专利名称：包含益生菌的管饲模块的制作方法包含益生菌的管饲模块 本发明涉及通过管饲施用的肠内营养领域。具体而言，本发明提供包含益生微生物的管饲模块(tube feeding module)。这类益生微生物可以是例如非复制型微生物，如生物活性的热处理的益生微生物。人体主要从摄入的食物获取其资源。但是，在某些条件下，患者可能不能在无帮助的情况下摄入足量食物。通常，这可以是手术后和/或重症监护条件下的住院患者的情况。这类患者可以不能或不愿意足量接受口腔进食。对于具有功能胃肠道但不能口服摄入足量营养物的患者，肠内管饲是确保正确营养，以允许快速恢复的有价值的选择。与肠胃外营养相比，通常优选肠内营养，因为降低了并发症例如感染的风险、保持了胃肠道的结构和功能并降低了费用。肠内营养的典型适应症包含例如厌食症、蛋白质营养不足、肝功能衰竭、手术的肠 准备、肠外瘘闭合、大量肠切除后或可以引起吸收障碍的障碍中的小肠适应、无法口腔进食、创伤和/或引起代谢应激的危重症。为这类病症开发了标准化管饲制剂，且已上市销售。为了专门的需要，这些标准管饲制剂可伴随用于管饲的特定模块。这些模块是市售的产品，其通常包含单个营养素，例如蛋白质、脂肪或碳水化合物。这样的喂养模块用于满足患者的特定需要，以有效治疗特定缺陷，从而保证最佳的恢复。尤其是在住院条件下，患者的肠道正常微生物区系可以由于例如抗生素制剂的消耗而显著受损。但是，需要起作用的肠道正常微生物区系来确保来自所摄入的食物的营养物的正确吸收。此外，住院患者的免疫系统常由于他们的一般健康条件和由于应激而受损，尤其是在手术之前或之后。最后，如果管饲还提供抗炎化合物，则它将是优势，该抗炎化合物是天然的，且可在无副作用风险的情况下安全施用。因此，本领域中存在对管饲模块的需要，该管饲模块允许改善消化道的功能、强化免疫系统和/或提供抗炎作用，同时易于以工业规模产生，且理论上将不随更长的保质期或提高的温度丧失活性。本发明人已满足了此需要。因此，本发明的目的是改进现有技术的状态和满足所述需要。本发明人惊奇地看到，他们可以通过独立权利要求的主题来达到此目的。从属权利要求进一步发展了本发明的想法。本发明者惊讶地发现，包含益生微生物的经管饲施用的模块满足了所述需求。用于管饲的模块通常具有超过包含益生菌的酸奶饮料的保质期的保质期，由于可以在延长的保质期内确保益生菌的存活力的不确定性，目前未在这类管饲模块中加入益生菌。本发明人现在能够显示，甚至非复制型益生菌也可以提供益生菌的健康益处，且甚至可以具有改善的益处。因此，本发明的一个实施方案是包含益生微生物的经管饲施用的模块。益生菌可在水、油或乳状液(例如奶)中提供。所述模块可另外包含保护性凝胶(hydrocolloid)(例如树胶、蛋白质、改性淀粉)、粘结剂、成膜剂、封装剂/材料、外壁/外壳材料、基质化合物、涂料、乳化剂、表面活性齐U、增溶剂(油、脂肪、蜡、卵磷脂等)、吸附剂、载体、填充剂、co-compound、分散剂、湿润剂、加工助剂(溶剂)、矫味剂、增重剂、凝胶形成剂和/或抗氧化剂。其也可包含常规的药物添加剂和佐剂、赋形剂和稀释剂，包括但不限于水、任意来源的明胶、植物胶、磺化木质素、滑石、糖、淀粉、阿拉伯树胶、植物油、聚亚烷基二醇、调味剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲液、润滑剂、着色剂、湿润剂和/或填充剂。 在一个实施方案中，益生微生物可为仅有的功能成分。在管饲模块中仅具有一种功能成分具有以下优势，即通过组合一种或多种管饲模块，更易于提供用于特定患者需要的最佳营养。可选地，益生微生物可与选自谷氨酰胺、MCT、主要包含不饱和脂肪酸的油、纤维、蛋白质的仅一种单独的功能成分组合。再一次地，存在仅少数功能成分使得更容易组合特定的管饲模块，从而达到优化的个性化营养制剂。例如，精氨酸模块可适于从烧伤、手术或慢性伤口恢复中的患者。补充益生微生物将改善治疗效果。谷氨酰胺模块可在与胃肠道(GI)损伤或疾病相关的情况下有帮助。补充益生微生物将改善治疗效果。MCT (中链甘油三酸酯)模块可适于不能消化或吸收常见脂肪的患者。补充益生微生物将改善治疗效果。不饱和脂肪酸模块可对需要不饱和脂肪酸的患者有帮助。补充益生微生物将改善治疗效果。纤维模块可用于便秘的膳食管理。补充益生微生物将改善治疗效果。蛋白质模块可用于增强基本膳食，帮助促进皮肤健康、伤口愈合、免疫应答和肌肉力量。补充益生微生物将改善治疗效果。在另一个实施方案中，本发明的模块仅包含3种大量营养素中的2种。大量营养素是碳水化合物、蛋白质和脂肪。去除一种大量营养素将再次允许满足特定的营养需要，例如通过与其他管饲模块组合。模块可以包含部分或仅包含非复制型益生微生物。