专利名称：重组β淀粉样肽B细胞表位多肽嵌合抗原、其制备方法和应用的制作方法阿尔茨海默病(Alzheimer’ s disease, AD)是一种以认知功能障碍和记忆减退为主要临床特征的神经退行性疾病，是老年痴呆的主要形式。最新统计显示全世界大约有 2700万人受到AD的影响，而我国的AD患者高达1000万，并且每年以30万的速度增长，给社会和家庭造成了沉重的经济负担。目前临床上治疗AD的药物主要有乙酰胆碱酯酶抑制剂和NMDA (N-甲基-D-天冬酰胺)拮抗剂等，但是这些药物只能减轻患者的症状，却不能有效治疗AD。淀粉样蛋白级联假说(Amyloid cascade hypothesis)被认为是AD的致病机制。 淀粉样肽(β-amyloid，Αβ)由淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein, APP) 经β-分泌酶和Y-分泌酶剪切加工后生成，裂解为具有40、42或43个氨基酸的淀粉样肽 (Αβ)分子，具有自我聚合的能力，因而能够在细胞外聚集成寡聚体，导致纤维化进而形成淀粉样沉积。而阿尔茨海默病就是由于患者大脑内堆积了过多的Αβ，产生了神经毒性，直接导致了神经元功能的障碍及减退，或进而导致tau蛋白的过度磷酸化而产生神经纤维缠结，间接导致神经元功能的减退。目前人们普遍认为，过多的Αβ是诱发AD发病机制的核心，是AD形成和发展的关键；所以，以淀粉样肽(Αβ)为靶标，研制疫苗阻断或清除Αβ堆积，是预防和治疗阿尔茨海默病(AD)的一种有效策略。1999年，khenk等首次报道了利用人纤维化的Aβ 42多肽联合弗氏佐剂免疫AD 转基因小鼠(Tg2576)(参见 khenk D, et al.，Nature, 1999,400 :173-7)。此后，Elan 和 Wyeth采用A β 42进行了临床试验，但在II a期临床试验中，6%的受试者出现了急性脑膜炎，从而导致实验终止(参见 Orgogozo JM, et al.，Neurology, 2003,61 :46-54)。大多数人认为，出现脑膜炎的原因是产生了 Thl型细胞免疫反应(参见Cribbs DH, et al.， Int Immunol，2003，15 :505-14)。尽管如此，那些治疗后产生针对Aβ的抗体的患者相比未接受治疗的患者，认知能力下降的速度明显减缓(参见Hock C,et al. Neuron, 2003, 38 547-54) 0因此，只要避免免疫治疗后的有害副作用，以Αβ为靶标的主动免疫方法治疗阿尔茨海默病还是十分有希望的。经过分析得知，Αβ 42当中存在一个B细胞表位(第 1 15位)及两个T细胞表位(第17 21和四 42位)。这个重要发现使人们研究AD 主动免疫时更倾向于使用单独B细胞表位，并去除有害的T细胞表位，让疫苗达到促进抗体生成的目的，且从根本上避免之前临床试验所产生的Thl型细胞不良反应。基于以上研究结果，结合ΑΝ-1792疫苗在病人体内应用失败的原因，爱尔兰的Elan和美国的惠氏公司合作开发了一种新疫苗ACC-001，目前该疫苗正进行II期临床试验。ACC-001以白喉毒素突变体(CRM197)为载体蛋白，体外偶联Αβ多肽序列N端，以QS21作为佐剂。同时，Novartis公司制备的CAD106疫苗(Αβ多肽序列N端连接Qb颗粒)，Affiris公司制备的Affitope 疫苗(用一段短多肽模拟天然Αβ序列的一部分作为抗原成分)，以及Merck公司制备的 ν950(Αβ多肽序列N端连接ISC0MATRIX)也正在进行I或II期临床试验。最近，基于A β 表位的阿尔茨海默病DNA和重组病毒载体疫苗也得到了研究。除此之外，也可设计重组的免疫原作疫苗来治疗阿尔茨海默病；如Moretto等报道了重组Αβ多肽蛋白疫苗，利用大肠杆菌表达包含Αβ的重组蛋白ΤΓχ-4/8Αβ (1 15)，获得的重组蛋白经纯化后免疫小鼠， 产生了良好的免疫反应，可作为候选疫苗，但该重组蛋白抗原含有Trx蛋白不能够应用于人类，需要进一步优化改选(参见 Moretto N, et al. ,JBiological Chemistry, 2007, 282 11436-45)。目前研究的各种疫苗都有其缺点，如难以合成大量高度纯化的多肽表位疫苗，DNA 疫苗产生抗体水平相对较低等。好的AD疫苗应该能引起高的体液免疫反应，同时不产生自身T细胞反应。因此AD疫苗的研究策略是诱导机体产生高的体液免疫反应，清除大脑内的淀粉样斑块，改善病人认知能力，同时不产生自身T细胞反应。由于Αβ属于小分子多肽， 免疫原性较低，Αβ单独作为免疫原时难以达到预期的效果。因此，需要考虑偶联或融合辅助性T淋巴(HTL，Helper T lympocyte)细胞表位或含有丰富的T淋巴细胞表位的载体分子来达到提高抗原免疫原性的作用。辅助性T淋巴细胞表位在免疫反应诱导机体产生体液和细胞免疫反应中起着重要作用。因此，HTL表位可能在疫苗及其诱导的免疫反应起着关键角色，是疫苗抗原的重要组成部分。对于免疫原性弱或无T细胞表位的免疫原来说，必须加入HTL才能诱导或激发体内产生针对免疫原的抗体或细胞免疫反应。