专利名称：从克隆的核苷酸序列制备减毒嵌合呼吸道合胞毒病毒的制作方法相关申请本申请要求了1997年7月15日递交的US08/892403专利申请的优先权并且是其部分继续申请；所述美国专利是在先申请1997年5月23日递交的US60/047634，1997年5月9日申请的US60/046141，1996年7月15日递交的US60/021773的继续申请，上述每一申请均引入本文作为参考。人呼吸道合胞病毒(RSV)作为导致不足一岁婴儿的肺炎和细支气管炎的病因比其它所有的微生物病原体都厉害。实际上，所有儿童在两岁龄内均会被感染，且在较大一点的小孩和青年人身上发生再感染的频率也较高(Chanock等，人的病毒感染(Viral Infections of Humans)，第三版，A.S.Evans编辑，Plenum出版社，N.Y.(1989))。RSV导致了因患呼吸道疾病被住院治疗的儿童中的五分之一以上，且仅在美国每年就导致大约91,000人住院治疗和4,500人死亡。尽管大多数健康的成年人没有严重RSV感染的疾病，但稍老年的病人以及无免疫应答的个体通常会遭受来自该病原体的严重且可能危及生命的感染。尽管人们已进行了几十年的研究来开发有效的抗RSV的疫苗制剂，但仍然没有获得安全和有效的疫苗来降低严重RSV感染的发病率和死亡率。开发成功疫苗失败的一部分原因是因为实际上较小的婴儿对RSV抗原的血清抗体和分泌性抗体的应答较弱。因此，这些个体会遭受更严重RSV感染，积累的免疫力显示出对年龄较大的儿童和成年人的抗严重病毒感染的保护。一种抗病毒化合物，三氮唑核苷，已表现出具有治疗严重感染婴儿的治疗的潜力，但是没有迹象表明其能缩短婴儿住院时间或减少对婴儿支持性治疗的需求。RSV感染的免疫机制最近已成为热点，分泌抗体在上呼吸道的保护上显得最为重要，而高水平的血清抗体被认为在下呼吸道抗RSV感染中起重要作用。纯化的含有高滴度RSV中和抗体的人免疫球蛋白对于一些用于婴儿以及年幼儿童的严重下呼吸道疾病的免疫治疗是有用的，免疫球蛋白制剂有一些缺点，例如可能会传递血液传染的病毒以及制备和储藏困难且代价昂贵。RSV特异的细胞毒性T细胞，另一个诱导出的免疫的效应器，对于消除RSV感染也是重要的。然而尽管后一效应器可通过前一免疫来增加对病毒攻击的抗性，作用是短暂的。F和G表面糖蛋白是两种主要的抗RSV的保护抗原，并且是仅有的两种表现出诱导RSV中和抗体和对攻击的长期抗性的RSV蛋白(Collins等，Fields Virology，Fields等编辑，21313-1352，Lippincott-Raven，Philadelphia(1996)；Connors等，J.Virol.65(3)1634-7(1991))。第三种RSV表面蛋白，SH，不诱导RSV-中和抗体或对RSV攻击的明显抗性。活RSV疫苗开发的一个难点在于在减毒和免疫原性之间很难获得一种合适的平衡。减毒疫苗的遗传稳定性也是一个障碍。疫苗开发也受到RSV在细胞培养物中较差的生长以及病毒颗粒的不稳定性的影响。RSV感染的另一个特征是诱导产生的免疫力不充分用以抵抗后来的感染。大量的因素可能决定了这种情况，包括免疫系统对限制呼吸道的腔表面的病毒感染的相对无效，局部粘膜免疫力的短效特性，病毒复制的快速和广泛性，免疫学上尚未成熟的年轻人的降低的免疫应答，经胎盘得到的母亲血清抗体的免疫抑制，以及病毒的特定特征例如G蛋白高度糖化。另外，如下所述，RSV存在两个抗原亚型，且抗一个亚型的免疫力比其抗另一个亚型的免疫力相对较弱。尽管RSV在一生中可重复感染多次，但重复感染通常因上次感染所诱导的保护性免疫力而减少，因此免疫预防是可行的。一种活减毒RSV疫苗将被通过鼻内给药来启动适度的免疫性感染。其与非肠道途径相比具有简便和安全的优点。其也提供了局部呼吸道免疫的直接刺激，其在抗RSV中起主要的作用。其也消除了来自RSV特异性的母亲血清抗体的免疫抑制影响。另外，当非肠道RSV抗原给药时，有时与免疫病并发症相关联(Murphy等，疫苗(Vaccine)8(5)497-502(1990))，但在活病毒情况下从未观察到。在二十世纪60年代中叶，甲醛灭活的病毒疫苗作为抗RSV的疫苗被测试，但在抗RSV感染或疾病的保护上没有获得成功，且事实上随后的病毒感染呈现恶化的症状。(Kim等，Am.J.Epidemiol.89422-434(1969)，Chin等，Am.J.Epidemiol.89449-463(1969)；Kapikian等，Am.J.Epidemiol.89405-421(1969))。最近，RSV疫苗的开发已聚焦于减毒RSV突变株上。Friedewald等，J.Amer.Med.Assoc.204690-694(1968)报道了RSV的一种冷传代突变株(cpRSV)，其被充分减毒成为候选疫苗。此突变株与野生型(wt)亲代病毒相比，显示出轻微增加的在26℃生长的能力，但其复制既没有温度敏感性也没有明显的冷适应性。然而，却将冷传代突变株减毒用于成年人。尽管对于已被RSV感染的婴幼儿(例如，血清反应阳性的个体)，cpRSV已令人满意地被减毒并且具有免疫原性，但cpRSV仍保留对于血清反应阴性婴儿上呼吸道的低水平毒性。
类似的，Gharpure等人，J.Virol.3414-421(1969)报道了作为有价值的候选疫苗的温度敏感性RSV(tsRSV)突变株。一种突变株ts-1，被广泛地用于实验室和自愿受试者中。突变体在成年自愿者中产生无症状感染且在致免疫45天后对野生型病毒攻击产生抗性。对比血清反应呈阳性的婴儿和遭受无症状感染的儿童，血清反应呈阴性的婴儿呈现鼻炎征兆和其它轻微的症状。此外，ts表型的稳定性被检测到，尽管表现出部分或全部温度敏感性缺失的病毒占可从疫苗重新获得的病毒的较小比例，且不与除轻微鼻炎疾病以外的疾病征兆相关联。
这些和其它的研究显示特定的冷传代和温度敏感性RSV株被不充分减毒且在疫苗接种者导致轻微的疾病特征，尤其血清反应阴性的婴儿，而其它的被超减毒且不能充分的复制来引起保护性的免疫应答，(Wright等，Infect.Immun.，37397-400(1982))。此外，候选疫苗突变株的遗传不稳定性导致其温度敏感性表型的缺失，进一步阻碍了有效的RSV疫苗的开发。通常参见，Hodes等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.1451158-1164(1974)，McIntosh等，Pediatr.Res.8689-696(1974)，以及Belshe等，J.Med.Virol.3101-110(1978)。
抛弃了通过不确定的生物学方法例如冷传代构建合适减毒RSV株的方法，研究者通过纯化的RSV包膜糖蛋白来测试亚型疫苗候选毒株。糖蛋白在棉鼠的肺中诱导对RSV感染的抗性，Walsh等，J.Infect.Dis.1551198-1204(1987)，但是抗体具有非常弱的中和活性，且用纯化的亚型疫苗免疫啮齿动物会导致疾病的加强，这使人联想到先前已处理过的RSV疫苗(Murphy等，Vaccine 8497-502(1990))。
表达F或G包膜糖蛋白的基于疫苗病毒重组体的疫苗已被进行研究。这些重组体表达不能被从真正病毒对应物中区别开的RSV糖蛋白，用疫苗-RSV F和G重组体经皮感染的啮齿动物表现出高水平的中和病毒感染力的特异性抗体。事实上，棉鼠用疫苗F重组体感染可刺激出对RSV在下呼吸道复制的几乎完全的抗性以及在上呼吸道中的明显的抗性。Olmsted等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.837462-7466(1986)。然而，用疫苗F和G重组体免疫黑猩猩，在上呼吸道中几乎没有提供抗RSV攻击的保护(Collins等，Vaccine 8164-168(1990))，其在下呼吸道中提供的保护前后不一(Crowe等，Vaccine 111395-1404(1993))。
