专利名称：海洋微生物发酵生产低温豆豉溶栓酶的方法豆豉溶栓酶(Nattokinase，简称NK)是ー种碱性丝氨酸蛋白酶，无毒性，可ロ服(李江伟等，中国药学杂志，1999)，易被人体吸收，能直接溶解纤维蛋白，具有強烈溶栓功能(郝征红等，农业工程学报，2008 ;彭勇等，高技木通讯，2002)，且溶栓作用时间长，作为新一代理想的预防和治疗血栓的生化药物，具有广阔的应用前景(陶琳，氨基酸和生物资源，2004)。早期临床上应用最多的溶栓剂是链激酶、尿激酶等，虽可以促进血液中血纤维蛋白溶酶的形成或可以直接对血栓进行溶解，但都存在不同程度的不足，如半衰期短、抗原性強、副作用较大等，很难成为ー种大众药品(卢露，中国调味品，2011)。溶栓研究中期阶段，鉴于NK独特的优势，对其研究开始起步并日渐增多，主要集中普通微生物发酵生产中温型NK，处于菌株选育、发酵条件优化、酶学性质，酶分离纯化以及工程菌构建等(陶琳，氨基酸和生物资源，2004 ;豆孝伟，现代食品科技，2006)，普通微生物发酵生产NK已然成为研究的热点。而海洋微生物发酵生产低温NK的研究尚在起步阶段，产业化、规模化海洋微生物发酵生产NK还未见报道。鉴于早期溶栓剂的不足，普通微生物大規模发酵的可行性，利用海洋微生物发酵生产低温NK具有先进性。海洋微生物发酵生产的NK与普通微生物发酵生产的中温NK具有很大的应用优势。普通微生物发酵生产的NK最适作用温度一般为45 550C，而人体的生理温度一般为36. 5 37°C，致使普通微生物发酵生产的NK不能充分发挥作用，出现治疗效果差或没有效果。海洋微生物(低温、寡营养、低光照、高压)发酵生产的NK最适作用温度一般为35 40°C，比较接近人体的生理温度，应用于治疗效果比较明显。海洋NK在生理温度下具有高酶活力及高催化效率，可大大缩短溶栓过程的时间，这将有助于NK在临床医学上的应用和推广，从根本上弥补早期临床溶栓药物的不足。鉴于海洋微生物发酵生产的NK上述的优势，海洋NK作为临床新型溶栓药物具有广阔的应用前景和开发潜力。
本发明的目的是提供ー种海洋微生物发酵生产低温NK的方法。该方法主要是海洋微生物经过定向驯化后，在常规条件下液体发酵生产低温NK的方法，这种生产方法获得的低温NK活性可以达到120U/ml，如再经过系列分离和纯化，可以得到不同浓度和纯度的酶制剂。ロ服2000U 4000U每日用量应用于小鼠实验，22 37天表现出明显的溶栓效果。该酶制剂应用方便、快捷、成本低。可以从根本上避免其它溶栓剂应用的弊端。本发明所述的ー种海洋微生物发酵生产低温NK的方法具体包括以下步骤(I)将产生低温NK的海洋微生物进行定向驯化，使其在培养条件下生长良好；(2)按常规方法将低温NK产生菌在10 16°C逐级扩大培养，制备成液体ー级种子和ニ级种子；(3)将液体一级种子或ニ级种子，按发酵液体积的3 9%接种量接入液体发酵培养基中，在10 16°C培养60 96h吋，即海洋微生物发酵生产低温NK结束；(4)将(3)的发酵液在4，000 8，OOOrpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液； (5)根据不同需要和使用对象不同，将(4)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。本发明中使用的菌种来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，初期活化和生长条件按菌种保藏单位提供的说明进行。NK产生菌(例如，CGMCC菌种编号I. 47或I. 3)先活化、定向驯化后，按本发明产酶条件发酵生产低温NK。驯化后的菌株在4°C环境中可保存2个月，用10 25%甘油制成的菌悬液、在_80°C条件下可以长期保藏。I.0L, pH 值 7. 0,121°C高压蒸汽灭菌 30min。②菌种定向驯化培养基蛋白胨3. O 7. 0g，牛肉膏3. O 7. 0g，纤维蛋白10. O 20. 0g, NaCl 5.0 15. 0g，琼脂18 22g，蒸馏水I. 0L, pH值自然，12TC高压蒸汽灭菌30mino③液体种子培养基胰蛋白胨8. O 12. 0g，酵母粉4. O 6. 0g，NaCl 8. O 10. Og,自来水I. 0L, pH自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。④发酵产酶培养基葡萄糖13. O 17. 0g，蛋白胨13. O 17. Og,酵母粉I. 2 I.7g, CaCl2 ·2Η20 O. I 0. 3g, K2HPO4 2· O 3. 0g，MgSO4 ·5Η20 0· 3 0. 7g, KH2PO4 O. 3 0.7g, NaCl 8.0 12. 0g，自来水I. 0L，pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。(2)将产生NK的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；(3)将⑵活化好的菌种进行定向驯化，使其在培养条件下生长良好；(4)按常规方法将定向驯化后的低温NK产生菌在10 16°C培养24 36h而后按5 8%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和ニ级种子；(5)将(4)制备的ニ级种子按发酵液体积3 5%的接种量接入10L的产酶培养基中，在10 12°C培养84 96h吋，即海洋微生物发酵生产低温NK结束；(6)将(5)的发酵液在4，000 8，OOOrpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液；(7)根据不同需要和使用对象不同，将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温NK制剂。实施例ニ