发明人惊奇地看到，例如就免疫强化作用而言和/或就抗炎作用而言，非复制型益生微生物可以甚至比复制型益生微生物更有效。这是令人惊奇的，因为通常将益生菌定义为“在以足够的量施用时赋予宿主健康益处的活微生物”(FA0/WH0指南)。绝大多数公开的文献涉及活益生菌。此外，几项研究调查通过非复制型细菌传递的健康益处，它们中的大多数显示，例如通过热处理失活益生菌导致它们声称的健康益处的丧失(Rachmilewitz, D.等,2004, Gastroenterology126 :520-528 ；Castagliuolo 等，2005, FEMS Immunol. Med. Microbiol. 43 :197-204 ；Gill,H. S.和 K. J. Rutherfurd,2001, Br. J. Nutr· 86 :285-289 ；Kaila, M.等，1995，Arch. Dis.Child 72:51-53.)。一些研究显示,灭活益生菌可以保留一些健康作用(Rachmilewitz,D.等，2004，Gastroenterology 126 :520-528 ；Gill, H. S.和 K. J. Rutherfurd，2001，Br. J. Nutr. 86 :285-289)，但显然，到目前为止，本领域中认为活益生菌更有效。本发明的模块可以以任意有效量，例如以对应于约IO6至1012cfu/g干重的量包含益生微生物。益生微生物可以是非复制型益生微生物。“非复制型”益生微生物包含经热处理的益生菌。这包含失活、死亡、不能生活和/或作为诸如DNA、代谢物、胞质化合物和/或细胞壁物质的片段存在的微生物。“非复制型”意指通过经典平板接种法不能检测到活细胞和/或菌落形成单位。 这类经典平板接种法总结在微生物学书籍James Monroe Jay, Martin J. Loessner, DavidA. Golden. 2005. Modern food microbiology.第 7 版，Springer Science, New York,N.Y.790p中。通常，活细胞的缺乏可以显示如下用不同浓度的细菌制剂(“非复制型”样品)接种并在适当条件下孵育(有氧和/或缺氧环境下至少24小时)后琼脂平板上无可见菌落或液体生长培养基中无增加的浊度。为了本发明的目的，将益生菌定义为“对宿主的健康或康乐具有有益作用的微生物细胞制剂或微生物细胞的成分”。(Salminen S, Ouwehand A. Benno Y.等“Probiotics :how should they be defined” Trends Food Sci. Technol. 1999 :10107-10)。使用非复制型益生微生物的可能性提供了几个优势。在严重无免疫应答的患者中，由于发生菌血症的潜在风险，可以将活益生菌的使用限制在例外病例中。可以无任何问题地使用非复制型益生菌。此外，非复制型益生微生物的提供允许热重构，同时保持健康益处。本发明的组合物以足以至少部分产生健康益处的量包含益生微生物和/或非复制型益生微生物。将足以达到此目的的量定义为“治疗有效剂量”。对此目的有效的量将取决于本领域技术人员已知的许多因素，如患者的体重和一般健康状态，且取决于食物基质的作用。在预防性应用中，以足以至少部分降低发生障碍的风险的量对易感该障碍或处于该障碍的风险的消费者施用本发明的组合物。将这种量定义为“预防有效剂量”。同样，精确的量取决于许多因素，如患者的健康状态和体重，且取决于食物基质的作用。本领域技术人员将能够适当地调节治疗有效剂量和/或预防有效剂量。一般而言，本发明的组合物以治疗有效剂量和/或以预防有效剂量包含益生微生物和/或非复制型益生微生物。通常，治疗有效剂量和/或预防有效剂量在每个日剂量约0，005mg-1000mg益生微生物和/或非复制型益生微生物的范围内。就数值量而言，“短时间高温”处理的非复制型微生物可以以对应于IO4至IO12等同cfu/g干组合物的量存在于组合物中。显然，非复制型微生物不形成菌落，因此，此术语应理解为从IO4至IO12CfVg复制型细菌获得的非复制型微生物的量。这包含失活、不能存活或死亡或作为诸如DNA或细胞壁或胞质化合物的片段存在的微生物。换言之，按照该量的微生物的菌落形成能力(CfU)来表示组合物所包含的微生物的量，就如同所有微生物都是活的一样，而不考虑它们实际上是否是非复制型，如失活或死亡、片段化或任意或所有这些状态的混合。优选地，非复制型微生物以等同于IO4至109cfu/g干组合物的量、甚至更优选以等同于IO5至IO9CfVg干组合物的量存在。 可以通过本领域已知的任意方法使益生菌成为非复制型。