专利名称：腺病毒/日本脑炎病毒复制子嵌合载体猪瘟疫苗及其应用的制作方法腺病毒载体因其具有宿主范围广泛、安全性高、病毒粒子稳定、基因组较少发生重排、易于DNA重组技术操作、具有高效递送和表达外源基因等优点，成为最常用的病毒载体之一。复制缺陷性人5型腺病毒载体因缺失了病毒非必需基因区(E1/E3)，使其能够携带大片段的外源基因，又由于它是复制缺陷性的，对人及动物产生一过性感染，安全性高。RNA复制子，即自主复制病毒RNA，是在RNA病毒感染性克隆的基础上用其它外源基因替换病毒结构蛋白基因、保留其非结构蛋白基因和非编码区而发展的表达 系统， 它利用正链RNA病毒的自主复制特性，转染细胞后能够在表达病毒非结构蛋白的同时高效表达外源蛋白(余云舟，俞炜源.黄病毒属病毒复制子载体研究进展.生物技术通讯，2006，17 (2) :228-231)。RNA复制子疫苗具有很强的优势，如有自主复制能力，病毒自身调节功能蛋白的表达不受细胞影响，病毒蛋白表达量高等优点(Polo JM, Dubensky TW. Virus-based vectors for human vaccine applications. Drug Discovery Today, 2002,7(13) :719-727.)。不足之处是，RNA复制子载体不能有效地进入体内。另外，黄病毒复制子载体蛋白对宿主菌具有一定的毒副作用，这可能是造成黄病毒复制子载体不稳定的主要因素(Rice CM, Grakoui A, Galler R, et al. Transcription of infectious yellow fever RNA from full-length cDNA templates produced by in vitro ligation. New Biol,1989,1 (3) :285-96.)。黄病毒eDNA在细菌中存在不稳定性，日本脑炎病毒(JEV)复制子载体也存在这种情况(Lai CJ, Zhao BT, Hori H, et al. Infectious RNA transcribed from stably cloned full-length cDNA of dengue type 4 virus. Proc Natl Acad Sci USA,1991,88 (12) 5139-5143 ；Sumiyoshi H, Hoke CH,Trent DW,et al. Infectious Japanese encephalitis virus RNA can be synthesized from in vitro-ligated cDNA templates. J Virol,1992, 66(9) :5423-5431.)。目前国内外关于以腺病毒递送JEV复制子表达载体的研究尚未见报道。
本发明的目的之一是提供一种携带抗原基因的腺病毒/日本脑炎病毒复制子嵌合载体疫苗；本发明的目的之二是提供一种构建所述携带抗原基因的腺病毒/日本脑炎病毒复制子嵌合载体疫苗的方法；本发明的目的之三是提供一种腺病毒/日本脑炎病毒复制子嵌合载体猪瘟疫苗；本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的—种腺病毒/日本脑炎病毒复制子嵌合载体疫苗，包括复制缺陷性人5型腺病毒、日本脑炎病毒复制子和待表达的抗原基因；其中，在日本脑炎病毒复制子SpeI位点前 (即位于JEV SA14-14-2株基因组第164-165位核苷酸)插入质粒pCI的内含子序列；待表达的抗原基因位于JEV复制子载体的SpeI和SalI位点之间。其中，所述质粒PCI的内含子序列的核苷酸序列为SEQ ID No. I所示。本发明所述的“待表达的抗原基因”可以是猪瘟病毒E2基因、猪蓝耳病病毒GP5基因、猪圆环病毒2型Cap基因或猪流感病毒HA基因等抗原基因；优选为猪瘟病毒E2基因。本发明的另外一种目的是提供一种构建所述腺病毒/日本脑炎病毒复制子嵌合载体的方法，包括以下步骤(I)将日本脑炎病毒(JEV)复制子插入到腺病毒穿梭载体中；(2)将来自pCI载体的嵌合内含子序列以及待表达的抗原基因插入到JEV复制子中，得到转移载体；(3)将转移载体线性化后转化含有腺病毒骨架载体的感受态细胞，得到重组腺粒；(4)将所得重组腺粒线性化后转染细胞，传代直至出现细胞病变，得到含有表达抗原基因的腺病毒/日本脑炎病毒复制子嵌合载体疫苗。其中，步骤(I)中所述的腺病毒穿梭载体包括pShuttle、pShuttle_CMV、pAdTrack 或 pAdTrack-CMV 等；优选为 pShuttle-CMV ；步骤(2)中在日本脑炎病毒复制子SpeI位点前插入质粒pCI的内含子序列(SEQ ID No. I);此外，将待表达的抗原基因插入到JEV复制子载体的SpeI和SalI位点之间。步骤⑷中所述的细胞优选为HEK293细胞。本发明中所使用的JEV复制子保留了 JEV所有非结构蛋白，能在抵抗外源病毒的同时对JEV也有一定的保护作用。采用腺病毒递送JEV复制子表达系统，充分利用了复制子能高效表达外源基因的优点，又解决了核酸疫苗不容易进入动物体内的问题。在本发明人的前期工作中，获得了表达EGFP蛋白的腺病毒/日本脑炎病毒复制子载体嵌合病毒，但用其它基因(如猪瘟病毒E2基因或猪流感病毒HA基因)替换EGFP基因后，尽管采用不同改进措施，比如转化过程中使用能容纳大片段且生长较慢的DHlOB菌株，并且使用低温、低转速、低浓度抗生素筛选，却始终无法得到插入外源基因的嵌合载体克隆，无法获得嵌合病毒，这可能是由于黄病毒cDNA在大肠杆菌中的不稳定性造成的。为了解决这个问题，本发明尝试了往JEV复制子序列中引入内含子的方法，避免JEV蛋白翻译所产生对宿主菌有毒害作用的蛋白，也尝试了引入突变来消除JEV序列中隐含的大肠杆菌启动子等方法，最终发现引入内含子序列能使JEV复制子载体变得稳定，用猪瘟病毒E2基因替换EGFP基因后， 很容易挑到阳性克隆，转染细胞后E2蛋白也能正确稳定表达(表I)。表I引入来自pCI载体的嵌合内含子对JEV复制子的影响本发明公开了腺病毒/日本脑炎病毒复制子嵌合载体猪瘟疫苗及其应用。本发明首先构建了携带日本脑炎病毒复制子、稳定表达EGFP基因的重组嵌合腺病毒，在此基础上，本发明进一步用猪瘟病毒E2基因替换嵌合载体中的EGFP基因，构建了含有猪瘟病毒E2基因的重组嵌合腺病毒rAdV-JEV-E2。间接免疫荧光试验证明，猪瘟病毒E2蛋白在重组嵌合腺病毒rAdV-JEV-E2感染后的HEK293细胞中得到稳定、高效的表达；免疫攻毒试验结果显示，本发明所构建的重组嵌合腺病毒rAdV-JEV-E2具有良好的免疫保护作用。