专利名称：一种抗凝溶栓双功能融合蛋白的脂质体制剂及制备方法瑞替普酶(Ret印lase，r-PA)是人组织纤溶酶原激活剂(t_PA)的异构体，是已 被用于临床的第三代溶栓药物。水蛭素(Hirudin) C末端的12肽(53飞4 aa)是水蛭素 具有最大抗凝活性所必需的最小肽段，其较小的分子量相对于水蛭素全长蛋白来说更有利 于降低出血副作用。本研究室在前期工作中构建表达了重组HV12p-rPA融合基因(专利 号ZL 2006 1 0022457. 8 CN1970574 B)。经基因测序、蛋白质结构解析、层析复性及纯化、 体外生物学活性检测以及动物体内药效学研究，证实HV12p-rPA结构正确且具有抗凝血 和溶栓双重功能，表明该融合蛋白质可作为一种潜在的兼具抗凝和溶栓效果的新药。本研 究将HV12p-rPA制备成脂质体剂型，以求进一步提高靶向性和降低出血副作用为融合蛋白 HV12p-rPA应用于临床实验，开发成为新一代溶栓药物更近一步。脂质体的制备方法常用的有薄膜法、逆相蒸发法、溶剂注入法和复乳法等。评价 脂质体质量的指标有外观、粒径分布和包封率等，其中包封率是衡量脂质体内在质量的一 个重要指标。在脂质体制备过程中，温度、脂质的组成及浓度、缓冲液PH、均质化过程、蛋白 类药物性质等因素都会影响包封率和药物的稳定性。温度越高使氯仿挥发的时间加快，成 膜越快，但温度过高会使成膜不均一而是包封率下降。用于制备脂质体的磷脂有天然磷脂， 如豆磷脂、卵磷脂等；合成磷脂，如二棕榈酰磷脂酰胆碱，二硬脂酰磷脂酰胆碱等。常用的 附加剂为胆固醇。本研究使用天然的大豆卵磷脂，价格较合成磷脂便宜，适于应用于生产。 胆固醇也是两亲性物质，与磷脂混合使用，可制得稳定的脂质体，其作用是调节双分子层的 流动性，减低脂质体膜的通透性。为保证包封率，磷脂与胆固醇物质量之比在7:广1:1之 间，具体比例为多少需要根据优化设计来确定；缓冲液PH常选择pH7. 4，既保证了药物的稳 定性又保证了 HV12p-rPA的蛋白活性；薄膜分散法是一种经典的制备方法，它可形成多室 脂质体，经超声处理后得到小单室脂质体，超声处理的过程会使包封率降低和蛋白药物活 性的受损，本研究发现在超声功率为50w，时间分别在5min、10min、15min时，活性分别为 23810士 1. 69、23810士 1. 01、10291 士0. 67。HV12p_rPA 是分子量为 39. 6KB 的大分子蛋白药 物，在制备脂质体的过程中如何确保其生物活性的保留和较高的包封率是研究的重点。王向涛等在“血栓靶向尿激酶脂质体的制备及其体内溶栓效果”([J].药学学报， 2003，38 (3) :231-235)中通过逆向蒸发法制得的尿激酶脂质体包封率仅为65%;张霞等在 “纳豆激酶脂质体的制备及其体外释放”([J].中国药学杂志，2007年2月第42卷第2期) 中用薄膜分散法，将大豆卵磷脂与胆固醇溶于乙醚适量，25°C减压旋蒸制得的纳豆激酶脂 质体包封率为M%，粒径为235. 7nm。薄膜分散法是将磷脂和胆固醇溶于有机溶剂后，通过 挥干有机溶剂，使磷脂和胆固醇均一分散成膜，然后再加入水相混合成乳。此法可以避免有 机相与蛋白质接触，保证蛋白的结构与生物活性不被破坏。将已制备成乳的脂质体通过超声波、高压乳勻器、挤压器等方法，可以将粗制的 脂质体均一且达到需要的粒径。Jacques-Philippe等在“Protein en-capsulation in liposomes: efficiency depends on interactions between protein and phospholipids bilayer" ([J]· BMC Biotech-nology, 2002,2(9) : 1-8)利用挤出器均质仪，随着挤出次 数的增多，包封率发生了由高到低再由低到更高的变化过程。高压均质仪对脂质体进行 均质的次数也会影响蛋白质类药物的活性Barnadas-Rodriguez R在“!^actors involved in the pro-duction of liposomes with a high-pressure homogenizer，，([J].Int J Pharm, 2001，213(1/2):175-186)。上述文献所报道的脂质体的制备方法，对于制备大分子蛋白质药物来说，除了包 封率不高以外，也会大大破坏蛋白质的生物活性。这大大损耗了药物量，降低了药物利用 率，提高了成本，且得到的脂质体保留活性不高，粒径较大不利于静脉注射。