使益生菌株成为非复制型的目前可获得的技术通常是热处理、Y -照射、紫外光或使用化学试剂(福尔马林、多聚甲醛)。可以优选使用在食品工业中的工业环境下相对易于应用的技术来使益生菌成为非复制型。目前市场上的大多数包含益生菌的产品是在其产生过程中经热处理的产品。因此 便于能够与所产生的产品一起或至少以相似的方式热处理益生菌，同时益生菌保持或改善了它们的有益特性或甚至获得新的对消费者有益的特性。但是，通过热处理失活益生微生物在文献中一般与益生活性的至少部分丧失相关。本发明人现已惊奇地发现，例如通过热处理使益生微生物成为非复制型未导致益生健康益处的丧失，相反，可以增强现有健康益处和甚至产生新的健康益处。因此，本发明的一个实施方案是模块，其中通过热处理使非复制型益生微生物成为非复制型。这种热处理可以在至少71. 5°C下进行至少I秒。可以使用长期热处理或短期热处理。在目前的工业规模中，通常优选短期热处理，如UHT样热处理。这类热处理减少了细菌接种量，并减少了处理时间，从而减少了营养物的破坏。发明人首次表明，无论它们的起始特性如何，在高温下短时间热处理的益生微生物都显示抗炎免疫特性。具体而言，通过此热处理，产生了新的抗炎特性，或增强了现有抗炎特性。因此，即使活对应物不是抗炎菌株，现在也可能通过使用对应于典型的可在工业上应用的热处理的具体热处理参数来产生具有抗炎免疫特性的非复制型益生微生物。因此，例如，热处理可以是在约71. 5_150°C下高温处理约1_120秒。高温处理可以是高温/短时间(HTST)处理或超高温(UHT)处理。可以在约71. 5_150°C下对益生微生物进行约1_120秒的短期高温处理。更优选可以在约90_140°C，例如90_120°C下对微生物进行约1_30秒的短期高温处理。此高温处理使微生物成为至少部分非复制型。高温处理可以在正常大气压下进行，但也可以在高压下进行。典型的压力范围为I至50bar,优选I至IObar,甚至更优选2至5bar。显然,应用热时,优选在液体或固体的介质中热处理益生菌。因此，所应用的理想压力将取决于其中提供了微生物的组合物的性质，且取决于所用温度。高温处理可以在约71. 5_150°C、优选约90_120°C、甚至更优选约120_140°C的温度范围内进行。高温处理可以短期进行约1-120秒、优选约1-30秒、甚至更优选约5_15秒。此给定的时间范围指益生微生物经受给定的温度的时间。注意，取决于其中提供了微生物的组合 物的性质和量及取决于所使用的加热器的结构，热应用的时间可以不同。通常，但是，通过高温短时间(HTST)处理、巴氏瞬间灭菌法或超高温(UHT)处理来处理本发明的组合物和/或微生物。UHT处理是涉及通过在超过135°C (275 °F )(杀死牛奶中的细菌孢子所需的温度)的温度下短时间(约1-10秒)加热组合物来对它进行至少部分灭菌的超高温处理或超热处理(都缩写为UHT)。例如，用超过135°c的温度以此方式处理牛奶允许细菌接种量在使得能够进行连续流操作的必要保持时间(至2-5秒)内减少。存在两种主要的UHT系统类型直接系统和间接系统。在直接系统中，通过蒸汽注射或蒸汽注入来处理产品，而在间接系统中，用板式换热器、管式换热器或刮面式换热器热处理产品。可以在产物制备方法的任意一个或多个步骤应用UHT系统的组合。HTST处理定义如下(高温/短时间):设计来达到牛奶中存活微生物数目的5个对数降低，杀死99，9999%的巴斯德消毒法。认为这足以破坏几乎所有酵母、霉菌和常见的腐败细菌，以及确保充分破坏常见的致病耐热生物。在HTST法中，将牛奶加热至71. 7V (161 0F ) 15-20 秒。巴氏瞬间灭菌法是易腐饮料，如果汁和蔬菜汁、啤酒及乳制品的热巴斯德消毒法。它在灌装入容器中之前进行，以杀死腐败微生物、使产品更安全和延长它们的保质期。液体在受控连续流中移动，同时经受71. 50C (160 0F )至74°C (165 0F )的温度约15至30秒。为了本发明的目的，术语“短时间高温处理”将包括例如高温短时间(HTST)处理、UHT处理和巴氏瞬间灭菌法。由于这种热处理提供具有改善的抗炎特性的非复制型益生菌，本发明的模块可以用于预防或治疗炎性障碍。不具体限制可以通过本发明的组合物治疗或预防的炎性障碍。例如，它们可以选自急性炎症，如败血症；烧伤；和慢性炎症，如炎性肠病，例如局限性肠炎、溃疡性结肠炎、隐窝炎；坏死性小肠结肠炎；皮肤炎症，如UV或化学药品诱导的皮肤炎症、湿疹、反应性皮肤；肠易激综合症；眼睛炎症；变态反应、哮喘；及其组合。如果用长期热处理来使益生微生物成为非复制型，则这种热处理可以在约70-150°C的温度范围内进行约3分钟至2小时，优选在80-140°C的范围内进行5分钟至40分钟。