针对RSV和其它负链RNA病毒的生物减毒疫苗株、亚型疫苗以及其它疫苗开发策略的不成功使得迫切需要一种新的方法来开发新的疫苗，特别是人工重组候选疫苗的方法来加入遗传变化，以生产具有新表型特性的活减毒RSV重组体。然而，对RSV和其它反义RNA病毒的基因组RNA的操纵处理至今仍是很难的。此方面的主要障碍包括这些病毒的裸露的基因组RNA的非感染性、病毒在组织培养物中的不良生长、冗长的复制循环、病毒体的不稳定性、染色体组复杂以及基因产物结构的难以控制。
重组DNA技术使得从cDNA重新获得有感染力的负链RNA病毒、遗传操作病毒克隆来构建新的候选疫苗、以及快速估计其减毒和表型稳定性的水平成为可能(综述参见Conzelmann，J.Gen.Virol.77381-89(1996)；Palese等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9311354-58，(1996))。在此文中，已报道了在必需病毒蛋白的存在下由cDNA编码的反基因组RNA来重组拯救传染性的呼吸道合胞病毒(RSV)、人类副流感病毒3(HPIV3)、狂犬病病毒(RaV)、水泡性口膜炎病毒(VSV)、麻疹病毒(MeV)、仙台病毒(Sev)、牛瘟病毒、S型猿猴病毒和牛RSV(参见，例如，Garcin等，EMBO J.146087-6094(1995)；Lawson等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.924477-81(1995)；Radecke等，EMBO J.145773-5784(1995)；Schnell等，EMBO J.134195-203(1994)；Whelan等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.928388-92(1995)；Hoffman等，J.Virol.714272-4277(1997)；Kato等，Genesto Cells 1569-579(1996)，Roberts等，Virology 247(1)，1-6(1998)；Baron等，J.Virol.711265-1271(1997)；国际申请WO97/06270；Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9211563-11567(1995)；Durbin等，Virology 235323-332(1997)；专利申请U.S.No.08/892,403，申请于1997年7月5日，(相应于国际申请WO 98/02530，优先权为美国临时申请60/047,634(申请于1997年5月23日)、60/046,141(申请于1997年5月9日)和60/021,773(申请于1996年7月15日))；Juhasz等，J.Virol.71(8)5814-5819(1997)；He等Virology237249-260(1997)；Whitehead等，Virology 247(2)232-9(1998a)；Whitehead等，J.Virol.72(5)4467-4471(1998b)；Jin等，Virology251206-214(1998)；Bucholz等，J.Virol.73251-259(1999)；以及Whitehead等，J.Virol.73(4)3438-3442(1999)，所述文献均引入本文作参考)。
RSV疫苗开发的其它困难是很难获得能有效抵抗广泛的现有及新兴RSV株和亚型的候选疫苗。特别是，与多价疫苗提供抗RSV A和RSV B亚型的保护一样，提供一种RSV亚型B-特异性疫苗病毒也是有用的。在此文中，最近的研究已聚焦于在病毒株之间传送抗原决定簇的嵌合病毒的开发。例如，人副流感病毒3型(PIV3)的HN和F糖蛋已被人副流感病毒1型(PIV1)的HN和F糖蛋白替换，产生的嵌合病毒在细胞培养物和实验动物中生长，其具有与野生型亲本相似效力(Tao等，J.Virol.72(4)2955-61(1998)，引入本文作为参考)。也有报道一种嵌合麻疹病毒其H和F糖蛋白被水泡性口膜炎病毒G糖蛋白替换，其插入的同时伴随或不伴随麻疹病毒F的相应部分对G糖蛋白细胞质和跨膜区的替换(Spielhofer等，J.Virol.72(3)2150-9(1998))。这样产生一种据报道在生长上减少50％的嵌合病毒。在第三个例子中，Jin等，Virology 251(1)206-14(1998)报道一种亚型A病毒其表达作为附加基因的亚型B RSV的G蛋白(Jin等，Virology 251(1)206-14(1998))。然而，由于F蛋白也表现明显的亚型特异性，优选在亚型B特异性疫苗中表达两种亚型B糖蛋白。此外，嵌合A-B病毒的生产将不产生没有经进一步修饰获得适当减毒和毒性的有活力的候选疫苗。
因此，本领域迫切需要制备安全和有效疫苗的工具和方法来缓解RSV带来的严重的健康问题，尤其是有效地抵抗RSV的多种已存在的和新兴毒株和亚型的那些。十分令人惊讶的是，本发明满足了这些以及其它相关的需求。
发明的概述本发明提供了嵌合的重组呼吸道合胞病毒(RSV)，其具有感染性并在人类或其它哺乳动物中引起预防的或治疗的免疫应答。在相关方面，本发明提供了用于设计和产生适用于疫苗的减毒、嵌合RSV的新的方法和组分。本发明的这些方面包括新的经分离的多核苷酸分子和载体，其引入了含有包含结合不同RSV株或亚型病毒的一个或多个异源基因或基因片段的一个RSV株或亚型病毒的部分或全部RSV基因组或反基因组的嵌合RSV基因组或反基因组的分子。本发明也提供了引入嵌合、重组RSV的方法和组合物用于RSV感染的预防和治疗。
本发明的嵌合RSV被重组改造以引入来自不止一个RSV株或亚型的核苷酸序列来产生感染性嵌合病毒或亚病毒颗粒。在此方法中，候选疫苗病毒被重组改造来启动易受RSV感染的哺乳动物包括人类和非人类灵长目动物的抗RSV的免疫应答。本发明的嵌合RSV可以启动对特定RSV亚型或毒株的免疫应答，或抗多个RSV亚型或毒株的多重特异性应答。
本发明的示范嵌合RSV引入了一个嵌合RSV基因组或反基因组，以及主要的核壳(N)蛋白、核壳磷蛋白(P)、大聚合酶蛋白(L)以及RNA聚合酶延伸因子。其它RSV蛋白可能被包含在不同的组合物中来提供广泛的有感染性亚病毒颗粒以及完全病毒颗粒。
本发明的嵌合RSV含有来自结合了不同RSV株或亚型病毒的一个或更多异源基因或基因片段来形成嵌合RSV基因组或反基因组的一个RSV株或亚型病毒的部分或完整RSV基因组或反基因组。本发明一个较优选的方面，嵌合RSV引入了结合不同人RSV亚型或株的一个或更多异源基因或基因片段的一个RSV亚型或株的部分或完整RSV基因组或反基因组。例如，一种嵌合RSV可引入一种含有结合一个或更多来自人RSV B亚型病毒的异源基因或基因片段的部分或完整人RSV A亚型基因组或反基因组的嵌合基因组或反基因组。
来自一个RSV株或亚型的异源基因或基因片段是指“供体”基因或多核苷酸，其与“受体”基因组或反基因组结合或在其中进行替换。受体基因组或反基因组典型的充当“骨架”或载体来引入异源基因或基因片段以产生表现出新表型特征的嵌合RSV。例如，与未修饰的受体和/或供体相比，异源基因或基因片段在所选择受体RSV株中的插入或替换可导致减毒、生长变化、改变的免疫活性或其它的人们期望的表型变化。本发明的可被筛选用作异源基因插入或增加的基因和基因片段包括编码NS1、NS2、N、P、M、SH、M2(ORF1)、M2(ORF2)、L、F或G蛋白或其部分的基因或基因片段。
