轻度多病灶棕色实变灶为特征。影响非致病性PCVl和嵌合PCV1-2接种的猪体内的淋巴结的肉眼可见的病变是轻度的，并且仅局限于少数动物，而致病性PCV2接种过的猪都具有淋巴组织的中度至重度肿胀和脱色(参见下面的表9)。统计学分析发现，嵌合PCV1-2接种的动物体内的淋巴结的肉眼可见的病变的评分，类似于非致病性PCVl接种的猪的肉眼可见的病变的评分。在21DPI，PCV2接种过的猪的肉眼可见的病变在统计学上比PCVl和嵌合的PCV1-2接种的猪更严重。在接种过的(感染过的)猪的多种组织和包括大脑，肺，心脏，肾脏，扁桃腺，淋巴结，脾脏，回肠和肝脏的器官中检测到了组织病理学病变和PCV2-特异性抗原。用PCV2分子DNA克隆以及由所述分子DNA克隆体 外制备的传染性病毒，在多种组织和器官中再现了类似于PMWS的组织病理学病变。在微观水平上，在21和49DPIs，嵌合PCV1-2接种过的动物，在统计学上比PCV2接种过的动物具有更小的显微镜下病变。在嵌合PCV1-2接种的猪的淋巴结中的显微镜下病变评分，类似于非致病性PCV1，交互的PCV2-1和未接种过的对照动物的评分。在致病性PCV2接种的动物的包括肺，肝脏，淋巴，脾脏，大脑，心脏，肾脏和扁桃腺组织的多种组织中，发现了中度至重度显微镜下病变。不过，在嵌合PCV1-2接种的动物体内，轻度至中度显微镜下病变仅局限于肝脏，淋巴结和肾脏组织(参见下面的表10)。
[0081]在对照或任何接种过的猪体内没有显著的PMWS临床体征。尽管用克隆的PCV2质粒DNA (传染性PCV2DNA克隆)或用生物学纯的PCV2传染性病毒原种没有观察到PMWS的特有临床症状，PCV2明显负责在以下说明性实施例中再现的PMWS样组织病理学病变。得到普遍认可的是，PCV2是决定临床PMWS发作的主要的，但不是唯一的致病剂。
[0082]本发明更明确地表征了仅仅由PCV2感染造成的临床进程和病理学病变。在下面的说明性实施例中所提供的数据表明，便于复制的克隆的PCV2基因组DNA，可用于取代传染性病毒，以便进行PCV2病理学和免疫研究。尽管证实了 PCV2是PMWS发展所必需的，诸如PRRSV，PPV等的其他因素或致病剂，可能是诱导与先前出现的PMWS病例相关的全部临床体征和病变所需要的。不过，由于了解到PCV2是关键因素，本发明的新的传染性，复制性病毒克隆，可以通过免疫学和分子遗传学领域普通技术人员所公知的方法进行进一步修饰或进行遗传工程改造，以便获得所需要的最佳免疫原性效果。
[0083]本文所披露的PCV2传染性DNA克隆的可利用性，使得它适合开发遗传工程减毒的疫苗，用于预防猪感染PCV2和PMWS。已知在天然感染期间，PCV2能在淋巴结，肺和肝脏中复制，并且主要病理学作用之一是通过降解淋巴样结构损伤免疫系统(S.Krakowka等，2001，同上；G.M.Allan 和 J.A.Ellis, 2000,同上；S.Kennedy 等，2000,同上；G.J.Wellenberg 等，2000，同上；G.M.Allan等，“通过用猪环状病毒和猪细小病毒共同感染猪实验性再现严重衰竭性疾病”，J.Comp.Pathol.121:1-11 (1999) J.Ellis等，“在限菌小猪崽体内再现断奶后多系统衰竭综合征的损伤”，J- Vet.Diagn.1nvest.11:3-14 (1999) ；J.C.Harding 和E.G.Clark, 1997，同上)。通过使用这种新的传染性PCV2分子DNA克隆，能够更明确地表征仅仅由PCV2导致的临床疾病，病理学病变和病毒分布 。
[0084]由于本文所披露的PCV2，PCV1，嵌合PCV1-2，和交互嵌合PCV2-1传染性DNA克隆的可利用性，能够更好地理解PCV基因的结构和功能关系。Will等，“克隆的HBV DNA能在黑猩猩体内导致肝炎”，Nature 299:740-742 (1982)首次证实了利用克隆的乙型肝炎病毒DNA通过直接体内注射感染黑猩猩的可行性。