虽然现有技术一般教导，就发挥它们的益生特性而言，通过长期热处理使之成为非复制型的细菌通常不如活细胞有效，但本发明人能够表明，与它们的活对应物相比，热处理的益生菌在刺激免疫系统中更优。本发明还涉及包含益生微生物的模块，通过在至少约70°C下热处理至少约3分钟来使该益生微生物成为非复制型。通过体外免疫特性分析(immunoprof i I ing)确认了非复制型益生菌的免疫强化作用。所使用的体外模型使用来自人外周血单核细胞(PBMC)的细胞因子谱分析(profiling)，且作为用于测试免疫调节化合物的标准模型在本领域被广为接受(Schultz 等，2003， Journal of Dairy Research 70，165-173;Taylor 等，2006， Clinicaland Experimental Allergy, 36,1227-1235 ；Kekkonen 等，2008, World Journal ofGastroenterology,14,1192-1203))。几个作者/研究小组已用体外PBMC测定来例如根据益生菌的免疫特性，即它们的抗炎或促炎特征来分类它们(Kekkonen 等，2008, World Journal of Gastroenterology,14,1192-1203)。例如，已显示此测定允许预测益生候选者在肠结肠炎的小鼠模型中的抗炎作用(Foligne, B.等，2007, World J. Gastroenterol. 13 :236-243)。此外，此测定常用作临床试验中的读出，并显示导致与临床结果相关的结果(Schultz等,2003, Journal ofDairy Research 70,165-173 ;Taylor等，2006,Clinical and Experimental Allergy,36,1227-1235)。变应性疾病在过去几十年中已稳步增加，且目前WHO将它们视为流行病。一般而言，认为变态反应由免疫系统的Thl和Th2应答之间的不平衡引起，该不平衡导致趋向于产生Th2介质(mdiator)的强趋势。因此，可以通过恢复免疫系统的Thl和Th2双臂间的 恰当平衡来缓解、下调或预防变态反应。这意味着必需降低Th2应答，或至少瞬时增强Thl应答。后者可以是通常伴随例如更高水平的IFNy、TNF-α和IL-12的免疫强化应答的特征。(Kekkonen 等，2008, World Journal of Gastroenterology, 14,1192-1203 ；ViljanenM.等，2005，Allergy，60，494-500)。因此，本发明的模块允许治疗或预防与免疫防御损伤相关的障碍。因此，不具体限制可以通过本发明的组合物治疗或预防的与免疫防御损伤相关的障碍。例如，它们可以选自感染，尤其是细菌、病毒、真菌和/或寄生虫感染；吞噬细胞缺乏；低至严重的免疫抑制水平，如由应激或免疫抑制药物、化学疗法或放射治疗诱导的那些；较低免疫活性的免疫系统的天然状态，如新生儿的那些；变态反应；及其组合。本发明中所述的模块还允许增强患者对疫苗，尤其是对口服疫苗的应答。任意量的非复制型微生物都将是有效的。但是，一般优选至少90%、优选至少95%、更优选至少98%、最优选至少99%、理想地至少99. 9%、最理想地所有的益生菌是非复制型。在本发明的一个实施方案中，所有微生物都是非复制型。因此,在本发明的模块中，至少90%、优选至少95%、更优选至少98%、最优选至少99%、理想地至少99. 9%、最理想地所有的益生菌可以是非复制型。为了本发明的目的，可以使用所有益生微生物。例如，益生微生物可以选自双歧杆菌(bifidobacteria)、乳杆菌(Iactobacilli)、丙酸杆菌(propionibacteria)或其组合，例如长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酿乳杆菌(Lactobacillus casei)、类干酿乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、乳乳球菌(Lactococcus lactis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、乳乳球菌、二乙酸乳乳球菌(Lactococcus diacetylactis)、乳脂乳球菌(Lactococcus cremoris)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、大肠杆菌(Escherichia coli)和 / 或其混合物。