在本发明的一个优选的实施方案中，嵌合RSV引入了一个或多个编码RSV F、G或SH糖蛋白的异源基因。可选择的，嵌合RSV可引入一个编码RSV F、G或SH糖蛋白的细胞质域、跨膜域、胞外结构域或免疫原性抗原决定簇的基因片段。这些免疫原性蛋白、结构域或抗原决定簇在嵌合RSV中是非常有用的，因为其可以在被免疫的宿主中产生新的免疫应答。
例如，来自供体RSV亚型的一个或多个免疫原性基因或基因片段在不同RSV亚型或毒株的受体基因组或反基因组中的增加或替换可产生免疫应答直接抗供体亚型或毒株或同时抗供体和受体亚型或毒株。在一个实施方案中，一个或多个人RSV亚型B糖蛋白基因F、G和SH或其细胞质结构域、跨膜结构域、胞外结构域或其免疫原性抗原决定簇，被加入到RSV A基因组或反基因组或在其中进行替换。
本发明的另一个方面，产生了减毒的、嵌合RSV，其嵌合基因组或反基因组通过导入一或多个决定减毒表型的减毒点突变被进一步的修饰。这些点突变可被从头产生并通过合理设计的诱变方法来测定减毒效果。可选择的，减毒点突变在生物学上获得的突变RSV中得以鉴别并被引入到本发明的嵌合RSV中。
优选的，本发明的嵌合RSV被减毒，通过引入至少一个、更优选的两个或多个在生物学上获得的一组已知突变体RSV株中鉴别的减毒点突变。在此描述的优选的突变体RSV株为冷传代(cp)和/或温度敏感性(ta)突变体，例如突变体“cpts RSV 248(ATCC VR 2450)，cptsRSV 248/404(ATCC VR 2454)，cpts RSV 248/955(ATCC VR 2453)，cptsRSV 530(ATCC VR 2452)，cpts RSV 530/1009(ATCC VR 2451)，cptsRSV 530/1030(ATCC VR 2455)，RSV B-1 cp52/2B5(ATCC VR 2542)和RSV B-1 cp-23(ATCC VR 2579)”(每个均依据布达佩斯条约保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 Boulevard大学，Manassas，弗吉尼亚20110-2209，美国，且得到的保藏号如上)。此示范生物学上获得的突变体，提供了减毒突变的大“目录”，其每一个可被结合任意其它的突变来校准用于疫苗的重组嵌合RSV的减毒水平。其它突变可获自具有如在小噬斑(sp)、冷适应(ca)或宿主-范围受限制的(hr)突变型毒株中被鉴定的非-ts和非-cp减毒突变的RSV。
本发明的另一个方面，带有或不带有减毒点突变的嵌合RSV，通过非位点核苷酸修饰发生突变以产生理想的表型、结构或功能的变化。典型的，所选的核苷酸修饰特指表型的改变，例如，生长特性的改变、减毒、温度敏感性、冷适应性、噬斑大小、宿主范围限制或免疫原性。结构或功能的改变包括导入或消除限制性位点到编码cDNA的RSV中以方便操作和鉴定。
在一个优选的实施方案中，嵌合RSV中的SH、NS1、NS2或G基因被修饰，例如，通过基因缺失或表达清除。可选择的，核苷酸修饰可包括用于所选RSV基因的顺式作用的调控序列的缺失、插入、增加或重排。
在一个实例中，一个RSV基因的顺式作用的调控序列被改变来对应异源的调控基因，其可为与不同RSV中相同基因或不同RSV基因的顺式作用的调控序列对应的顺式作用调控序列。例如，基因末端信号可通过不同基因在相同RSV株中的基因末端信号的倒置或替换被修饰。
在一个独立的实施方案中，核苷酸修饰可包含嵌合基因组或反基因中翻译起始位点的插入、缺失、替换或重排，从而例如消除另一个用于所选蛋白形式的翻译起始位点。在一个实例中，RSV G蛋白的分泌形式的翻译起始位点被消除来修饰这种G蛋白形式的表达且在体内产生期望的作用。
本发明的嵌合RSV基因组或反基因组的其它修饰包括导入非RSV分子例如细胞因子、T-辅助抗原决定簇、限制性位点标记或能够在哺乳动物宿主中启动抗病原体保护性免疫应答的微生物病原体的蛋白到嵌合基因组或反基因组中的修饰。在一个实施方案中，嵌合RSV被构建，引入来自副流感病毒(PIV)的基因或基因片段，例如PIV HN或F糖蛋白或免疫原性结构域或其抗原决定簇。
设计和筛选用于疫苗的嵌合RSV通常至少具有两个且有时三个或多个减毒突变来获得广泛用于临床用途的令人满意的减毒水平。在一个实施方案中，至少一个减毒突变产生在RSV聚合酶基因中(在供体或受体基因中)，它包括核苷酸的替换，该核苷酸替换导致聚合酶中的氨基酸发生变化，其决定减毒表型并可涉及或不涉及温度敏感性(ts)表型。在此文中，嵌合RSV在大聚合酶基因L中引入一或多个核苷酸替换，结果在氨基酸Phe521、Gln831、Met1169或Tyr1321处中产生氨基酸变化，变化的实例为Leu替换Phe521，Leu替换Gln831，Val替换Met1169，以及Asn替换Tyr1321。其它在此位点的可选择的氨基酸变化可产生与所证实的突变替换类似的效果。在此文中，优选修饰嵌合基因组或反基因组来编码突变中的受试位点的改变，其通常保守性地对应于在突变病毒中鉴定的改变。例如，与相应的野生型序列相比，如果氨基酸替换标记一个突变病毒中的突变位点，则在重组病毒的相应残基处应设计类似的替换。优选的替换涉及一个相同或保守的氨基酸成为突变体病毒蛋白的替换残基。然而，涉及突变体蛋白的替换残基，也有可能在突变位点上非-保守性地改变天然的氨基酸残基(例如，通过使用任意其它的氨基酸来干扰或减少野生型残基的特性和功能)。在缺失或插入突变的情况下，这些可作为相应的缺失或插入序列被导入重组病毒中，然而缺失或插入的蛋白片段的具体大小和氨基酸序列可以变化。本发明的嵌合RSV可在任意其它除了L的RSV基因，例如在M2基因中引入ts突变。
优选的，两或多个核苷酸变化被引入到决定减毒突变的密码子中，例如，决定ts突变的密码子。因此减少了从减毒表型反转的可能性。
减毒突变可被选择在供体或受体RSV基因的编码部分或非编码区例如顺式调控序列中。示例的非编码突变包括基因起始序列的单个或多个碱基变化，例如M2基因起始序列中的核苷酸7605的单个或多个碱基替换(重组体序列中核苷酸7606)。
本发明的另一个方面，提供了组合物(例如，经分离的多核苷酸和引入编码RSV的cDNA的载体)和方法来用于产生经分离的感染性嵌合RSV。利用这些组合物和方法，感染性嵌合RSV产生于嵌合RSV基因组或反基因组、核壳(N)蛋白、核壳磷蛋白(P)、大(L)聚合酶蛋白和RNA聚合酶延伸因子。在本发明的相关的方面，组合物和方法被提供用于导入上述的结构和表型变化到重组嵌合RSV中来产生感染性减毒疫苗病毒。
在一个实施方案中，提供了一个含有经分离的编码嵌合RSV基因组或反基因组的多核苷酸分子的表达载体。也提供了相同的或不同的含有一或多个经分离的编码N、P、L和RNA聚合酶延伸因子蛋白的多核苷酸分子的表达载体。载体优选在细胞中或无细胞溶胞产物中表达或共表达，因此产生感染性嵌合RSV颗粒或亚病毒颗粒。
RSV基因组或反基因组以及N、P、L和RNA聚合酶延伸因子(优选RSV的M2(ORF1)的产物)蛋白可通过相同或不同的表达载体被共表达。在一些例子中，N、P、L和RNA聚合酶延伸因子蛋白被通过不同的表达载体编码。编码嵌合RSV或反基因组的多核苷酸分子可以是不同的人RSV亚型或毒株的嵌合体，例如含有可操作地连接于亚型B RSV的序列的亚型A RSV的序列的多核苷酸。可选择的，嵌合基因组或反基因组可以是人和非人(例如，牛或鼠科动物)RSV序列的嵌合体。在本发明的另一个可选择的方面，嵌合的基因组或反基因组可以是RSV和非-RSV序列的嵌合体，例如含有可操作地连接于PIV序列的人RSV序列的多核苷酸。嵌合基因组和反基因组，可通过一或多个核苷酸的插入、重排、缺失或替换，包括点突变、位点特异性核苷酸变化，以及涉及整个基因或基因片段导入异源供体基因或基因片段或受体基因组或反基因组的变化，而被进一步修饰。这些改变一般针对在产生的重组RSV中的一或多个表型的变化，例如导致减毒、温度敏感性、冷适应性、小噬斑大小、宿主范围限制性、基因表达的改变或免疫原性抗原决定簇的改变等表型的变化。