PADRE(Pan-DR helper T cell epitopes, AKAVAAWTLKAAA)是一个强的通用型HTL表位，研究表明偶联或嵌合入抗原的T细胞表位确实能够免疫调节和增强抗原的免疫反应。一些免疫原具有很强的免疫反应，含有丰富的T淋巴细胞表位，如白喉毒素或破伤风毒素等，不仅本身可能诱导机体产生针对自身的强免疫反应，而且同时其T淋巴细胞表位具有通用性，可通过其含有的HTL介导 (同时也作为载体分子)增强偶联或嵌合的抗原免疫反应。因此，B细胞表位，辅助T细胞表位，各种免疫佐剂，免疫途径的配合使用等也能够提高了疫苗的免疫效果。这些策略除了在制备多肽疫苗上的应用外，既可用于制备融合或嵌合蛋白等亚单位疫苗上，也可应用于制备AD的DNA疫苗。其目的是，针对Αβ的疫苗能够诱导高水平的Αβ抗体，清除大脑内的淀粉样斑块，改善认知能力，同时也能够避免治疗后有害的T细胞免疫副作用，因此以Aβ 为靶标的重组多肽嵌合抗原疫苗在阿尔茨海默病(AD)的预防和治疗中具有非常大的潜力和应用前景。
为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供重组β淀粉样肽B细胞表位多肽嵌合抗原、其制备方法，以及该抗原作为亚单位疫苗在阿尔茨海默病(AD)的预防和治疗药物中的应用。为实现上述目的，本发明首先提供的重组Αβ B细胞表位多肽嵌合抗原，其包括 5 6个串联的β淀粉样肽B细胞表位多肽抗原Αβ 1 15(即其第1 15位氨基酸， DAEFRHDSGYEVHHQ，简称Aβl5)，其优选的氨基酸序列如SEQ ID No. 18所示。优选地，本发明提供的重组Αβ B细胞表位多肽嵌合抗原为二聚体形式。这种二聚体形式的重组多肽嵌合抗原具有强的构象表位和弱的序列表位，是一种全新的重组抗原， 具有独特的结构特性，因此该亚单位疫苗对于AD有新的免疫治疗效果和特征。在本发明的另一个实施方案中，重组Αβ B细胞表位多肽嵌合抗原还包括辅助性T 细胞表位PADRE，其优选的氨基酸序列如SEQ ID No. 19所示。在本发明的又一实施方案中，重组Αβ B细胞表位多肽嵌合抗原还进一步包括毒素片段载体分子。其中，所述的毒素片段载体分子连接于所述多肽抗原A β 1 15的C端或N端。优选地，所述的毒素片段载体分子选自A型肉毒毒素或破伤风毒素的受体结合区或它们的片段。优选地，所述的毒素片段载体分子选自氨基酸序列如SEQ ID Νο.20 23(分别为 THc, THc-C, AHc和AHc-C的氨基酸序列)所示的毒素片段载体分子。本发明还提供制备上述重组Αβ 15多肽嵌合抗原的方法，包括先人工合成编码所述重组多肽嵌合抗原的基因，再将该基因与原核表达载体连接，通过原核表达系统获得可溶性重组多肽嵌合抗原蛋白的表达并将其纯化。本发明还提供编码上述重组Αβ 15多肽嵌合抗原的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNo. 1 2 和 SEQ ID No. 25 30 任一所示。本发明还提供含有所述基因的载体。本发明还提供所述的重组多肽嵌合抗原在防治和治疗阿尔茨海默病药物中的应用，优选作为亚单位疫苗用于防治和治疗阿尔茨海默病。本发明方法具有如下优点本发明人工合成编码所述重组多肽嵌合抗原的基因，通过原核表达系统获得了可溶性表达并且纯化后作为重组多肽嵌合抗原的亚单位疫苗，低剂量免疫小鼠后均能产生很好的免疫反应。其中6々0 15-11重组抗原的抗4 0抗体高于6Αβ 15和人工合成的多肽Αβ免疫组，也高于Trx-4Ai3 42抗原免疫产生的抗体水平，表明其具有良好的应用能力。然后，6Αβ15-Τ和毒素片段载体分子(如A型肉毒毒素或破伤风毒素受体结合区He， AHc基因序列见专利ZL200710089588. 2和序列表中SEQ ID No. 4，THc为本发明人工合成的基因，见序列表中SEQ ID No. 3)融合为不同的重组分子如6Αβ 15-T-AHc/THc，和AHc/ THc-ΘΑβ 15-T等，其通过原核表达系统获得了可溶性表达并且纯化后作为重组多肽嵌合抗原疫苗，免疫小鼠后产生了良好的免疫反应，其抗Αβ抗体高于6Αβ 15-T抗原免疫组，表明这些载体分子介导免疫调节并提高了抗Aβ的抗体，并且无针对Aβ的T细胞免疫反应， 其免疫反应为Th2型，具有更好的应用能力。更为重要的是，以上这些重组多肽嵌合抗原免疫转基因APP-AD模型小鼠同样也能够诱导产生高滴度的抗Αβ抗体，并且该免疫原没有引起针对Αβ的T细胞增殖反应，其主要抗体亚型为IgGl型，说明引起的免疫完全偏向于Th2 型免疫反应。另外，这些免疫血清抗体体外能够与不同形式的Aβ结合情况不同，而与寡聚体结合更强烈。目前，许多研究表明Αβ寡聚体才是导致阿尔茨海默病的主要原因(Klein WL, et al. Trends in neurosciences, 2001, 24 (4) :219-2 )，观察疫苗免疫后血清与不同状态A β结合状况能够在一定程度上反映疫苗的治疗效果，基于这一免疫特性提示本发明的重组多肽嵌合蛋白抗原疫苗能够产生与Αβ可溶性寡聚体具有高亲和力的抗体。