(I)培养基制备①菌种活化培养基蛋白胨15. 0g，牛肉膏10. Og7NaCl 10. 0g，琼脂20. 0g，蒸馏水
I.0L, pH 值 7. 0,121°C高压蒸汽灭菌 30min。②菌种定向驯化培养基蛋白胨3. O 7. 0g，牛肉膏3. O 7. 0g，纤维蛋白10. O 20. 0g, NaCl 5.0 15. 0g，琼脂18 22g，蒸馏水I. 0L, pH值自然，12TC高压蒸汽灭菌30mino③液体种子培养基胰蛋白胨8. O 12. 0g，酵母粉4. O 6. 0g，NaCl 8. O 10. Og,自来水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。④发酵产酶培养基葡萄糖13. O 17. 0g，蛋白胨13. O 17. Og,酵母粉I. 2 I. 7g, CaCl2 ·2Η20 O. I 0. 3g, K2HPO4 2· O 3. 0g，MgSO4 ·5Η20 0· 3 0. 7g, KH2PO4 O. 3
0.7g, NaCl 8.0 12. 0g，自来水I. 0L，pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。(2)将产生低温NK的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；(3)将(2)活化好的菌种进行定向驯化，使其在培养条件下生长良好；(4)按常规方法将定向驯化后的低温NK产生菌在在10 16°C培养24 36h而后按5 8%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和ニ级种子；(5)将(4)制备的ニ级种子按发酵液体积5 7%的接种量接入50L的产酶培养基中，在12 14°C培养72 84h吋，即海洋微生物发酵生产低温NK结束；(6)将(5)的发酵液在4，000 8，OOOrpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液；(7)根据不同需要和使用对象不同，将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温NK制剂。实施例三(I)培养基制备①菌种活化培养基蛋白胨15. 0g，牛肉膏10. Og7NaCl 10. 0g，琼脂20. 0g，蒸馏水
1.0L, pH 值 7. 0,121°C高压蒸汽灭菌 30min。②菌种定向驯化培养基蛋白胨3. O 7. 0g，牛肉膏3. O 7. 0g，纤维蛋白10. O 20. 0g, NaCl 5.0 15. 0g，琼脂18 22g，蒸馏水I. 0L, pH值自然，12TC高压蒸汽灭菌30mino③液体种子培养基胰蛋白胨8. O 12. 0g，酵母粉4. O 6. 0g，NaCl 8. O 10. Og,自来水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。
④发酵产酶培养基葡萄糖13. O 17. 0g，蛋白胨13. O 17. Og,酵母粉I. 2 I. 7g, CaCl2 ·2Η20 O. I 0. 3g, K2HPO4 2· O 3. 0g，MgSO4 ·5Η20 0· 3 0. 7g, KH2PO4 O. 3
0.7g, NaCl 8.0 12. 0g，自来水I. 0L，pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。(2)将产生NK的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；(3)将⑵活化好的菌种进行定向驯化，使其在培养条件下生长良好；(4)按常规方法将产物定向驯化后的低温NK产生菌在10 16°C培养24 36h而后按5 8%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和ニ级种子；
(5)将(4)制备的ニ级种子按发酵液体积7 9%的接种量接入200L的产酶培养基中，在14 16°C培养60 72h时，即海洋微生物发酵生产低温NK结束。(6)将(5)的发酵液在4，000 8，OOOrpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶
液。 (7)根据不同需要和使用对象不同，将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温NK制剂。


本发明所述的一种海洋微生物发酵生产低温豆豉溶栓酶的方法是将产生低温豆豉溶栓酶的海洋微生物进行定向驯化，使其在培养条件下生长良好；将定向驯化的豆豉溶栓酶产生菌在10～16℃培养24～36h而后按5～8％的接种量进行逐级扩大培养，按发酵液体积的3～9％接种量接入液体发酵培养基中，在10～16℃培养60～96h时，即海洋微生物发酵生产低温豆豉溶栓酶结束；发酵液在4,000～8,000rpm离心收集液体，收集的液体即为粗酶液；根据不同需要和使用对象不同，可以将粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。