上述的用于生产嵌合RSV的方法和组合物产生感染性病毒或亚病毒颗粒或其衍生物。一种感染性病毒与真正的RSV病毒相似并具有相似的感染性。其可直接感染新鲜的细胞。一种感染性亚病毒颗粒一般是一种在合适的条件下可启动感染的病毒颗粒的亚型分。例如，含有基因组或反基因组RNA和N、P、L和M2(ORF1)蛋白的核壳为一种亚病毒颗粒，其如果被导入到细胞的细胞质中能够启动感染。本发明提供的亚病毒颗粒尤其包括，缺少一或多种蛋白、蛋白片段或其它对于感染力不必要的病毒组分的病毒颗粒。
本发明的感染性嵌合RSV可引入来自任意RSV或类RSV病毒，例如，人、牛、鼠(鼠的肺炎病毒)或禽类RSV(火鸡鼻气管炎病毒)，或来自其它的有包膜病毒例如副流感病毒(PIV)的异源的、编码或非编码的核苷酸序列。在一些实例中，重组的RSV含有一人RSV基因组或反基因组序列与一或多个异源RSV序列连接形成的嵌合体。示例的异源序列包括与不同人RSV毒株的序列结合的来自一个人RSV毒株的RSV序列。例如本发明的嵌合RSV可引入来自两或多个野生型或突变RSV毒株的序列，例如选自cpts RSV 248、cpts 248/404、cpts248/955、cpts RSV 530、cpts 530/1009或cpts 530/1030的突变体毒株。可选择的，嵌合RSV可引入来自两个或多个野生型或突变体RSV亚型的序列，例如，RSV亚型A和亚型B序列的结合体。在另一个方面，一或多个人RSV的编码或非编码多核苷酸被用来自牛或鼠的对应序列替换，单独替换或结合一或多个所选择的减毒点突变，例如，cp和/或ts突变，来产生新的减毒疫苗毒株。在另一个实施方案中，嵌合的牛-人RSV包括用对应牛NP基因或基因片段替换人RSV NP基因或基因片段，其嵌合体可选择性地被构建来引入SH基因缺失，一或多个cp或ts点突变，或这些突变以及其它在此公开的突变的不同组合。
在本发明的一个实施方案中，提供了经分离的多核苷酸，表达载体，以及用于生产嵌合RSV的方法，其中的基因组或反基因组与供体或受体序列相比发生了重组改变。特别的，突变基于其改变嵌合RSV克隆的结构和/或功能的能力被引入到嵌合RSV基因组或反基因组中，例如，通过改变所选蛋白的结构、表达和/或功能或顺式作用的RNA序列来产生所期望的表型变化。期望的表型变化包括，例如，培养基中病毒生长、温度敏感性、噬斑大小、减毒的变化以及免疫原性的变化。
在本发明的另一个实施方案中，提供了含有一个具有至少一个来自生物学上获得的突变RSV的减毒点突变的嵌合RSV基因组或反基因组的经分离的多核苷酸和表达载体。在此实施方案中，至少一个点突变存在于涉及决定ts表型的核苷酸替换的聚合酶基因L中。示例的RSV克隆和载体引入一个导致在聚合酶基因的Phe521、Gln831、Met1169或Tyr1321处发生氨基酸变化的核苷酸替换。优选的，两个或三个突变被引入到特指减毒突变的密码子中来增加遗传稳定性的水平。其它的实例RSV引入至少两个减毒ts突变。
本发明的被引入到嵌合cDNA、载体和病毒颗粒中的突变可被单独或联合导入到全长RSV cDNA中且含有导入突变的被拯救病毒的表型可被很容易地测定。在示例实施方案中，通过减毒的、生物学上获得的病毒对比野生型RSV例如通过cpRSV或tsRSV来显示的氨基酸变化，被引入到重组RSV中来产生理想的减毒水平。
本发明也提供了引入了以所选的组合方法导入到嵌合基因组或反基因组中产生减毒的感染性病毒或亚病毒颗粒的多重表型特异性突变的嵌合RSV克隆、载体和颗粒。该方法与常规表型鉴定结合，提供了具有所期望的例如减毒、温度敏感性、改变的免疫原性、冷适应性、小噬斑大小、宿主范围限制性等特性的嵌合RSV。如此确定的突变可以合并成一个“目录”并以各种组合导入来校准疫苗病毒到所选择的减毒、免疫原性和稳定性的水平。
在优选的实施方案中，本发明提供了包括用涉及相同或不同基因的其他类型的突变来补充一种或多种来自生物学上获得的RSV的突变例如，cp和ts突变。在此文中的突变的靶基因包括吸附(G)蛋白、融合(F)蛋白、小的疏水蛋白(SH)、RNA结合蛋白(N)、磷蛋白(P)、大聚合酶蛋白(L)、转录延伸因子(M2)、M2 ORF2、基质(M)蛋白以及两种非结构蛋白NS1和NS2。这些蛋白的每一种可被全部或部分选择性的缺失、替换或重排，单独或与其它期望的修饰联合，来获得新的嵌合RSV重组体。
在一方面，使SH基因在供体或受体中缺失来产生具有新表型特性的嵌合RSV，包括增强体外生长和/或在体内的减毒。在相关方面，此基因缺失，或另一个所选非必要的基因或基因片段的缺失，例如NS1或NS2基因缺失，被联合在带有一个或多个独立的决定减毒表型的突变的嵌合RSV中，所述突变例如直接(或以经修饰的形式，例如通过导入多个核苷酸变化到特指突变的密码子中)来自生物学上获得的减毒RSV突变体的点突变。
例如，SH基因的缺失可与一或多个得自cpts248/404，cpts5530/1009，cpts 530/1030或另一个所选的突变RSV毒株的cp和/或ts突变联合，来产生具有增加的病毒产量、增强的减毒以及从减毒表型反转的遗传抗性的嵌合RSV，这取决于不同突变的联合效果。
此外，其它的遗传改变可单独或与生物学上获得的突变体RSV的一或多个减毒点突变联合在嵌合RSV基因组或反基因组中产生。例如，来自非RSV来源的基因或基因片段可被整个或部分插入。可选择的，基因排列可被改变，基因重叠去除，或RSV基因组启动子用其反基因组的相应物替换。可进行嵌合基因组或反基因组的不同的或其它的修饰来促进操作，例如单一限制性位点在不同基因间隔区域(例如，G和F基因间的单一的Stul位点)中或在别处的插入。可通过去除非翻译基因序列来增强插入外源序列的能力。
可选择的，编码嵌合RSV基因组或反基因组的多核苷酸分子或载体可通过修饰来编码非RSV序列，例如，能够在目的宿主中引起保护性免疫应答的细胞因子、T-辅助抗原决定簇、限制性位点标记或微生物病原体(例如，病毒，细菌或真菌)蛋白。
本发明的另一个实施方案提供了一种含有包括经分离的编码上述嵌合RSV基因组或反基因组的多核苷酸的表达载体以及包括一或多个经分离的编码RSV的N、P、L和RNA聚合酶延伸因子蛋白的表达载体(相同的或不同的)的细胞或无细胞溶解产物。一旦表达，基因组或反基因组和N、P、L和RNA聚合酶延伸因子结合产生感染性RSV病毒或亚病毒颗粒。
本发明的减毒嵌合RSV能够在被感染的人宿主中启动保护性的免疫应答，且充分的减毒使其在免疫宿主中不会引起严重的不能接受的呼吸道疾病的症状。减毒的嵌合病毒或亚病毒颗粒可存在于细胞培养物的上清液中，从培养物中分离，或部分或全部纯化。病毒也可被冻干，且可与如所期望的其它不同的组分混合用于储藏或运送到宿主中。
本发明进一步提供了一种含有生理学上可接受的载体和/或佐剂以及上述的经分离的减毒嵌合RSV的新疫苗。在一个实施方案中，疫苗含有包含至少一个、优选两个或多个减毒突变或其它的如上述核苷酸修饰的嵌合RSV。疫苗可被配制成103到106PFU减毒病毒的剂量。疫苗可含有减毒嵌合病毒，其启动免疫应答抵抗单一RSV毒株或亚型例如A或B，或抗多个RSV毒株或亚型。在此方面，本发明的嵌合RSV可单独地启动单特异性免疫应答或多特异性的免疫应答抗多个RSV毒株或亚型。嵌合RSV可与其它具有不同免疫原性的用于更有效地保护抵抗一或多个RSV毒株或亚型的嵌合RSV或非嵌合RSV联合用于疫苗制剂中。