另外， 通过免疫组化证实该重组多肽嵌合抗原免疫后转基因模型小鼠脑组织切片中Aβ淀粉样斑块得到了明显的减少。行为学指标观察结果表明，免疫组的(水迷宫)学习记忆能力都得到了明显的改善和提高。以上这些结果表明重组多肽疫苗具有独特的结构和免疫反应特性，有望作为阿尔茨海默病的免疫预防和治疗的新型疫苗候选，具有良好的应用前景和研究价值。本发明制备的重组多肽嵌合抗原疫苗具有良好的免疫原性，其可避免大量化学合成多肽的昂贵费用，且细菌表达蛋白工艺相对成熟，是AD疫苗的一种理想选择。本发明采用毒素片段(含有通用型T细胞表位)作载体分子提高AD疫苗针对A β的免疫反应是新发展方向。以上这些疫苗及策略扩展了 AD研究和应用的潜力，为疫苗的研发提出了许多新的思路，对寻找合适的针对AD病的疫苗具有重要的意义。图1为纯化的重组多肽嵌合抗原SDS-PAGE结果。泳道1 8分别为6Αβ 15、 6Αβ 15-Τ、6Αβ 15-T-AHc-C、AHc-5A3 15_Τ、6Αβ 15-T-THc、THc_5A β 15_Τ、6Αβ 15-T-THc-C 和 χ-4Αβ42，泳道M为低分子量蛋白Marker，分子量范围从上往下依次为116、66、45、 35、25、18 和 14. 4KD。图2为重组多肽嵌合抗原6Αβ 15-Τ分子量测定(图2Α)和肽谱分析(图2Β)结^ ο图3为重组多肽嵌合抗原Wfestern blot鉴定结果。泳道1 8分别为6Αβ 15、 6Αβ 15-Τ、6Αβ 15-T-AHc-C、AHc-5A3 15_Τ、6Αβ 15-T-THc_C、6A β 15-T-THc、THc_5A β 15-Τ 和Trx-4Ai3 42，泳道M为预染分子量蛋白Marker，分子量范围从上往下依次为170、130、 95、72、55、43、34 和 26。图4为重组多肽嵌合抗原与人工合成的多肽抗原免疫小鼠后的抗体滴度及亚型的比较结果。图5为含毒素片段载体分子的重组多肽嵌合抗原免疫小鼠后的抗体滴度及亚型分析。其中A为AHc和AHc-C作为载体分子介导的重组多肽嵌合抗原；B为THc和THc-C作为载体分子介导的重组多肽嵌合抗原。图6为特异性刺激的T淋巴细胞产生的细胞因子分析。其中，A为细胞因子IL-4 水平；B为细胞因子IFN-Y水平。Aβ、T和PBS是指分别用Aβ 42、PADRE和PBS(无抗原刺激)特异性刺激的T淋巴细胞产生的细胞因子水平。图7为重组多肽嵌合抗原免疫APP转基因AD模型小鼠后的各阶段的抗体水平。图8为重组多肽嵌合抗原免疫APP转基因AD模型小鼠后血清中的抗体滴度及亚型分析。图9为各免疫血清与不同状态A β结合的斑点杂交结果图。图10为各组小鼠在Morris水迷宫的学习和记忆能力结果。图11重组多肽嵌合抗原疫苗减少了 13个月龄APP模型小鼠脑内淀粉样斑块含量的脑组织切片免疫组化染色图。进一步将THc全长和其C端基因与6Αβ -T融合后克隆入原核表达载体以制备重组多肽抗原。如，以质粒pMD18-THc(含人工合成的编码破伤风毒素受体结合区Hc基因THc)为模板，在引物F-THC-S(见序列表中SEQ ID No. 11)和引物R-THC-X(见序列表中SEQ IDNo. 12)的引导下，PCR扩增THc基因序列(见序列表中SEQ ID No. 3 ；其编码 THc的432个氨基酸，即884 131fea，氨基酸序列见序列表中SEQ ID No. 20)，PCR反应体系为 50 μ 1，其中 pfu Taq 0. 5μ 1,10 X buffer (plus Mg2+) 5 μ 1，dNTP (各 25mM) 4 μ 1， 引物各 0. 5 μ 1，补水足 50 μ 1，PCR 反应条件为 95°C 3min，94°C 50s, 62°C 50s, 72°C 120s, 共25个循环，72°C IOmin,并在序列两端分别添加Mc I和Bio I识别位点，反应结束后， 对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，用DNA回收试剂盒回收长度约1300bp的目的片段并对其进行纯化，将回收片段用I和》!0 I进行双酶切后与经相同酶双酶切的载体pTIG-Trx-6Ai3 15-T-AHc连接，将连接产物转化大肠杆菌(E. coli)DH5 α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，测序，测序结果表明得到了序列及插入位置均正确的6Αβ15-Τ 与THc融合的重组原核表达载体，命名为pTIG-Trx-6A0 15-T-THc (6Αβ 15-T-THc基因的核苷酸序列，见序列表中SEQ ID No.28)。相同方法，以质粒pMD18_THc为模板，在引物 F-THC-CS(见序列表中SEQ ID No. 13)和引物R-THC-X(见序列表中SEQ ID No. 12)的引导下，PCR扩增THc基因C序列(编码THc的219个氨基酸，S卩1097 131fea，命名为THc-C，氨基酸序列见序列表中SEQ ID No. 21)，经Me I和Xho I双酶切后与经相同酶双酶切的载体pTIG-Trx-6 A β 15-T-AHc连接，替换AHc，获得测序结果表明得到了序列及插入位置均正确的6 Αβ 15-Τ与THc-C融合的重组原核表达载体，命名为pTIG-Trx-6 A β 15-T-THc-C (6Αβ 15-T-THc_C基因的核苷酸序列，见序列表中SEQ ID No. 29)。