本发明的模块可以例如包含选自长双歧杆菌NCC 3001、长双歧杆菌NCC 2705、短双歧杆菌NCC 2950、乳双歧杆菌NCC 2818、约氏乳杆菌LaU类干酪乳杆菌NCC 2461、鼠李糖乳杆菌NCC 4007、路氏乳杆菌DSM17983、路氏乳杆菌ATCC55730、嗜热链球菌NCC 2019、嗜热链球菌NCC 2059、干酪乳杆菌NCC 4006、嗜酸乳杆菌NCC 3009、干酪乳杆菌ACA-DC6002 (NCC 1825)、尼氏大肠杆菌(Escherichia coli Nissle)、保加利亚乳杆菌 NCC 15、乳乳球菌NCC 2287或其组合的益生微生物。所有这些菌株或是在布达佩斯条约(Budapest treaty)下保藏和/或是可商购获得的。 已在布达佩斯条约下保藏的菌株如下长双歧杆菌NCC 3001 ATCC BAA-999长双歧杆菌NCC 2705 :CNCM 1-2618短双歧杆菌NCC 2950 :CNCM 1-3865乳双歧杆菌NCC 2818 :CNCM 1-3446类干酪乳杆菌NCC 2461 CNCM 1-2116鼠李糖乳杆菌NCC 4007 :CGMCC I. 3724嗜热链球菌NCC 2019 :CNCM 1-1422嗜热链球菌NCC 2059 :CNCM 1-4153乳乳球菌NCC 2287 :CNCM 1-4154干酪乳杆菌NCC 4006 :CNCM 1-1518干酪乳杆菌NCC 1825 =ACA-DC 6002嗜酸乳杆菌NCC 3009 =ATCC 700396保加利亚乳杆菌NCC 15 CNCM 1-1198约氏乳杆菌Lal :CNCM 1-1225路氏乳杆菌DSM17983 :DSM17983路氏乳杆菌ATCC55730 ATCC55730尼氏大肠杆菌1917 =DSM 6601本领域技术人员将理解，它们可以自由地组合本文中所述的本发明的所有特征，而不偏离所公开的发明的范围。本发明的其他优势和特征从以下实施例和附图显而易见。图IA和B显示用“短时间高温”处理的益生菌的抗炎免疫特性的增强。图2显示变为抗炎型的非抗炎益生菌株，即用“短时间高温”处理后显示显著的体外抗炎免疫特性的非抗炎益生菌株。图3A和B显示用于市售产品中的益生菌株，其在用“短时间高温”处理后显示增强的或新的体外抗炎免疫特性。图4A和B显示乳制品起子菌株(即Lcl起子菌株)，其在高温下热处理时显示增强的或新的体外抗炎免疫特性。图5显示非抗炎益生菌株，其在用HTST处理处理后显示体外抗炎免疫特性。图6 :以它们的活体形式和热处理(140°C，15秒)形式用益生菌株和乳制品起子菌株产生的PBMC数据(IL-12p40、IFN- y , TNF-a、IL-10)上的主成分分析。每个点代表通过其NCC编号或名称来辨别的一个活的或热处理的菌株。图7显示活的和热处理(85°C、20分钟)的菌株的IL-12p40/IL_10比率。总体上，与本发明的“短时间高温”处理相反，在85°C下热处理20分钟导致IL-12p40/IL-10比率的增加(图1、2、3、4和5)。图8显示来自用热处理的细菌刺激的人PBMC的体外细胞因子分泌的增强。 图9显示在用盐水攻击的OVA致敏小鼠(阴性对照)、用OVA攻击的OVA致敏小鼠(阳性对照)及用OVA攻击并用热处理的或活的短双歧杆菌NCC2950处理的OVA致敏小鼠中观察到的腹泻强度的百分比。结果显示为腹泻强度的百分比(从4个独立实验计算的平均值土SEM)，100%的腹泻强度对应于阳性对照(用变应原致敏和攻击)组中发生的症状。实施例I :方法学细菌制剂一般认为通过活益生菌对宿主免疫系统传递的健康益处是菌株特异性的。已显示在体外诱导高水平IL-10和/或诱导低水平促炎细胞因子(PBMC测定)的益生菌是有效的体内抗炎菌株(Foligne, B.等，2007, World J. Gastroenterol. 13 :236-243)。用几种益生菌株来研究热处理的益生菌的抗炎特性。这些菌株是长双歧杆菌NCC3001、长双歧杆菌NCC 2705，短双歧杆菌NCC 2950，乳双歧杆菌NCC 2818、类干酪乳杆菌NCC 2461、鼠李糖乳杆菌NCC 4007、干酪乳杆菌NCC 4006、嗜酸乳杆菌NCC 3009、干酪乳杆菌ACA-DC 6002 (NCC 1825)和尼氏大肠杆菌。还测试了包括商业上用来产生Nestl6Lcl发酵产物的一些菌株的几个起子培养物菌株嗜热链球菌NCC 2019、嗜热链球菌NCC 2059、保加利亚乳杆菌NCC 15和乳乳球菌NCC 2287。在针对各菌株优化的条件下在5-15L生物反应器中培养细菌细胞。可以使用所有典型的细菌生长培养基。这类培养基为本领域技术人员已知。调节PH至5. 5时，连续加入30%碱溶液(NaOH或Ca(OH)2)。