在相关的方面，本发明提供了一种用于刺激个体免疫系统在哺乳动物受验者中启动免疫应答抵抗一或多个RSV的毒株或亚型的方法。该方法包括给药一种在如上所述在生理学上可接受的载体和/或佐剂中的免疫充分量的减毒嵌合RSV制剂。在一个实施方案中，免疫组合物是一种含有至少一个、优选两个或多个减毒突变或其它如上述的核苷酸修饰的嵌合RSV的疫苗。疫苗可被配制成103到106PFU减毒病毒的剂量。疫苗可含有启动免疫应答抵抗单一RSV毒株或亚型例如A或B或抗多个RSV毒株或亚型的减毒嵌合病毒。在此文中，嵌合RSV可启动单特异性的免疫应答或抗多个RSV毒株或亚型的多特异性的免疫应答。可选择的，具有不同的免疫原性的嵌合RSV可被联合在疫苗混合物中或依据协同治疗建议分别给药，引起更有效的保护抵抗单RSV毒株或抵抗多个RSV毒株或亚型。
附图的简要说明附

图1是表示一系列亚型A呼吸道合胞病毒在鼠的肺中以及在黑猩猩中复制之间的大体上全部相关的图。
附图2和3表示了编码RSV反基因组RNA的cDNA的构建，其中附图2显示了cDNA和所编码的反基因组RNA的结构(不成比例)。为了本发明附图以及下面所有的实施例的描述，所用的具体cDNA和病毒是亚型A RSV的毒株A2。反基因组的图表包括以下特征T7启动子在5′-末端赋予非病毒G三联密码子，四个序列标记在位置1099(其使长度上增加了一个核苷酸(nt))，1139，5611，和7559处(从新限制位点的第一个碱基开始数起)，核酶和串联T7终止子，3′末端通过核酶裂解(裂解的位点用箭头表示)产生单一的非病毒3′-磷酰化U残基。注意，非病毒5′-GGG和3′-U残基并不包括在此处以及其后的反基因组中所给的长度值中。然而，在位置1099处的核苷酸插入被包括在内，因此cDNA衍生的反基因组的编号方式是此位置的下游反基因组比生物学上获得的反基因组大一个核苷酸。D46(基因组本身为负义)的5′到3′正义序列被描述在SEQ ID NO1中，其中在位置4处的核苷酸可为C或G。另外也应注意在此图表中限制性位点的序列位置自始至终被作为描述的向导且不单独限定涉及的所有核苷酸。长度值被赋予限制性片段且自始至终是描述性的，因为长度赋值可基于一些因素例如消化后留下的粘性末端而变化。整体表示完整反基因组的克隆cDNA片段也被显示。方框表示了BamHI位点从质粒载体中的去除，一种促进装配的修饰天然存在的BamHI-SalI片段(BamHI位点显示于正义链的上列，加下划线)被用PCR-产生的BglII-SalI片段替换(BglII显示于下列，加下划线；其4个核苷酸的粘性末端，用斜体字显示，与BamHI的相匹配)。结果产生一个单核苷酸变化(中列，加下划线)其在氨基酸水平是沉默的。附图3显示了包含在由cDNA编码的反基因组RNA中的序列标记，其中的序列为正义的且相对于前导区的第一个核苷酸被编号为1而进行编号；分别代表RSV亚型A和B的毒株A2和18537之间的相同之处，用圆点表示；代表cDNA中的限制性位点的序列用加下划线表示；基因起始(GS)和基因末端(GE)转录信号加方框；位置1141处的N翻译读码框的起始密码子用斜体字表示，限制性位点显示在每一序列的下面。在上方的序列中，单一的C残基被插入到位置1099处来产生NS2-N基因间隔区域的AflII位点，紧挨N翻译读码框上游的位置1139和1140处的AG被CC替换产生新的NcoI位点。在中间的序列中，位置5612和5616处的G和U被分别替换，在G-F基因间隔区域产生新的StuI位点。在下方序列中，位置7560处的C替换在F-M2基因间隔区域产生一个新的SphI位点。
附图4描述了涉及突变插入，完整反基因组构建体的装配，以及重组病毒回收的cDNA(大致成比例)的结构。四种类型的突变被插入到显示于下列的pUC118-或pUC119-cDNA亚克隆中，即在L基因中六个沉默限制性位点(在上面D53图表加下划线的部分)，两个在F基因中的HEK变化(H)，5个cp变化(cp)，以及对不同生物学诱变步骤特异的突变248，404，530，1009，和1030(如所显示的)。诱变处理的亚克隆被插入到显示于中列的D50(表示从前导序列到带有紧挨前导序列上游的T7启动子的M2-L重叠的起始部分的RSV反基因组)或D39(表示从M2-L重叠到带有核酶的非转录尾区以及紧挨非转录尾区下游的T7终止子的RSV反基因组)中间质粒中。适当的D50和D39被装配到显示在上列的全长D53反基因组cDNA中(RTT表示其后是两个T7转录终止子的锤头核酶的位置)。
附图5提供了6个被用于回收重组RSV的突变体反基因组cDNA的图谱。重组子的ts表型被描述在附图的右边。
附图6显示了编码含有侧接于RSV转录信号的CAT ORF的RSV反基因组的D46/1024CAT cDNA的构建(不成比例，RSV特异性片段显示为实心框且CAT序列显示为空心框)。CAT基因转录盒的来源为RSV-CAT微基因组cDNA 6196(图表上方)。RSV-CAT微基因组含有前导区，GS和GE信号，非编码(NC)RSV基因序列，CAT ORF，以及在GS信号前和GE信号后的XmaI限制性内切酶位点。这些元件的核苷酸长度被显示，XmaI位点周围的序列(正义的)被显示在图表的上方。一个8个核苷酸的XmaI接头被插入到亲本质粒D46的StuI位点来构建质粒D46/1024。D46是完整的反基因组cDNA且等价于D53；命名的不同是为了表示这些代表不同的制备方法。质粒6196的Xma-XmaI片段被插入到质粒D46/1024中来构建质粒D46/1024CAT。D46 cDNA编码的RNA被显示在下方，包括T7启动子赋予的5′-末端非病毒G残基以及通过锤头核酶的裂解赋予的3′-末端磷酰化U残基；所给反基因组的核苷酸长度不包括这些非病毒核苷酸。L基因被错开描绘来显示基因重叠。
附图7是编码RSV反基因组(顶部)亲本野生型D46质粒的图表(不成比例)和D46/6368衍生物的图，其中的SH基因已被缺失(底部)。RSV被显示为空心矩形，GS和GE转录信号在上游和下游末端显示为实心方框。用于产生RNA转录本(右)的3′末端的T7噬菌体启动子(左)和锤头核酶和T7终止子被显示为小的空方框。D46的ScaI和PacI片段被用短的合成片段替换，产生D46/6368。D46中SH基因的侧翼序列，以及D46/6368的工程区域的序列，在各自的质粒图谱上用方框表示。D46中Scal-PacI片段的序列以及在D46/6368中替换其的序列，被显示为粗体并用向上的箭头区别开。M GE，SH GS，SH GE和G GS位点用上划线表示。D46/6368中的新M-G基因间隔区域在图表的底部被标记为65来显示其核苷酸长度。SH-负型(SH-minus)D46/6368构建体的正义T7转录本被图示于底部；T7启动子赋予的3个5′-末端非病毒G残基以及3′-末端磷酰化U残基被显示(Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9211563-11567(1995)，引入本文作为参考)。这些非病毒核苷酸未被包括在长度值中。
附图8提供了来自用D46野生型或D46/6368 SH-负型病毒感染来确定SH部位缺失的细胞的总细胞内RNA的RT-PCR分析的结果。RT采用与SH基因上游退火的正义引物来进行。PCR还采用与SH基因下游退火的负义引物。泳道(1和5)由1Kb DNA序列梯组成的标记(Life Technologies，Gaithersburg，MD)；(2)经RT-PCR的D46/6368RNA；(3)经RT-PCR的D46 RNA(4)单独PCR的D46/6368 RNA。PCR产物在2.5％琼脂糖凝胶上电泳并用溴化乙锭染色。一些标记DNA片段的核苷酸长度被显示于右边。