进一步将THc与A β 1 15的N端融合，构建其原核表达载体。以质粒pMD18_THc 为模板，在引物F-THC-A β (见序列表中SEQ ID No. 14)和引物R-THC-A β (见序列表中SEQ IDNo. 15)的引导下，PCR扩增THc基因序列，PCR反应体系为50 μ 1，其中pfu Taq 0. 5μ 1, IOXbuffer (plus Mg2+) 5 μ 1，dNTP (各 25mM) 4 μ 1，引物各 O. 5 μ 1，补水足 50 μ 1，PCR 反应条件为 95°C 3min，94°C 50s，62°C 50s, 72°C 120s，共 25 个循环，72°C lOmin，并在序列两端分别添加EcoR I和Hind III识别位点，反应结束后，对PCR扩增产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳检测，用DNA回收试剂盒回收长度约1300bp的目的片段并对其进行纯化，将回收片段用EcoR I和Hind III进行双酶切后与经相同酶双酶切的载体pTIG_Trx-6Ai3 15-Τ连接，将连接产物转化大肠杆菌(E.Coli)DH5a感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，测序， 测序结果表明得到了序列及插入位置均正确的THc与5 A β 15-Τ (6 Αβ15_Τ经EcoR I 和Hind III双酶切后连接后去除了一个拷贝Αβ 15)融合的重组原核表达载体，命名为 pTIG-Trx-THc-5A3 15-Τ (THc-δΑβ 15-Τ 基因的核苷酸序列，见序列表中 SEQ ID No. 30)。最后，构建了一个表达4Αβ42抗原的载体，利用Trx基因中存在的BamH I (GGATCC)位点(Trx基因存在于pTIG-Trx表达载体中，见专利:ZL200710089588. 2)，将其N端与Trx融合，获得了可表达重组融合蛋白的表达载体。具体构建过程如下以质粒 PMD18-4A β 42 (含人工合成的编码4个拷贝A β 42基因)为模板，在引物F-A β 42 (见序列表中SEQ IDNo. 16)和引物R-A β 42 (见序列表中SEQ ID No. 17)的引导下，PCR扩增 4Α β 42基因序列(见序列表中SEQ ID No. 5)，PCR反应体系为50 μ 1，其中pfu Taq 0. 5μ 1, IOXbuffer (plus Mg2+) 5 μ 1，dNTP (各 25mM) 4 μ 1，引物各 O. 5 μ 1，补水足 50 μ 1，PCR 反应
9条件为 95°C 3min,94°C 50s, 62°C 50s, 72°C 60s，共 25 个循环，72°C lOmin，反应结束后，对 PCR扩增产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳检测，用DNA回收试剂盒回收长度约500bp的目的片段并对其进行纯化，将回收片段用BamHI和)(h0 I进行双酶切后与经相同酶双酶切的载体 pTIG-Trx连接，将连接产物转化大肠杆菌(E.Coli)DH5a感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，测序，测序结果表明得到了序列及插入位置均正确的4Αβ 42与Trx融合的重组原核表达载体，命名为pTIG-Trx-4A β 42。二、重组多肽抗原在大肠杆菌中的表达及表达产物的纯化1.重组多肽抗原在大肠杆菌中的表达及表达产物的SDS-PAGE检测将步骤一构建的9个重组原核表达载体转化大肠杆菌BL21(DE!3)感受态细胞 (TIANGEN公司)，筛选阳性重组子，以转化有pTIG-Trx空载体的重组菌为阴性对照，然后按1 100的比例将阳性重组菌接种至含lOOmg/mL氨苄青霉素的500mL的LB液体培养基中，在37°C、250rpm下进行大量培养，培养至对数生长期(0D_约为0. 4 0. 6)时加入化学诱导剂IPTG至终浓度为0. 2mmol/L，在16°C下继续诱导培养12小时。培养结束后，离心收集菌体，重悬于20mM磷酸钠缓冲液中(pH 8.0)，超声打碎细胞，离心收集上清进行12% SDS-PAGE检测，结果表明，经诱导表达的重组蛋白都获得了表达并能够以可溶性方式存在， 而未诱导的菌株和诱导的空载体对照未出现该目的蛋白带，说明所表达的蛋白可能就是目的蛋白即重组多肽抗原。2.表达产物的纯化及鉴定步骤1所表达的重组多肽嵌合抗原的C端含有六个组氨酸标签，因此用Ni-NTA 亲和层析柱(购自法玛西亚公司)并参照说明书对可溶性表达产物进行纯化，得到洗脱纯化蛋白，然后对经纯化的蛋白进行12% SDS-PAGE检测，检测结果表明得到了纯化的目的蛋白。