适当时，通过用CO2处理顶空来维持无氧条件。在标准有氧条件下培养大肠杆菌。通过离心(5，000Xg、4°C )收集细菌细胞，并以适当的体积重悬在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，以达到约109-101(lCfu/ml的终浓度。用15%的甘油将部分制剂冷冻在_80°C。通过以下来热处理另一部分细胞-超高温140°C，15秒；通过直接的蒸汽注射；-高温短时间(HTST):74°C、90°C和120°C，15秒，通过直接的蒸汽注射；-水浴中长时间低温(85°C，20分钟)。热处理后，使样品在_80°C下保持冷冻直至使用。细菌制剂的体外免疫特性分析评估了活的和热处理的细菌制剂的免疫特性(即从体外人血细胞诱导特异性细胞因子分泌的能力)。从血液滤器分离了人外周血单核细胞(PBMC)。通过细胞密度梯度分开后，收集单核细胞，并用Hank’s平衡盐溶液洗涤两次。然后将细胞重悬在补充了 10%胎牛血清(Bioconcept,巴黎,法国)、1% L-谷氨酰胺(Sigma)、I %青霉素/链霉素(Sigma)和 O. I %庆大霉素(Sigma)的 Iscove，s Modified Dulbecco，s Medium (IMDM, Sigma)中。用活细菌和热处理细菌(等于7X IO6Cfu/孔)在48孔板中孵育PBMC(7X IO6细胞/孔)36小时。在来自划分为两个分开的实验的8个个体供体的PBMC上测试了活的和热处理的细菌的作用。孵育36小时后，将培养板冻存在-20°C，直至细胞因子测量。平行(即在同一实验中在同一批次的PBMC上)进行活细菌和它们的热处理对应物的细胞因子谱分析。按照厂家的说明，通过ELISA (R&D DuoSet Human IL-10、BDOptEIA HumanIL12p40、BD OptEIA Human TNFa、BD OptEIA HumanIFN- y )测定孵育 36 小时后的细胞培养物上清中的细胞因子(IFN-Y、IL-12p40、TNF-α和IL-10)水平。IFN-Y、IL-12p40和TNF- a是促炎细胞因子，而IL-IO是有效的抗炎介质。结果表示为4个个体供体的平均值(pg/ml) 土SEM，且代表各用4个供体进行的两个单独的实验。针对各菌株计算了 IL-12p40/IL-10比率作为体内抗炎作用的预测值(Foligne, B.等，2007，World J. Gastroenterol. 13 :236-243)。将通过ELISA(见上文)测定的各菌株的数值型细胞因子值(pg/ml)转入BioNumerics v5. 10 软件(Applied Maths, Sint-Martens-Latem,比利时)。对此数据集进行了主成分分析(PCA,定尺度技术(dimensioning technique))。此分析中包括减去性状的平均值和除以性状的方差。结果通过超高温(UHT)/高温短时间(HTST)样处理产生的抗炎特性对所研究的益生菌株进行了一系列热处理(超高温(UHT)、高温短时间(HTST)和850C 20分钟)，并在体外将它们的免疫特性与活细胞的免疫特性相比较。在用人PBMC孵育时，活微生物(益生菌和/或乳制品起子培养物)诱导了不同水平的细胞因子产生(图I、2、3、4和5)。这些微生物的热处理以温度依赖方式改变了由PBMC产生的细胞因子的水平。“短时间高温”处理(120°C或140°C，15秒)产生了具有抗炎免疫特性的非复制型细菌(图1、2、3和4)。事实上，UHT样处理的菌株(140°C，15秒)诱导较少的促炎细胞因子(TNF-α、IFN- Y、IL-12p40)，同时保持或诱导其他IL-IO产生(与活对应物相比)。与活细胞相比，对于任意UHT样处理的菌株，产生的IL-12p40/IL-10比率更低(图1、2、3和4)。此观测结果对通过HTST样处理的处理细菌，即经受120°C 15秒(图1、2、3和4)或74°C和90°C 15秒(图5)的细菌也正确。热处理(UHT样或HTST样处理)对益生菌株(图1、2、3和5)和乳制品起子培养物(图4)的体外免疫特性具有相似的作用。用活的和热处理(140°C，15秒)的益生菌株和乳制品起子菌株产生的PBMC数据上的主成分分析揭示，活菌株全沿X轴散布，说明菌株显示非常不同的体外免疫特性，从促炎细胞因子的低诱导者(左侧)至高诱导者(右侧)。热处理的菌株聚集在图的左侧，显示热处理的菌株较少地诱导促炎细胞因子(图6)。相反，在85°C下热处理20分钟的细菌比活细胞诱导更多的促炎细胞因子和更少的IL-10，导致更高的IL-12p40/IL-10比率(图7)。