附图9显示了D46野生型或D46/6368 SH-负型病毒编码的RNA的Northern印迹杂交；总胞内RNA被从感染的细胞内分离并用于没有在先变性步骤的寡聚(dT)色谱层析的试验，所选的RNA也包括夹心杂交的染色体组RNA。RNA在甲醛-琼脂糖凝胶上电泳并印迹到硝化纤维膜上。复制的印迹分别与M，SH，G，F，M2，或L基因的用[32P]标记的DNA探针杂交，如下所显示，泳道(1)D46/6368 RNA；(2)D46RNA(3)未感染的HEp-2细胞RNA。基因组MA(gen.)，mRNA(大字母)以及通读转录本(小字母)被显示在左边。通读转录本P-M和M-G(M探针)的位置重合，同样转录本G-F和F-M2(F探针)的位置也重合。0.24-9.5kb RNA梯分子量标记的位置(Life Technologies)被显示在右侧，其中的标记平行移动并通过用[32P]标记的λ噬菌体DNA杂交来观察。
附图10显示了在用D46野生型或D46/6368 SH-负型病毒感染的HEp-2细胞中合成的[35S]标记的RSV蛋白的SDS-PAGE电泳的结果。蛋白用抗纯化病毒体的抗血清进行免疫沉淀反应并且通过在预制的梯度4％-20％Tris-甘氨酸凝胶(Novex，San Diego，CA)电泳来分析。病毒蛋白的位置显示在左侧；标记蛋白(Kaleidoscope PrestainedStandards，Bio-Rad，Richmond，CA)的位置和分子量(用千道尔顿表示)显示在右侧。
附图11-13提供了D46野生型或D46/6368 SH-负型病毒在HEp-2细胞(附图11)，293细胞(附图12)以及AGMK-21细胞(附图13)中的生长曲线。三份在25cm2培养瓶中的细胞单层被用2 PFU/细胞的各病毒感染，并在37℃培养。在所显示的时间点取等分试样，-70℃保存，通过抗体染色在噬斑试验中进行平行滴定。每一显示的点为三种感染细胞单层的平均滴度。
附图14和15表示了在用D46野生型毒株，D46/6368 SH-负型病毒，或生物学上获得的cpts248/404病毒鼻内接种的鼠的上(附图14)和下呼吸道(附图15)中的病毒复制的动力学曲线。24个一组的小鼠用106PFU的所述病毒进行鼻内接种。每组中的6个小鼠在所指定的天被处死并切下鼻甲和肺组织进行匀浆，感染病毒的水平通过个体样本的噬斑试验来测定并确定平均对数的滴度。
附图16显示了SH-负型病毒的基因次序和转录产物与其野生型对应物的比较。上组概述了由SH-负型病毒产生的与野生型亲本重组病毒产生的特定mRNA量的比较。胞内mRNA被从用SH-负型病毒或野生型病毒感染的细胞中分离并通过基因特异性探针Northern印迹杂交来分析。测定杂交放射性的量，且显示SH-负型病毒病毒产生的各种mRNA对野生型亲代的相对丰度。下组显示了野生型病毒从M基因(基因次序的位置5)到L基因(位置10)的基因次序。这与SH-负型病毒的相比较，其G，F，M2和L基因的基因次序中的位置通过SH基因的缺失被改变了。
附图17描述了D46反基因组质粒，其通过SH基因的缺失被修饰且在此情况下不插入任何异源基因到重组病毒中。SH基因的侧翼序列被描述在上部。MGE，M-SR基因间的(IG)，SH GS，SH GE以及SR-G IG序列被显示。通过缺失被去除的部分被加下划线，被缺失的点用向上的三角形表示。此缺失产生的反基因组是D46/6340。
附图18描述了导入串联的翻译终止密码子到编码NS2蛋白的翻译读码框(ORF)中。质粒D13包含反基因组cDNA的左手末端，其包括T7启动子(带阴影的框)，前导区，以及NS1，NS2，N，P，M和SH基因。仅D13的cDNA插入序列被显示。含有T7启动子和NS1和NS2基因的AatII-AflII片段被亚克隆到pGem载体中，并且定点突变来修饰序列所示区域中的NS2 ORF。密码子18到26的野生型序列被显示(编码的氨基酸被显示在下面)，且上面三个核苷酸是三个被用来导入两个终止子密码(ter)和XhoI位点(加下划线)作为标记的替代物。产生的cDNA和后来回复的病毒被称为NS2-剔除(KO)。
附图19比较了在HEp-2细胞中通过野生型RSV(D53)以及NS2-剔除RSV的感染病毒的产量。三份单层试样用每种病毒以3 pfu/细胞的复数感染，且以所示的间隔取样品通过噬斑试验和免疫染色来定量测定。
附图20描述了NS1和NS2基因的基因末端(GE)信号的改变。显示了质粒D13从T7启动子(阴影)到位置4623的PacI位点的反基因组cDNA左手末端的cDNA插入。含有T7启动子和NS1和NS2基因的AatI-AflII片段被亚克隆到pGem载体中。通过在两个位点同时定点诱变来修饰，即NS1和NS2的GE信号被修饰与天然N基因中的信号相同。野生型NS1和NS2 GE信号的序列被显示(且通过相对于完整反基因组的序列位置来鉴定)，核苷酸替换被显示在线的上面。NS2 GE信号的野生型序列中的破折号表示通过突变使GE信号的长度增加了一个核苷酸。
附图21描述了编码NS1蛋白的多核苷酸序列的缺失，D13 cDNA的左手边部分被显示在底部D13含有反基因组cDNA的左手边部分，从前导序列到SH基因的末端，在紧靠前导区上游有T7启动子。缺失点(向上的箭头)的两侧的序列被显示在上部。缺失跨度从紧挨NS1 ORF的翻译起始位点前到紧挨NS2 ORF的翻译起始位点前。因此，其具有使NS1 GS和上游非编码区与NS2 ORF融合的作用。此排除了任何可能延伸到取决于其前导区邻近位置的NS1基因中的顺式作用序列元件的干扰。
附图22描述了编码NS2 mRNA的多核苷酸序列的缺失。如上所述，显示了D13 cDNA的左手边部分并显示了缺失点(向上的箭头)的两侧的序列。缺失的跨度从紧挨NS1基因的下游到紧挨NS2基因的下游。因此，编码NS2 mRNA的序列被全部缺失，但没有其它的序列被破坏。产生的cDNA和其后回收的重组病毒被称为ΔNS2。
附图23描述了G蛋白分泌形式的翻译起始位点的消除。298个氨基酸的G蛋白被显示为一个空心矩形，其中含有信号-锚序列。位置45到53的氨基酸序列被显示在上方来图解核苷酸替换，其改变氨基酸48从甲硫氨酸为异亮氨酸以及改变氨基酸49从异亮氨酸为缬氨酸。前一突变消除分泌形式翻译起始位点。两个突变也产生了MfeI位点，其提供了一种方便的用于检测突变的方法。产生的cDNA和其后回收的病毒被称为M48I(甲硫氨酸-48到异亮氨酸-48)。
附图24显示了由野生型RSV(D53)产生感染性病毒以及由回收的D53/M481膜G突变型病毒的两个分离物产生的感染性病毒的比较的结果。
附图25A显示了RSV毒株A2的反基因组RNA(抗原亚型A)且描述了F和G基因用其毒株B1的对应物(抗原亚型B)的替换。每一矩形代表一个编码单一mRNA的基因，在每一矩形的左边和右边末端的灰色的和实心方框分别代表基因起始(GS)和基因末端(GE)转录信号。在基因组的每一末端的细线代表前导(左末端)和非转录尾区(右末端)基因外区域，矩形之间的细线代表基因间隔区。在反基因组的水平通过分别在G基因之前和F基因之后的PacI和SphI位点进行基因替换。L基因被绘成错位来表示其和上游的M2基因重叠，具体的图与此实例中并无密切关系。
附图25B和25C图解了嵌合rAB病毒中的序列(正义)，也即重组RSV毒株A2，其中F和G糖蛋白基因被毒株B1的所替换。所显示的序列含有SH-G(B部分)和F-M2(C部分)的连接处。得自毒株A2骨架的序列被显示在下面的例子中，来自毒株B1供体的序列显示于上面的例子中。在A2和B1序列之间连接处的最后A2特异性核苷酸被依据未修饰的重组A2基因组序列编号。SH基因末端(GE)和F信号被加上方框。PacI和SphI的识别位点被用斜体字表示。IG基因间隔区。