图1所示是其中8种目的蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳图。除Trx_4A β 42蛋白是A β 42 与Trx融合表达外，其他蛋白是与Trx同时表达，但分为二个阅读框。另外，可进一步对第一步纯化产物进行Q/SP阴/阳离子交换柱纯化，以获得更高的纯化产物，可达到95%以上。 其中获得6Α β 15和6Α β 15-Τ为二聚体形式，分子量分别为M和^KD (其中单体分子量分别为12和14KD)，其中对6Α β 15-Τ进行了分子量测定和肽谱分析，进一步确定其为二聚体， 并且是符合设计的6Αβ 15-Τ，如图2。图2Α显示为6Αβ 15-Τ的分子量，经强力处理后大部分为单体即14KD，仍然有部分为分子量为^KD的二聚体。图2Β显示为6Αβ 15-Τ的肽谱分析，有符合设计的多肽成份，表明为6Αβ 15-Τ多肽嵌合抗原。另外，具有二聚体结构特征的重组蛋白6Αβ 15和6Αβ 15-Τ具有良好的稳定性。3.表达产物的Western blot和ELISA鉴定以鼠源抗 A β 40 单克隆抗体(Monoclonal Anti-β-Amyloid，BAM-10，购自 sigma) 为一抗，以辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠IgG(购自Sigma公司)为二抗，对纯化的重组多肽抗原蛋白进行Western blot分析，结果显示表达目的蛋白与鼠抗A β抗体特异性结合，大小位置与电泳位置一致，表明诱导表达或经纯化的重组蛋白即为目的蛋白(图3)。 同时，通过ELISA确定了该抗体也能够与这些重组多肽抗原蛋白结合，而与空载体诱导表达产物不结合，进一步表明我们表达和纯化的多肽抗原含Αβ 42或Αβ 42的B细胞表位抗原A β 15。另外，用抗载体分子AHc或THc的多克隆抗体进一步鉴定6Α β 15-T-AHc-C, AHc-5Aβ 15-Τ，6Αβ 15-Τ_ΤΗ。，6Αβ 15-T-THc-C 和 THc-5Aβ 15-T 多肽嵌合抗原蛋白，也表明这些重组多肽嵌合抗原含载体分子，进一步确定获得了符合设计的含各自相应载体的重组嵌合多肽抗原。实施例3重组多肽嵌合抗原6A β 15-Τ诱导普通小鼠产生高水平抗A β抗体以实施例2中表达并经纯化的重组蛋白6Αβ 15和6Αβ 15-Τ作为免疫原即亚单位疫苗免疫小鼠，以检测其免疫原性，并且与人工合成的溶于PBS的A β 15 (氨基酸序列为DAEFRHDSGYEVHHQ，纯度90%以上，为上海生工生物工程技术服务有限公司合成)和 A β 42 (氨基酸序列为 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAED VGSNKGAIIGLMVGGVVIA,纯度 90 % 以上， 为上海生工生物工程技术服务有限公司合成)多肽抗原进行比较。具体方法为将Balb/ c小(8周龄，雌性，SPF级，购自军事医学科学院实验动物中心)随机分为5组，每组8只， 重组多肽抗原免疫组免疫5 μ g重组蛋白，人工合成的多肽组免疫100 μ g，而对照组免疫不含重组蛋白的PBS，共免疫四次。免疫前，将抗原稀释于终浓度为20% (V/V)铝佐剂 (Alhydrogel，Sigma)。每只100 μ 1进行肌肉注射免疫，加强免疫时，间隔2周，剂量和方法同上。每次免疫前，以及最后一次免疫后第2周，小鼠尾部采血，分离血清，用ELISA去(用酶联免疫板包被A β 42或A β 15抗原，浓度为2 μ g/mL，用分离的免疫小鼠血清为一抗，以 HRP标记羊抗鼠IgG(购自Santa Cruz Biotechnology, Inc.)为二抗测定血清抗体。终末稀释ELISA去测定免疫动物血清中的特异性抗体滴度。以空对照组小鼠血清为阴性对照 (即N)，重组多肽抗原免疫组的0D492值(即P值)达到0. 2以上，并且P/N彡2. 1为阳性。 每组的平均抗体滴度以每组单个血清样品抗体滴度以几何平均数(GMT士SD)表示。ELISA检测结果表明，随着免疫次数的增加，抗体滴度也得到相应提高，而对照组血清与免疫前相比始终为阴性，低于100，最后一次免疫后抗体滴度如图4 ；上述检测结果表明，重组多肽抗原6A β 15-Τ免疫效果最好，抗体水平明显高于6Α β 15和多肽A β 15 (P < 0. 01，差异极显著)，表明T细胞表位对于产生抗体水平至关重要，正如多肽A β 42高于多肽A β 15组，另外6Α β 15-Τ免疫组没有产生IgG^i抗体，表明其免疫应答完全为Th2，这与其免疫后没有产生明显的针对A β 42刺激的淋巴细胞增殖是一致的。但，6Αβ 15重给多肽抗原产生的抗体水平也高于多肽A β 15，并且它也是二聚体结构，因此提示它有潜力作为候选疫苗和免疫原。