这种方法一直被用于研究若干种其他病毒的病毒复制和病理学(T.ff.Dubensky等，“将病毒和质粒DNA直接转染到小鼠的肝脏或脾脏中”，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 81:7529-7533 (1984) ;R.Girones 等，“能感染天然宿主的土拨鼠肝炎病毒的分子克隆的完整核苷酸序列”，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 86:1846-1849(1989)；N.L.Letvin 等，“操作 HIV 的风险”，Nature 349:573 (1991)；C.Seeger 等，“地松鼠肝炎病毒的克隆基因组在动物体内是传染性的”，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.81:5849-5852(1984) ；E.E.Sparger等，“通过注射猫免疫缺陷病毒分子克隆的DNA感染猫”，Virology238:157-160 (1997)；R.Sprengel等，“在体内DNA转染之后嗜肝DNA病毒基因组之间的同源重组:用于研究病毒传染性”，Virology 159:454-456 (1987) ；H.tffill等，1982，同上；L.Willems等，“将牛白血病原病毒活体转染到绵羊体内”，Virology 189:775-777(1992))。
[0085]在本发明中，传染性PCV2分子DNA克隆的构建，以及将克隆的PCV2质粒DNA直接注射到猪的肝脏和淋巴结内所导致的感染的证实，有利于PCV2研究。这种体内转染系统将会增强对PCV2基因的结构和功能关系的研究，利用在体外构建的重组质粒检测PCV2的不同区域或基因在宿主细胞中病毒复制和致病作用方面的作用。PCV2的复制和致病作用可以在体内研究，而没有必要通过在细胞培养物中增殖PCV2生产传染性病毒原种。这一点是有利的，因为系列细胞培养物传代，可能会选择病毒变体。使用克隆的PCV2基因组DNA取代活的病毒进行动物研究的另一个优点是，比较容易对接种的剂量进行定量。通过分光光度计，可以方便地测定用于动物接种的克隆PCV2DNA的量，而活的PCV2病毒的剂量需要在细胞培养物中进行传染力滴定，并且通过IFA证实感染。用克隆的PCV2质粒DNA直接注射动物，消除了与在动物研究中存在于组织匀浆接种物中的其他固有的猪致病剂相关的问题。
[0086]在本发明中，免疫原性0RF2衣壳基因在致病性PCV2和非致病性PCVl之间变换，以便产生嵌合的PCV1-2传染性DNA克隆的独特结构。令人吃惊并且有利的是，嵌合的PCV1-2传染性克隆能在体外和体内复制，表达所述免疫原性0RF2衣壳抗原，并且诱导针对PCV20RF2的特异性抗体应答，但是保留了 PCVl的非致病性质。嵌合的PCV1-2传染性DNA克隆具有诱导针对PCV2的强免疫应答的能力，同时仅诱导具有轻度病理学病变的有限感染，这种感染类似于非致病性PCVl的感染。对于疫苗开发来说，克隆DNA的比较便于保存和稳定性，以及重组PCV2质粒DNA和嵌合PCV1-2DNA克隆大规模生产的经济性，提供了将活的，传染性病毒DNA疫苗或遗传工程生产，减毒的病毒疫苗送递到猪体内的吸引人的手段，因此，在本发明中所披露的嵌合PCV1-2传染性DNA克隆，是抗PCV2感染和PMWS的有用的疫苗候选物。
[0087]应当理解的是，本文所使用的所有科学和技术术语具有本领域普通技术人员所普遍了解的相同含义。对于本发明来说，术语“传染性的”表示病毒能在猪体内复制，而无论所述病毒是否会导致任何疾病。“SFP”表示无特异性病原体的猪。“限菌”猪表示无菌猪。术语“PCV2质粒DNA”，“PCV2基因组DNA”和“PCV2分子DNA”可以相互交换使用，用来表示相同的克隆核苷酸序列。
[0088]传染性PCV1/PCV2嵌合DNA克隆(菌株名称“PCV1-2嵌合体”)，传染性PCV2分子DNA克隆(菌株名称“PCV2克隆”)和从患有严重PMWS的猪体内分离的并且确定为分离编号40895 (菌株名称PCV2#40895”)的源于PCV2的1wa样品的生物学纯的和均匀的PCV2原种，是按照布达佩斯条约的规定，遵照37C.F.R.§ 1.808规定的条件，在美国典型培养物保藏中心(ATCC), 10801University Boulevard, Manassas, Virginia20110-2209, U.S.A.保藏的。本文所披露的DNA序列包含在克隆到pBluescript SK ( + )载体(pSK) (StratageneInc.,La Jolla，CA)上的6，490bp的质粒内，并且转化到大肠杆菌DH5 α感受态细胞中。所述含有传染性嵌合PCV1-2DNA克隆(被确定为“嵌合猪环状病毒I型(PCVl)和2型(PCV2)传染性DNA克隆”)和传染性PCV2分子DNA克隆(确定为“2型猪环状病毒传染性DNA克隆(PCV2)”)的质粒业已于2001年12月7日交由ATC