附图26显示了毒株B1 G和F基因的cDNA的为了提高在E.coli中生长的稳定性的修饰。两个正义序列被显示上面(标记“新”)的是被修饰的B1序列，且下面(“野生型”)的为野生型B1序列。被显示的序列包括G翻译读码框(ORF)的下游末端，其编码的氨基酸(显示为在序列下面的单字母代码)，G GE信号(加框的)，G-F基因间隔区，F基因起始(GS)信号(加框的)。在新序列中的加下划线的位置代表替换；在新序列中的破折号代表缺失；在野生型序列中的破折号代表新序列中的插入。在新序列中产生的一个MfeI位点用粗斜体表示。显示了来自G-F基因间隔区的一个47个核苷酸的序列，在产生新序列中被缺失。
附图27图解了得自血清反应阴性的黑猩猩的上(上组；鼻咽擦拭)呼吸道和下(下组；气管灌洗)呼吸道的嵌合重组体AB wt RSV和ABcp248/404/1030衍生物的复制。此基于表46的数据。在每一图表中的浅色的水平点线为检测能力较低限。横木状标示显示了标准误差。
具体实施方案的描述本发明提供了被减毒并能够在易受RSV感染的哺乳动物患者中启动预防性或治疗的免疫应答的感染性嵌合呼吸道合胞病毒(RSV)。也提供了用于设计和生产减毒嵌合RSV的新方法和组合物，以及用于RSV感染的预防和治疗的方法和组合物。
本发明的嵌合RSV被重组工程改造以引入来自不止一个的RSV毒株或亚型的核苷酸序列来生产感染性的嵌合病毒或亚病毒颗粒。通过此方式，候选的疫苗病毒被重组工程改造以启动在哺乳动物宿主包括人和非人类灵长目动物中的抗RSV免疫应答。本发明的嵌合RSV可以启动对特定RSV亚型或毒株的免疫应答，或其可以启动抗多个RSV亚型或毒株的多特异性应答。
在本发明的实施方案中，一个RSV的异源基因、基因片段或单或多核苷酸被加到部分和整个RSV基因组或反基因组中，或在其中通过来自异源RSV的对应序列替换产生嵌合的RSV基因组或反基因组。本发明的嵌合RSV包括与不同RSV毒株或亚型病毒额外的或替代的“供体”基因或基因片段结合的RSV毒株或亚型病毒的部分或整个“受体”RSV基因组或反基因组。
在本发明的优选方面，嵌合RSV引入了部分或整个和一个结合来自不同的人RSV亚型或毒株的异源基因或基因片段的RSV亚型或毒株的人RSV基因组或反基因组。例如，优选的嵌合RSV引入了一个含有与来自不同人RSV A或B亚型病毒的异源基因或基因片段结合的部分或整个人RSV A或B亚型基因组或反基因组的嵌合基因组或反基因组。
来自一个RSV毒株或亚型的异源供体基因或基因片段被结合于或被替换到受体基因组或反基因组中，后者作为一个骨架用于插入或增加供体基因或基因片段。因此，受体基因组或反基因组作为一个载体来传递和表达异源基因或基因片段从而产生表现新的结构和/或表型特性的嵌合RSV。优选的，异源基因或基因片段添加或替换到所选择的受体RSV毒株中，与相应的未修饰的受体和/或供体的表型相比产生新的表型结果，例如减毒、生长变化、改变的免疫原性或其它目的表型变化。
在一个嵌合RSV基因组或反基因组中用作异源插入或添加的基因或基因片段包括编码NS1、NS2、N、P、M、SH、M2(ORF1)、M2(ORF2)、L、F或G蛋白及其部分的基因或基因片段。在本发明优选的实施方案中，嵌合RSV引入了编码RSV F、G或SH糖蛋白的异源基因。可选择的，嵌合RSV可以引入编码仅仅部分的所选择蛋白例如RSV F、G或SH糖蛋白的胞质区、跨膜区、胞外区或免疫原性抗原决定簇的基因片段。
在另一个实施方案中，用于疫苗制剂的嵌合RSV可被适当的修饰来适应流动病毒中的抗原变化。典型的修饰在是G和/或F蛋白中。来自一个RSV毒株的整个G或F基因或其编码部分免疫原性区的基因片段通过不同RSV毒株或亚型的受体克隆的相应区域的替换或通过加入一或多个基因例如一些抗原形式的拷贝被引入到嵌合RSV基因组或反基因组cDNA中。产生自被修饰的RSV克隆的子代病毒可被用在抗新兴RSV毒株的接种方法中。
因此，导入异源免疫原性蛋白、区域或抗原决定簇来产生嵌合RSV对于在免疫宿主中产生新的免疫应答是特别有用的。在不同RSV亚型或毒株的受体基因组或反基因组中，来自一个供体RSV亚型或毒株的免疫原性基因或基因片段的添加或替换能够产生直接抗供体亚型或毒株、受体亚型或毒株或抗供体和受体亚型或毒株二者的免疫应答。为了达到此目的，嵌合RSV也可以被构建表达一个嵌合蛋白，例如，具有与不同RSV胞外区融合的对RSV毒株或亚型特异的胞质尾区和/或跨膜区的免疫原性蛋白。这种类型的其它的重组体可表达重复蛋白区，例如重复免疫原性区。
虽然通常在嵌合基因组或反基因组中添加或替换整个基因(包括顺式作用的元件和编码区)是有用的，其也用于转移目的供体基因的部分。通常，非编码核苷酸例如顺式作用的调控元件和基因间隔序列不需和供体基因编码区一起被转移。此外，不同基因片段提供了有用的供体多核苷酸以包含在嵌合基因组或反基因组中，表达具有新的或有用特性的嵌合RSV。因此，异源基因片段可以编码来自于一个RSV的所选择蛋白的一个细胞质尾区、跨膜区或胞外区、抗原决定位点或区、一个结合位点或区、一个活性位点或含有活性位点的区等等。这些或其它的基因片段可以被添加或用于替换另一个RSV中的对应基因片段来产生新的嵌合重组体，例如表达具有融合于另一个RSV胞外区的一个RSV的细胞质尾和/或跨膜区的嵌合蛋白的重组体。在编码蛋白小功能区如抗原决定簇位点的基因片段的情况下，有用的基因片段大约长15-35个核苷酸，编码较大区域或蛋白区的基因片段大约长50、75、100、200-500和500-1,500或更多核苷酸。
为了构建嵌合RSV，异源基因可整个或部分地被添加在背景基因组或反基因组中或替换来形成嵌合基因组或反基因组。在由替换产生的嵌合体的情况下，来自一个RSV的所选择的蛋白或蛋白区(例如，胞质尾，跨膜区或胞外区，抗原决定位点或区，一个结合位点或区，一个活性位点或含有活性位点的区，等等)被不同RSV基因组或反基因组中的对应基因或基因片段替换来产生具有与野生型或亲本RSV毒株相比发生目的表型改变的新的重组体。此处所用“对应”基因、基因片段、蛋白或蛋白区指的是来自异源的两个相对应多核苷酸，包括单个RSV毒株的不同基因，或不同变体的相同基因，包括在不同的RSV亚型或毒株的种和等位基因变体。
对应基因和基因片段具有至少中度的结构相似性。例如，对应基因片段可以编码目的蛋白的共同结构域例如胞质区，跨膜区或胞外区，抗原决定位点或区，一个结合位点或区等等。典型的，其也具有共同的生物功能。例如，由对应基因片段编码的蛋白区可以提供一个共同的跨膜功能，特异性结合活性，免疫识别位点等等。典型的，对应基因和基因片段的产物之间共有的目的生物活性在量上非常相似，例如，其差别不多于30％，优选的不多于20％，更优选的不多于5-10％。
本发明所用的对应基因和基因片段包括具有一定大小和序列变化的不同种的集合。然而，对应基因和基因片段的选择依赖于受验对应物的基本序列相似性。在此文中，所选择的多核苷酸“参照序列”被限定为存在于供体或受体基因组或反基因组中的序列或其部分。此参照序列被用作已定序列，为序列比较提供基准。例如，该参照序列可被限定为cDNA或基因的片段，或整个cDNA或基因序列。