淋巴细胞的增殖能力是细胞免疫应答的一个重要指标，用MTS法测定淋巴细胞的增殖能力，方法为最后一次免疫后第4周取脾细胞，制备浓度为IO6个/mL的脾细胞悬液， 在体外用抗原多肽A β 42或T细胞表位(AKAVAAWTLKAAA，PADRE)多肽，浓度为10 μ g/mL,进行刺激，4天后用MTS法检测T细胞增殖能力。淋巴细胞增殖能力的MTS法测定结果表明， 6Αβ 15-Τ免疫组小鼠体内诱导产生了特异的针对T细胞表位多肽的T细胞免疫反应，但是没有产生针对A β 42刺激的淋巴细胞增殖的T细胞免疫反应，而多肽A β 42免疫组则产生了针对多肽A β 42的T细胞免疫反应。进一步结果证实，0. 2和1 μ g重组蛋白6Αβ 15-Τ也能够诱导小鼠产生良好的抗 Αβ抗体，但IOyg Αβ多肽则不能够诱导小鼠产生良好的抗Αβ抗体。并且以上产生的免疫反应用A β 42或A β 15抗原检测时，均得到类似的结果。因此，上述实验结果表明，重组多肽抗原6Αβ15-Τ可作为阿尔茨海默病(AD)候选疫苗，低剂量就能够诱导小鼠产生高水平抗A β抗体，并且免疫应答反应为Th2型。另外，实验结果表明，重组多肽嵌合抗原5Αβ 15-Τ也可诱导普通小鼠产生高水平抗Αβ抗体。实施例4载体分子增强了 6Αβ 15-Τ的免疫原性，诱导产生更高水平的抗Aβ抗体以实施例2中表达并经纯化的重组蛋白6Α β 15-T-AHc-C，AHc_5A β 15-Τ, 6Αβ-Τ-ΤΗο,6Αβ 15-T-THc-C和THc_5A0 15-Τ作为免疫原即亚单位疫苗免疫小鼠，以检测其免疫原性，并且与6Αβ 15-Τ和Trx-4Ai3 42免疫原进行比较。具体方法为将Balb/c小 (8周龄，雌性，SPF级，购自军事医学科学院实验动物中心)随机分为8组，每组8只，重组多肽抗原免疫组免疫5 μ g重组蛋白，而对照组免疫不含重组蛋白的PBS，共免疫四次。免疫前，将抗原稀释于终浓度为20% (V/V)铝佐剂(Alhydrogel，Sigma)。每只100 μ 1进行肌肉注射免疫，加强免疫时，间隔2周，剂量和方法同上。ELISA法测定免疫动物血清中的特异性抗体滴度和淋巴细胞的增殖能力方法同上。ELISA检测结果表明，随着免疫次数的增加，抗体滴度也得到相应提高，而对照组血清与免疫前相比始终为阴性，低于100，最后一次免疫后抗体滴度如图5。检测结果表明， 含有载体分子(如AHC、AHc-C、THc和THc-C)重组多肽抗原均产生了高滴度的抗A β抗体， 抗体水平也高于6Α β 15-Τ (P <0. 05,差异显著)，抗体亚型也主要为IgGl，没有产生IgGh 抗体，表明其免疫应答主要为Th2，这与其免疫后没有产生明显的针对A β 42刺激的淋巴细胞增殖是一致的，此结果表明载体分子提高了 6Αβ 15-Τ抗原对A β的特异性抗体水平，并且没有改变其免疫反应类型。然后对培养基上清中的细胞因子进行了分析(图6Α，Β)。结果表明没有产生针对A β 42的细胞因子(IL-4和IFN-Y)，而产生了针对PADRE (简称Τ) 的细胞因子，并且IL-4的水平高于IFN- γ的水平，这暗示免疫应答为Th2，与多肽抗原蛋白免疫特性和抗体亚型的分析是一致。另外，低剂量的Trx_4Aβ 42抗原也能够产生良好的抗体反应，相当于100 μ g的多肽A β 42免疫组，但比6Αβ 15-Τ抗原产生的抗体水平略低，更显著地低于含有载体分子的抗原组(6Αβ 15-T-AHc-C，AHc-5Aβ 15_Τ，6Αβ 15-T-THc， 6Αβ 15-T-THc-C 和 THc-5A β 15-Τ) (P < 0. 05)。以上结果表明免疫组 χ-4Α β 42 免疫原可以诱导产生免疫反应，但与含T或载体分子重组免疫原相比，产生的抗体反应低，并且含有 Trx分子的融合蛋白可能更不适合作为人类疫苗药物，因此后者具有更明显的优势，是我们重点研究的对象。因此，上述实验结果表明含载体分子的重组多肽抗原也可作为阿尔茨海默病(AD) 候选疫苗，低剂量就能够诱导小鼠产生高水平抗A β抗体，并且免疫应答反应为Th2型。在上面实验基础上，也检测了各免疫原对载体分子抗原的免疫反应，结果表明含有载体分子的重组多肽嵌合抗原免疫后也产生了针对载体分子的抗体反应，并且能够产生对A型肉毒毒素或破伤风毒素的保护作用，证实了 A型肉毒毒素或破伤风毒素的C片段作为载体分子诱导了免疫反应，并且也调节介导和增强了其融合多肽抗原分子的免疫反应。 因此，本发明的设计并获得的重组多肽嵌合抗原不仅仅可用于制备阿尔茨海默病(AD)候选疫苗，而且能够产生对A型肉毒毒素或破伤风毒素的保护作用，表明其可作二价疫苗。实施例5重组多肽嵌合抗原亚单位疫苗免疫APP转基因AD模型小鼠后，诱导产生高水平的抗Aβ抗体以上实验结果表明，设计和制备重组多肽嵌合抗原亚单位疫苗在普通小鼠上诱导产生了良好的免疫原性，并且其免疫血清能够与不同形式Αβ 42结合，呈现特异性高结合 Αβ寡聚体，因此这些抗原疫苗当应用于AD模型小鼠时，可能能够诱导产生抗Αβ 42抗体并且特异性地结合和清除A β 42，从而改善AD症状。故，本实验研究并证实这些重组多肽抗原亚单位疫苗在APP转基因AD模型小鼠上的免疫原性和免疫效果，从而进一步确定和比较它们的药效学结果。