鉴于此，本发明提供了一种改良的薄膜分散-超声法来制备HV12p_rPA的脂质体， 以优化的探头超声条件，探头超声用于减小均一脂质体的粒径是一种常用的方法，它操作 简单，且均一效果明显，但超声功率和时间过大、过长都会破坏蛋白类药物的活性，但是时 间过短又不能达到减小脂质体粒径的目的。本发明在探头超声50W，间隔2s，考察了 5min、 10min、15min三个水平，最后确立了 IOmin为最佳条件，既减小了脂质体的粒径又保证了 HV12p-rPA活性。均一减小粒径，可以满意地解决上述问题。本发明以改良的薄膜分散-超声法制备HV12p_rPA脂质体，先将大豆卵磷脂 与胆固醇，用于制备脂质体的磷脂有天然磷脂，如豆磷脂、卵磷脂等；合成磷脂，如二棕榈酰 磷脂酰胆碱，二硬脂酰磷脂酰胆碱等。常用的附加剂为胆固醇。本研究使用天然的大豆卵 磷脂，价格较合成磷脂便宜，适于应用于生产。胆固醇也是两亲性物质，与磷脂混合使用，可 制得稳定的脂质体，其作用是调节双分子层的流动性，减低脂质体膜的通透性。本实验所诉 的磷脂为大豆卵磷脂。以一定的量溶解于氯仿实验中发现当氯仿的用量过少(<8mL)不能 溶解磷脂，导致无法均勻成膜；过多又使磷脂浓度降低，导致包封率不高。氯仿是薄膜分散 法常用的有机溶剂，除了氯仿以外，还可以选择丙酮、乙醚等有机溶剂。本实验所允许的有 机溶剂包括氯仿、丙酮、乙醚等所有有机溶剂。在35°C下减压旋干成膜温度越高使氯仿挥 发的时间加快，成膜越快，但温度过高会使成膜不均一而是包封率下降。薄膜分散法即是要 通过减压来成膜。本专利所诉的温度范围为15、5°C，其中35°C为优选的最佳温度。加入 一定量缓冲液的体积一般要求在5mL到20mL之间的HV12p_rPA的磷酸盐缓冲液缓冲液pH 常选择pH7. 4，既保证了药物的稳定性又保证了 HV12p-rPA的蛋白活性。本专利所述的缓冲 液为一切无机盐缓冲液，PH范围为5.0~8. 0。水浴超声成乳后，再通过筛选的探头超声条件 发明在探头超声50W，间隔k，考察了 5min、10min、15min三个水平，最后确立了 IOmin为最 佳条件，既减小了脂质体的粒径又保证了 HV12p-rPA活性。本专利所述的探头超声条件为 25W 100W，时间为5 15min均一减小粒径。优化方案如下采用正交试验均一设计，对影响脂质体包封率的因素进行筛选，选出4个影响较大的 因素磷脂与胆固醇的比(A)、药物浓度(B)、PBS体积(C)、水浴超声时间(D)。把这四种因素作为主要考察因素，每个因素又取了三个水平，采用正交设计法L 9 (34)进行实验。以 包封率作为评价标准，优化脂质体制备的处方和工艺。通过极差分析显示最佳组合为大豆 卵磷脂与胆固醇的比为3 :1，药物浓度为％ig/ml，HV12p-rPA磷酸缓冲液10ml，水浴超声 IOmin0采用单因素试验优化探头超声时间，在50W，间隔2s下选出3个时间段5min、 1 Omiη、15miη，以HV12p_rPA脂质体的包封率、粒径、体外溶栓活性为考察目标，筛选出 IOmin为最佳探头超声时间。以下通过实施例的再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但 不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明上述技术思想 情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均应包括在本发明 的范围内。
图1为在透射电镜下(X60 000)观测到的HV12p_rPA脂质体(实施例四)。

对影响脂质体包封率的因素进行筛选，选出4个影响较大的因素大豆卵磷脂与胆固 醇的比(A)、药物浓度(B)、PBS体积(C)、水浴超声时间(D)。以这四种因素作为考察因素， 每个因素取三个水平，采用正交设计法L 9 (34)进行实验。实验设计如表1。表1四因素三水平正交设计表


本发明涉及生物制药领域，具体地说是涉及一种抗凝溶栓双功能融合蛋白——水蛭素12肽和瑞替普酶抗凝溶栓双功能融合蛋白(HV12p-rPA)的脂质体制剂及制备方法。由本研究室构建的抗凝溶栓双功能融合蛋白(HV12p-rPA)，经结构鉴定、表达、层析复性及纯化和体外体内药效学实验，已证明具有抗凝和溶栓的双功效。本研究以其为原料药，制备其脂质体制剂，采用优化的薄膜分散-探头超声法制备脂质体，其特征是以磷脂与胆固醇比、蛋白药浓度、缓冲液体积、水浴超声时间为影响因素筛选最适合提高HV12p-rPA脂质体包封率的处方，并且以探头超声进一步减小均一其粒径，制得粒径在140~145nm可以用于静脉注射的HV12p-rPA脂质体。该方法制得的HV12p-rPA脂质体包封率达90%以上，且体外溶栓活性和体外抗凝活性分别为23810IU·mg-1、414ATU·mg-1。