通常，一个用于限定对应基因或基因片段的参照序列至少具有20个核苷酸的长度，通常至少25个核苷酸长度，且经常至少50个核苷酸长。由于两个多核苷酸每一(1)包括一个在两个多核苷酸之间相似的序列(例如整个核苷酸序列的一部分)，且(2)可进一步包括在两个核苷酸之间有区别的部分，在两个(或多个)多核苷酸之间的序列比较一般通过用“比较窗口”比较两个多核苷酸来鉴定和比较序列相似性的局部区域而进行。此处所用的“比较窗口”，是指至少20个连续核苷酸概念上的片段，其中一个多核苷酸序列可以与至少20个连续核苷酸的参照序列相比较，且其中的在比较窗口中的多核苷酸序列的部分可含有与参照序列相比20％或更少的添加或缺失(即，缺口)，用于两个序列的最佳比对。可通过Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2482(1981)的局部同源性对比规则，通过Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48443(1970)的同源性对比规则，通过Pearson & Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444(1988)的相似性搜寻法(其均引入本文作为参考)，通过用电脑处理运行这些规则(Wisconsin Genetics SoftwarePackage Release 7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，GeneticsComputer Group，575 Science Dr.，Madison，WI，其引入本文作为参考)，或通过检验，进行用于对比比较窗口的最佳序列比对，并选择出通过不同的方法产生的最佳程序(即，在比较窗口产生最大的序列相似性百分比)。
此处所用的“序列同一性”，是指在比较窗口中的两个多核苷酸序列为相同的(即在核苷酸对核苷酸的基础上)。术语“序列同一性百分比”通过在比较窗口中比较两个最佳比对序列来计算。测定在两个序列中产生的相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、U或I)的位置数来产生相配的位点数，通过用在比较窗口中的总位点数(即窗口的大小)除相配的位点数，且将结果乘以100来得到序列同一性的百分数。此处所用的术语“基本同一性”表示多核苷酸序列的特性，其中多核苷酸序列包括在至少20个核苷酸位置、经常至少25-50个核苷酸的比较窗口中与参照序列相比，至少85％序列同一性的序列，优选的至少90％到95％的序列同一性的序列，通常为至少99％的序列相似性的序列，其中序列同一性百分比的计算是通过参照序列与可能包括比较窗口中总共20％或更少的参照序列的缺失或添加的多核苷酸序列来进行的。参照序列可以是较大序列的子集。
除了这些核苷酸序列的相互关系外，由本发明的嵌合RSV编码的蛋白和蛋白区也典型的被选择具有保守的关系，即，与所选的参考多肽有基本序列同一性或序列相似性。被用于多肽时，术语“序列同一性”是指在相应的位点具有相同氨基酸的肽。术语“序列相似性”是指在相应的位点具有相同或相似氨基酸(例如保守替换)的肽。术语“基本序列同一性”是指两个多肽序列例如通过利用默认缺口权重的GAP或BESTFIT程序进行最佳比对时具有至少80％的序列同一性，优选至少90％的序列同一性，更优选至少95％或更多(例如99％的序列同一性)的序列同一性。术语“基本相似性”是指两个多肽序列具有相应的序列相似性百分比。
优选的，不相同的残基位置通过保守的氨基酸替换来区分。保守的氨基酸替换是指具有相似侧链残基的可互换性。例如具有脂肪侧链的氨基酸的保守组为甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，和异亮氨酸；具有脂肪族羟基侧链的氨基酸的组为丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸的组为天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的氨基酸的组为苯丙氨酸，酪氨酸，和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸的组为赖氨酸，精氨酸，和组氨酸；以及具有含硫侧链的氨基酸的组为半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸替换组缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸，和天门冬酰胺-谷氨酰胺。20个常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)、非天然氨基酸例如α，α二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其它的非常规氨基酸也可以应用于本发明的多肽组分。非常规氨基酸的实例包括4-羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酸、ω-N-甲基精氨酸以及其它的氨基酸和亚氨基酸(例如，4-羟脯氨酸)。此外，氨基酸可以通过糖基化、磷酸化等进行修饰。
本发明在此公开了基于cDNA构建重组体、RSV病毒和亚病毒颗粒的方法。这些重组构建物提供了改进的用于疫苗制剂的减毒和免疫原性的特性。在此文中目的表型的改变为抗减毒表型反转，提高培养物或在所选择的宿主环境中减毒性，免疫原性特性(例如通过增强或减低所启动的免疫应答检测的)，所选病毒产物的转录和/或翻译的上调控或下调控等等。
本发明的一个优选的方面，产生的减毒嵌合RSV的嵌合基因组或反基因组通过导入一或多个决定减毒表型的减毒点突变被进一步修饰。这些点突变可被从头产生并通过合理的突变策略设计检测减毒效果。可选择的，减毒点突变在生物学上获得的突变体RSV中被鉴定然后被引入到本发明的嵌合RSV中。
用于引入到嵌合疫苗毒株中的生物学上获得的RSV减毒点突变可天然存在或通过公知的诱变方法被导入到野生型RSV毒株中。例如可通过化学诱变来产生不完全减毒亲本RSV毒株在病毒生长的细胞培养物中添加化学诱变剂，并通过选择适于导入生长限制突变的亚适宜温度下能传代的病毒，或通过选择在细胞培养物中产生小噬斑(sp)的突变病毒进行。这些通常描述在USSN 08/327,263，引入本文作为参考。
“生物学上获得的RSV”是指不是通过重组方法产生的任何RSV。因此，生物学上获得的RSV包括天然存在的所有亚型和毒株，例如包括具有野生型基因组序列的天然存在的RSV和具有来自参照野生型RSV序列的基因组变化的RSV，例如，具有决定减毒表型的突变的RSV。同样地，生物学上获得的RSV包括来源于通过其它的人工诱变和选择方法获得的亲本RSV毒株。
为产生来自生物学上获得的株的令人满意的减毒RSV，优选突变被导入不完全或部分减毒的亲本毒株例如RSV亚型A的A2毒株或其衍生物或亚克隆的公知的ts-1或ts-1NG或cpRSV突变体。利用这些或其它部分减毒的毒株，可产生其它突变以进一步减毒，例如在哺乳动物的宿主中产生目的水平的限制性复制同时保留充分的免疫原性来赋予疫苗保护性。
可通过公知在适宜的细胞底物中生物学克隆野生型病毒的方法产生亚型A或B病毒的部分减毒突变株并开发例如冷传代的突变株，对病毒进行化学诱变产生ts突变株，或选择小噬斑或相似的表型突变株(参见，例如，Murphy等，国际申请WO 93/21310，引入本文作为参考)。对于亚型B的病毒而言，部分减毒亲本病毒例如为cp 23，其是亚型B的B1毒株的一个突变体。
多种已知的筛选技术可结合此处描述的可用于进一步衍生的非减毒亚型A或B毒株来产生部分减毒突变株。进一步的，特异于减毒表型的突变可通过单独导入或结合不完全减毒的亚型A或B病毒来产生疫苗病毒，其具有多种赋予疫苗目的水平的减毒和免疫原性的减毒突变。
如上所述，充分减毒的生物学上获得的RSV突变株的产生可通过很多已知的方法来进行。在此方法中包括在渐低的减毒温度下的细胞培养物中传代培养部分减毒的病毒。例如，野生型病毒一般被培养在34-37℃，部分减毒的突变株则在细胞培养物(例如初级牛肾细胞中)中在亚适温例如20-26℃下传代产生。因此，cp突变株或其它的部分减毒株，例如ts-1或spRSV被调整到在较低温度大约低到20～24℃，优选20-22℃下在MRC-5或Vero细胞中通过传代进行有效的生长。与部分减毒的亲本相比，在冷传代中选择突变体RSV显著地减少了衍生毒株中任何残余的毒