具体方案如下，AD模型小鼠为PDAPPvmv,高水平表达ΑΡΡ751的转基因小鼠，作为AD模型，购自中国医学科学院实验动物研究所北京华阜康生物科技股份有限公司；重组多肽抗原亚单位疫苗与之前的制备和配制方法相同；转基因小鼠(12周龄，雌雄性，SPF级)随机分为4组，每组6 8只，5 μ g重组多肽抗原6A β 15-T，6A β 15-T-AHc-C 和6Αβ 15-T-THc-C分别混合于PBS中，免疫前，将抗原稀释于终浓度为20% (V/V)铝佐剂 (Alhydrogel，Sigma)，总体积100 μ 1/只，阴性对照组为不含重组蛋白的PBS，共免疫五次， 前四次间隔3周，最后一次间隔8周，每只100μ 1进行肌肉注射免疫，加强免疫时，剂量和方法同上。ELISA去测定免疫动物血清中的特异性抗体滴度的方法同上。另外，设置一组非转基因模型小鼠(转基因模型小鼠的母本C57/BL6)，用于评价行为学实验的阳性对照。ELISA检测结果表明，随着免疫次数的增加，抗体水平也得到相应提高，如图 7(注免疫后各个阶段抗体水平以ELISA表示(0D492值))，而阴性对照组血清与免疫前相比始终为阴性，最后一次免疫后抗体滴度如图8(注最后一次加强免疫后3周各免疫组的抗体水平)；上述检测结果表明，这三种重组多肽嵌合抗原疫苗免疫后诱导产生了高滴度的特异性抗体水平(P < 0.01，差异极显著，与阴性对照组相比)，均达到12800以上，抗体亚型也主要为IgGl，表明其免疫应答主要为Th2，这与先前在普通小鼠的结果是一致的，并且载体分子也一定程度上提高了 6Αβ 15-Τ抗原对Αβ的特异性抗体水平，但无明显统计学差异，表明它们都可作为AD的候选疫苗。另外，最后一次加强免疫后，其各个免疫组的抗体水平可维持6个月不下降。同时，也检测了各含有载体分子的重组多肽抗原免疫后产生了针对载体分子的抗体反应，提示载体分子可能在免疫反应应答中发挥了重要的免疫调节和辅助作用。总之，研究结果表明，低剂量重组多肽嵌合抗原免疫后就能够诱导APP转基因AD 模型小鼠产生高水平抗Αβ抗体，并且免疫应答反应为Th2型。下一步对其行为学能力和脑组织中Aβ含量的变化进行评价，进一步证实该重组多肽嵌合疫苗的药效学效果。实施例6重组多肽嵌合抗原诱导产生的血清抗体与不同形式A β 42的特异性结合分析Αβ寡聚体是Αβ从单体聚合成斑块过程中的一种中间形式，其无论在体内还是在体外均能产生较强的细胞毒性。目前，许多研究表明Αβ寡聚体才是导致阿尔茨海默病的主要原因，观察疫苗免疫后血清与不同状态Αβ结合状况能够在一定程度上反映疫苗的治疗效果。目的是使用斑点杂交方法测定血清中的抗体主要是与何种形式的A β 42结合。斑点杂交简单步骤为①先将合成的多肽A β 42重悬到PBS中，终浓度为500 μ g/ml，分为 7 组，分别在 37°C温箱中孵育 Omin, IOmin, 12h, 24h, 36h, 3d,6d ；用 TBS(20mM Tris-Hcl, PH7. 5,0.8% NaCl)处理NC膜以备用。②将准备好的7组A β 42滴加在处理后的NC膜上， 每组20 μ 1 ；并滴加相同浓度的BSA为对照。③使用5%脱脂奶粉封闭过夜。④将各组小鼠免疫后血清作为一抗，稀释度为1 100，37°C温箱中反应lh。⑤使用PBS-T清洗5次，每次5min。⑥用1 1000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的酶标IgG作为二抗，37°C温箱中反应0. ^！。⑦使用PBS-T清洗5次，每次5min。⑧使用增强型HRP-DAB底物显色试剂盒显色。首先我们通过电镜观察的结果表明多肽Αβ 42放置后，在37°C条件下时，随着孵育时间的增加，会发生形态变化。从最初的单体状态逐渐聚集为寡聚体直至最终形成纤维状结构。电镜结果表明，新鲜的多肽主要以单体形式存在(0分钟)，孵育时间为IOmin时，除了单体外，多肽产生了明显的寡聚体。随着孵育时间的增加，寡聚体逐渐增多(12 36小时内)，3天后则聚集逐渐形成纤维状，6天为成熟纤维。对普通小鼠的免疫血清抗体和AD模型小鼠的免疫血清抗体与不同状态Αβ进行 Dot-blot，如图9，各免疫血清与不同状态Αβ结合的斑点杂交结果图(注从上往下依次为6Αβ 15-Τ免疫普通小鼠的免疫血清，免疫AD模型小鼠的免疫血清，6Α β 15-T-THc-C和 6Αβ 15-T-AHc-C免疫AD模型小鼠的免疫血清，6A β 15-T-THc免疫普通小鼠的免疫血清， Αβ多肽免疫普通小鼠的免疫血清，商业化抗体以及阴性对照组血清)。结果表明，各免疫组小鼠血清均是与12 3 样品的斑点反应最明显，Omin和6d样品的斑点最弱，并且抗体滴度高的免疫组反应相对比较明显，滴度低的反应较弱。传统合成的Αβ多肽免疫小鼠的免疫血清不仅反应极弱，而且与各种形式的Αβ结合无差异，与商业化抗体反应一致。阴性对照组血清和免疫前血清则不与各种形式的A β不结合，而且免疫血清也不与BSA结合，表明这种结合是特异性的。由实验结果可证明，重组多肽嵌全抗原免疫小鼠产生的抗体主要是与Αβ寡聚体结合，跟单体和纤维状Aβ结合程度弱，与传统合成的Αβ多肽产生的抗体及商业化抗体反应不相同。