通过UHT样和HTST样处理增强或产生了抗炎特性无论它们各自的起始免疫特性(活细胞)如何，UHT和HTST处理的菌株都显示抗炎特性。显示了已知在体内为抗炎型且显示体外抗炎特性的益生菌株(长双歧杆菌NCC 3001、长双歧杆菌NCC 2705、短双歧杆菌NCC 2950、乳双歧杆菌NCC 2818)在“短时间高温”处理后显示增强的体外抗炎特性。如图I中所示，UHT样处理的双歧杆菌属(Bifidobacterium)菌株的IL-12p40/IL_10比率低于来自活对应物的那些，从而显示UHT样处理的样品的改善的抗炎特性。更令人惊奇地，还针对非抗炎型活菌株确认了通过UHT样和HTST样处理产生抗炎特性。活的鼠李糖乳杆菌NCC4007和类干酪乳杆菌NCC 2461都在体外显示高的IL-12p40/IL-10比率(图2和5)。显示了这两种活菌株对小鼠中TNBS诱导的结肠炎无保护作用。鼠李糖乳 杆菌NCC 4007和类干酪乳杆菌NCC 2461诱导的IL_12p40/IL-10比率在“短时间高温”处理(UHT或HTST)后显著降低，达到与用双歧杆菌属菌株获得的那些一样低的水平。这些低IL-12p40/IL-10比率由低水平的IL_12p40产生与无变化(鼠李糖乳杆菌NCC 4007)或显著诱导(类干酪乳杆菌NCC 2461)的IL-10分泌的组合引起(图2)。因此-可以通过UHT样和HTST样热处理来增强活微生物的抗炎特性(例如长双歧杆菌NCC 2705、长双歧杆菌NCC 3001、短双歧杆菌NCC 2950、乳双歧杆菌NCC 2818)；-可以通过UHT样和HTST样热处理来从非抗炎型活微生物(例如鼠李糖乳杆菌NCC 4007、类干酪乳杆菌NCC 2461、乳制品起子嗜热链球菌NCC 2019)产生抗炎特性；-还针对包括益生大肠杆菌菌株的分离自市售产品的菌株(图3A和B)显示了抗炎特性。对于所有测试的益生菌和乳制品起子，例如乳杆菌、双歧杆菌和链球菌，UHT/HTST样处理的影响相似。将UHT/HTST样处理应用于显示不同的体外免疫特性的几种乳杆菌、双歧杆菌和链球菌。所有菌株在UHT/HTST样处理后都比它们的活对应物诱导更少的促炎细胞因子(图I、2、3、4、5和6)，表明UHT/HTST样处理对产生的非复制型细菌的免疫特性的作用可以泛化至所有益生菌，尤其是乳杆菌、双歧杆菌和特定大肠杆菌菌株，及所有乳制品起子培养物，尤其是链球菌、乳球菌和乳杆菌。实施例2:方法学细菌制剂用5个益生菌株来研究非复制型益生菌的免疫强化特性3种双歧杆菌(长双歧杆菌NCC3001、乳双歧杆菌NCC2818、短双歧杆菌NCC2950)和2种乳杆菌(类干酪乳杆菌NCC2461、鼠李糖乳杆菌NCC4007)。在37°C的分批发酵中在MRS上培养细菌细胞16-18小时，无pH控制。离心(5，000Xg，4°C )沉淀细菌细胞，并重悬在磷酸缓冲盐溶液中，然后稀释在盐水中，以达到约10E10cfu/ml的终浓度。在水浴中85°C热处理长双歧杆菌NCC3001、乳双歧杆菌NCC2818、类干酪乳杆菌NCC2461、鼠李糖乳杆菌NCC4007 20分钟。在水浴中90°C热处理短双歧杆菌NCC295030分钟。分装热处理的细菌悬液，并冻存在_80°C，直至使用。将活细菌在PBS-15%甘油中保存在_80°C，直至使用。细菌制剂的体外免疫特性分析评估了活的和热处理的细菌制剂的免疫特性(即从体外人血细胞诱导特异性细胞因子的分泌的能力)。从血液滤器分离了人外周血单核细胞(PBMC)。通过细胞密度梯度分开后，收集单核细胞，并用Hank’s平衡盐溶液洗涤两次。然后将细胞重悬在补充了 10%胎牛血清(Bioconcept,巴黎,法国)、1% L-谷氨酰胺(Sigma)、I %青霉素/链霉素(Sigma)和 O. I %庆大霉素(Sigma)的 Iscove，s Modified Dulbecco，s Medium (IMDM, Sigma)中。然后用活的和热处理的细菌(等于7X IO6Cfu/孔)在48孔板中孵育PBMC (7 X IO6细胞/孔)36小时。在来自划分为两个分开的实验的8个个体供体的PBMC上测试了活的和热处理的细菌的作用。孵育36小时后，将培养板冻存在-20°C，直至细胞因子测量。平行(即在同一实验中在同一批次的PBMC上)进行活细菌和它们的热处理对应物的细胞因子谱分析。按照厂家的说明，通过ELISA (R&D DuoSet Human IL-10、BDOptEIA HumanIL12p40、BD OptEIA Human TNF、BD OptEIA HumanIFN-γ )测定孵育 36 小时后的细胞培养物上清中的细胞因子(IFN- Y , IL-12p40、TNF-a和IL-10)水平。