专利名称：胶原凝胶人工真皮替代物的制作方法 国内尚无此类产品上市或申请专利；国外有同类产品，但无相同成分的人工真皮上市或申请专利。与本发明密切相关的技术为胶原海绵人工真皮、脱细胞异体真皮、人造材料真皮替代物。胶原海绵人工真皮的制作过程中需使用交联剂，移植后对机体有毒性；脱细胞异体真皮和人造材料真皮替代物在结构和组成上离正常皮肤尚有一定的差距。
本发明的目的是提供一种胶原凝胶人工真皮及其制备方法。本发明可以克服已有技术的缺点，可以直接应用于移植给皮肤缺损病人，促进伤口处肉芽组织生成和临近上皮游走，促进皮肤缺损的修复和再生。本发明的组成和体积比为牛腱胶原分散液20-80份DMEM培养液10份谷氨酰胺溶液0.25-1份碳酸氢钠溶液1-6份胎牛血清12份人胎真皮成纤维细胞悬液6份。本发明的组成和体积比可以为牛腱胶原分散液80份DMEM培养液10份谷氨酰胺溶液1份碳酸氢钠溶液6份胎牛血清12份人胎真皮成纤维细胞悬液6份。本发明的制备方法包括下述步骤1)在冰浴条件下于容器中依次加入计量的DMEM培养液，谷氨酰胺溶液，碳酸氢钠溶液，胎牛血清，牛腱胶原分散液份，均匀混合，再加入人胎真皮成纤维细胞悬液混匀；2)加入到培养板中，置于CO2培养箱中，待凝胶形成后加入DMEM-10％胎牛血清培养液，37℃，5％CO2下培养2-3周，即得胶原凝胶人工真皮。本发明体外培养的胶原凝胶人工真皮呈乳白色，半透明状，具有一定的机械强度和良好的亲水性；H&E染色证实，人胎真皮成纤维细胞在凝胶内分布均匀，呈现出典型的梭形；免疫组化染色证实，培养过程中，胶原凝胶内成纤维细胞分泌I型胶原和纤维连接蛋白，使得胶原凝胶的基质组成类似正常皮肤。本发明胶原凝胶人工真皮制备方法技术简单，其组成和理化性质接近正常真皮，具有潜在的临床应用前景，可以直接应用于移植给皮肤缺损病人，促进伤口处肉芽组织生成和临近上皮游走，促进皮肤缺损的修复和再生。


图1胶原凝胶人工真皮培养第2周，凝胶的HE染色(×80)。
图2胶原凝胶人工真皮体外培养2周，I型胶原免疫组化染色(×160)
实例1取处于指数生长期的第2-3代人胎真皮成纤维细胞，0.25％胰蛋白酶溶液消化，吹打，离心，悬浮于DMEM-10％胎牛血清培养液中，血球计数板计数，调整细胞浓度至5.0×106/ml，待用；用0.01M的醋酸溶液(已灭菌)和本实验室提取的牛腱I型胶原(已灭菌)配制0.2％的胶原分散液，取40ml待用；配制浓缩的DMEM(10倍)培养液5ml，0.3M的谷氨酰胺溶液0.5ml，1M的碳酸氢钠溶液1.8ml，胎牛血清6ml；将上述4种溶液和40ml胶原分散液按顺序滴入100ml无菌锥形瓶(置于冰块上，即冰浴条件下)中，再加入3ml成纤维细胞悬液，迅速混匀，立刻用吸管将此胶原-细胞混悬液滴入12孔板中，每孔3ml，37℃培养箱中静置3-5分钟，待凝胶形成后，每孔加入DMEM-10％胎牛血清培养液各1ml，37℃，5％CO2下培养。以后每2天换液一次，2-3周后，即得到胶原凝胶人工真皮。测定结果见表1(用拉力试验机测定)、表2(接触角测定仪测定)表1 胶原凝胶的机械性能测定结果样品第1天 第4天 第8天 第12天抗拉强度40，39，4245，45，4653，50，5357，59，60(Kpa)平均40.3 45.3 5259
表2胶原凝胶的接触角测量结果样品 第1天 第4天 第8天 第12天接触角(度)32，34，3133，34，3335，34，3634，36，33平均 32.3 33.3 3534.3实例2取处于指数生长期的第2-3代人胎真皮成纤维细胞，0.25％的胰蛋白酶溶液消化0.5-1分钟后，加入2ml胎牛血清中止消化，吹打、分散细胞成单细胞悬液，悬浮于DMEM-10％胎牛血清培养液中，血球计数板计数，调整细胞浓度至5.0×106/ml，待用；用0.01M的醋酸溶液(已灭菌)和本实验室提取的牛腱I型胶原(已灭菌)配制0.2％的胶原分散液，取80ml待用；配制浓缩的DMEM(×10)培养液10ml，0.3M的谷氨酰胺溶液1ml，1M的碳酸氢钠溶液3.6ml，胎牛血清12ml；将上述4种溶液和80ml胶原分散液按顺序滴入200ml无菌锥形瓶(置于冰块上)中，再加入6ml人胎真皮成纤维细胞悬液，迅速混匀，立刻用吸管将此胶原-细胞混悬液滴入60mm塑料培养皿中，每皿8ml，37℃培养箱中静置5分钟，待凝胶形成后，每孔加入DMEM-10％胎牛血清培养液各2ml，37℃，5％CO2下培养。以后每2天换液一次，培养2-3周后，即得到胶原凝胶人工真皮。
实例3取处于指数生长期的第2-3代人胎真皮成纤维细胞，0.25％胰蛋白酶溶液消化，吹打成单细胞悬液，悬浮于DMEM-10％胎牛血清培养液中，血球计数板计数，调整细胞浓度至5.0×107/ml，待用；用0.01M的醋酸溶液(已灭菌)和本实验室提取的牛腱I型胶原(已灭菌)配制成0.2％的胶原分散液，取20ml待用；配制浓缩的DMEM(×10)培养液2.5ml，0.3M的谷氨酰胺溶液0.25ml，8.4％的碳酸氢钠溶液1ml，胎牛血清3ml；将上述4种溶液和40ml胶原分散液按顺序滴入50ml无菌锥形瓶(置于冰块上)中，再加入1ml人胎真皮成纤维细胞悬液，迅速混匀，立刻用吸管将此胶原-细胞混悬液滴入24孔培养板中，每孔1ml，37℃培养箱中静置3-5分钟，待凝胶形成后，每孔加入DMEM-10％胎牛血清培养液各0.8ml，37℃，5％CO2下培养。以后每2天换液一次，培养2-3周后，即得到胶原凝胶人工真皮。
实例4使用实例1制得的胶原凝胶人工真皮进行HE染色实验(常规染色实验方法和条件)，结果见图1。I型胶原免疫组化染色(常规染色实验方法和条件)结果见图2。


本发明涉及生物工程技术，特别是胶原凝胶人工真皮及其制备方法。包括牛腱胶原分散液80份，DMEM培养液10份，谷氨酰胺溶液1份，碳酸氢钠溶液6份，胎牛血清12份混匀后，加入人胎真皮成纤维细胞悬液6份，体外培养即可制成胶原凝胶人工真皮。本发明胶原凝胶人工真皮制备方法技术简单，其组成和理化性质接近正常真皮，具有潜在的临床应用前景，可以直接应用于移植给皮肤缺损病人，促进伤口处肉芽组织生成和临近上皮游走，促进皮肤缺损的修复和再生。