基于这一免疫特性，提示本发明的重组多肽嵌合抗原可能拥有强的寡聚体构象表位和弱的序列表位，用作疫苗能够产生与Αβ可溶性寡聚体具有高亲和力的抗体，提示其免疫反应特性可能有良好的免疫治疗效果。因此，开发的AD疫苗使其能产生与Αβ可溶性寡聚体具有高亲和力的抗体并将寡聚体清除，可能拥有很重要的意义。实施例7重组多肽嵌合抗原亚单位疫苗免疫APP转基因AD模型小鼠后的学习记忆能力观察对重组多肽嵌合抗原亚单位疫苗免疫的APP转基因AD模型小鼠于最后一次加强免疫后6个月(即13个月龄)进行行为学改变的观察，采用Morris水迷宫方法。实验可分为隐藏平台获得实验和空间搜索实验两步。隐藏平台获得实验用于测量动物在水迷宫中的学习和记忆能力，实验历时3天。以非转基因C57BL/6小鼠为阳性对照(正常小鼠)，未免疫或PBS免疫的转基因模型小鼠为阴性对照(AD模型小鼠)。其评价方法为对每只小鼠分别从四个象限入水点放入，记录动物寻找并爬上平台所需时间即逃避潜伏期，计算每天各组4次逃避潜伏期的平均值。Morris水迷宫中的潜伏期是采用重复测量的数据取平均值评价。空间搜索实验用于测量动物对平台空间位置准确记忆，即记忆保持能力。隐藏平台获得实验后第4天撤除平台，将动物从任一入水点放人水中，评价动物在目标象限和其他各象限的游泳时间和穿越原平台位置次数等指标。如图10，各组小鼠在Morris水迷宫的学习和记忆能力结果(注隐藏平台获得实验训练时间为三天，然后第四天进行空间搜索实验)表明，随着时间延长，除阴性对照(AD模型小鼠)外，其他各组动物的潜伏期时间相继缩短；到第三天时有明显的差异，第四天时还具有一定的记忆能力，其潜伏期低于第一天的时间。但是阴性对照(AD模型小鼠)组一直无明显变化，表明其无学习和记忆能力。因此，总体上我们的实验结果表明，重组多肽嵌合抗原亚单位疫苗免疫后，APP转基因AD模型小鼠的学习记忆能力得到了明显的改善，提示疫苗达到了免疫预防AD病症的效果。实施例8免疫组化分析重组多肽嵌合抗原亚单位疫苗免疫APP转基因AD模型小鼠后脑组织中Aβ含量的变化在完成以上AD模型动物行为学指标的观察后，然后对重组多肽嵌合抗原亚单位疫苗免疫的APP转基因AD模型小鼠于最后一次加强免疫后6个月(即13个月龄)进行病理组织切片及免疫组织化学染色。检测方法开颅取脑后固定、脱水等过程后，进行冠状冷冻切片。切片PBS冲洗，经过溶于PBST进行过氧化反应，封闭处理后，加入鼠源抗Αβ单克隆抗体(6Ε10，购自sigma)摇勻、孵育过夜。然后，在室温下加入羊抗鼠IgG 二抗摇勻、 孵育，室温摇勻、孵育，显色。最后，经过常规粘片、干燥、脱水、透明、封片，光学显微镜下观察并拍摄。如图11，其中图IlA示6Αβ15-Τ疫苗免疫后模型小鼠脑组织切片，图IlB示 6Αβ 15-T-AHc-C疫苗免疫后模型小鼠脑组织切片，图IlC示6A β 15-T-THc_C疫苗免疫后模型小鼠脑组织切片，图IlD示佐剂阴性对照(无抗原)免疫后模型小鼠脑组织，图IlE示模型小鼠脑组织和图IlF示母本C57BL/6小鼠脑组织；图11中结果表明，阳性对照(APP转基因AD模型小鼠或未进行重组多肽嵌合抗原亚单位疫苗免疫的APP转基因AD模型小鼠)脑组织(图D和E)中有明显的淀粉样斑块存在，而重组多肽嵌合抗原亚单位疫苗免疫的APP 转基因AD模型小鼠脑组织(图A-C)中的淀粉样斑块则明显相对少和小或无，并且阴性对照组(非转基因AD模型小鼠即母本C57BL/6小鼠)脑组织(图11F)中无淀粉样斑块存在。 因此，以上实验结果说明，重组多肽嵌合抗原亚单位疫苗免疫后APP转基因AD模型小鼠脑组织中的淀粉样斑块或Αβ含量明显减少，提示疫苗免疫后抗体能够清除/中和小鼠脑组织中的淀粉样斑块或Αβ含量；这个结果与行为学指标结果一起表明，疫苗免疫后达到了减少APP模型小鼠脑内淀粉样斑块和改善学习记忆能力，有望作为阿尔茨海默病的免疫预防和治疗的新型疫苗候选，具有良好的应用前景和研究价值。总之，我们设计和表达的重组多肽嵌合疫苗具有独特的结构和免疫反应特性，免疫后转基因AD模型小鼠后的学习记忆能力(水迷宫)都得到了明显的改善和提高，更为重要的是，该免疫原没有引起针对A β 42的T细胞增殖反应，其主要抗体亚型为IgGl型，说明引起的主要是Th2型免疫反应，因此以上这些结果表明有望作为阿尔茨海默病的免疫预防和治疗的新型疫苗候选，具有良好的应用前景和研究价值。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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本发明公开了重组β淀粉样肽B细胞表位多肽嵌合抗原、其制备方法和应用。所述重组多肽嵌合抗原，其为包括5～6个串联的β淀粉样肽B细胞表位多肽抗原Aβ1～15，或由上述多肽抗原构成的二聚体。所述的重组多肽嵌合抗原还包括辅助性T细胞表位PADRE，或还进一步包括毒素片段载体分子。本发明人工合成这些靶向β淀粉样肽B细胞表位多肽嵌合抗原的基因，并通过原核表达系统获得表达，经纯化后的重组多肽嵌合抗原蛋白可作为亚单位疫苗用于免疫预防和治疗阿尔茨海默病。