IFNi、IL_12p40和TNF-a是促炎细胞因子，而IL-IO是有效的抗炎介质。结果表示为4个个体供体的平均值(pg/ml) 土SEM，且代表各用4个供体进行的两个单独的实验。 活的和热处理的短双歧杆菌NCC2950在预防变应性腹泻中的体内作用用变应性腹泻的小鼠模型来测试短双歧杆菌NCC2950的Thl促进作用(BrandtE.B等JCI 2003 ；112(11) =1666-1667) 0致敏(按14天的间隔2次腹膜内注射卵清蛋白(OVA)和硫酸铝钾；第O天和第14天)后，用OVA经口攻击雄性Balb/c小鼠6次(第27、29、32、34、36、39天)，导致短暂的临床症状(腹泻)和免疫参数(总IgE,OVA特异性IgE,小鼠肥大细胞蛋白酶1(即MMCP-1)的血浆浓度)的变化。OVA致敏前4天(第_3、-2、_1、O天及第11、12、13和14天)和攻击期期间(第23至39天)，通过管饲法施用活的或90°C下热处理30分钟的短双歧杆菌NCC2950。使用了约IO9菌落形成单位(cfu)或等同cfu/小鼠的日细菌剂量。结果热处理后“促炎”细胞因子的分泌的诱导在体外评估了热处理的细菌菌株刺激人外周血单核细胞(PBMC)分泌细胞因子的能力。将通过热处理的细菌刺激PBMC后基于四种细胞因子的免疫特性与在同一体外测定中通过活细菌细胞诱导的免疫特性相比较。平板接种热处理的制剂，并针对任意活菌计数的缺乏评估。热处理的细菌制剂未在平板接种后产生菌落。在用人PBMC孵育时，活益生菌诱导了不同且依赖于菌株的细胞因子产生水平(图8)。与它们的活对应物相比，热处理益生菌改变了由PBMC产生的细胞因子的水平。热处理的细菌比它们的活对应物诱导更多的促炎细胞因子(TNF-α、IFNi、IL-12p40)。相反，与活细胞相比，热处理的细菌诱导相似量或更低量的IL-10(图8)。这些数据显示，热处理的细菌比它们的活对应物更能够刺激免疫系统，因此更能够强化变弱的免疫防御。换言之，体外数据表明热处理后的细菌菌株的增强的免疫强化作用。为了说明热处理的短双歧杆菌NCC2950(与活细胞相比)对免疫系统的增强的作用，在变应性腹泻的动物模型中测试了活的和热处理的短双歧杆菌NCC2950(菌株A) 二者。与阳性对照组相比，用热处理的短双歧杆菌NCC2950处理后腹泻强度显著且一致地减少(41. 1% ±4. 8)，而用活的短双歧杆菌NCC2950处理后腹泻强度仅降低20±28. 3%。这些结果表明，与它的活对应物相比，热处理的短双歧杆菌NCC2950显示增强的对变应性腹泻的保护作用(图9)。因此，显示了益生菌增强免疫防御的能力在热处理后得到改善。实施例3-9:可制备以下通过管饲施用的模块。Arg-模块kcal/mL :0. 15,当与 237mL 水混合时热量分布(kcal的百分比) 蛋白质53%碳水化合物47%脂肪0%蛋白质来源L-精氨酸摩尔渗透压浓度(mOsm/kg水)170，当与237mL水混合时补充的L-精氨酸4. 5g/份益生菌IO9Cfu约氏乳杆菌Lal谷氨酰胺模块kcal/mL 0. 65,当与 1 20mT,水混合时热量分布(kcal的百分比)谷氨酰胺68%碳水化合物32%脂肪0%摩尔渗透压浓度(mOsm/kg水):310，当与120mL水混合时益生菌IO9Cfu热处理的(75°C，20分钟)长双歧杆菌NCC 3001MCT 模块kcal/mL :7· 7 (或 8. 3kcal/g)热量分布(kcal的百分比)蛋白质0%碳水化合物0%脂肪100%油来源椰子油益生菌IO9Cfu UHT处理的约氏乳杆菌Lal不饱和脂肪模块kcal/mL :4. 5热量分布(kcal的百分比)蛋白质0%碳水化合物0%脂肪100%油来源红花油
摩尔渗透压浓度(mOsm/kg水)62游离水45%益生菌IO9Cfu约氏乳杆菌Lal纤维模块粉末，提供3g来自部分水解的瓜尔胶(PHGG)的可溶性纤维热量分布(kcal的百分比)蛋白质0%碳水化合物100%脂肪0%益生菌IO9Cfu热处理的(75°C，20分钟)长双歧杆菌NCC 3001蛋白质模块热量分布(kcal的百分比)蛋白质100%碳水化合物0%脂肪0%
蛋白质来源乳清分离蛋白(奶)益生菌益生菌模块A :IO9Cfu UHT处理的约氏乳杆菌Lal，在水中益生菌模块B IO9Cfu约氏乳杆菌Lal，在奶中益生菌模块C IO9Cfu热处理的(75°C，20分钟)长双歧杆菌NCC 3001，在水中打印输出(电子表格原件)(该页不作为国际申请的一部分并且不作国际申请页计)


本发明涉及通过管饲施用的肠内营养领域。具体而言，本发明提供包含益生微生物的管饲模块。这类益生微生物可以是例如非复制型微生物，如生物活性的热处理的益生微生物。