专利名称：北京鸭stmn1基因单核苷酸多态性及其分子标记的检测方法单核苷酸多态性(SNP)就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性。因此，通常所说的SNP包括碱基的替换、插入、缺失以及重复序列拷贝数的变化。一个SNP表示在基因组某个位点上有一个核苷酸的变化，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起；具有转换型变异的SNP约占2/3，其他几种SNP在相似的水平上。CpG二核苷酸的胞嘧啶是基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱 去氨基而形成胸腺嘧啶。在任何已知或未知的基因内或附近都可能找到数量不等的SNP，根据它们在基因组中分布的位置可分为基因编码区SNP(cSNP)、基因周边SNP(pSNP)和基因间SNP(iSNP)等三类。总的说来，cSNP比较少，因为在外显子内的变异率仅占周围序列的1/5，但它在遗传病和育种的研究中却具重要意义，因此倍受关注。根据对遗传性状的影响，cSNP又可分为两种一种是同义cSNP，即SNP所致编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质中氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的“含义”相同；另一种是非同义cSNP，即碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改变，从而产生蛋白质序列的改变，可能最终影响到蛋白质的功能。因此，对编码区SNP的非同义突变来说，它们可能对基因功能有直接的重要影响。不仅如此，在群体遗传研究中,这些SNP作为遗传标记在群体遗传和生物进化的研究中也具有重要意义。由于SNP是二等位基因分子标记，所以，理论上在一个二倍体生物群体中，SNP可能是由2个、3个或4个等位基因构成，但实际上3个或4个等位基因的SNP很罕见，故SNP通常被简单地称为二等位基因分子标记。目前，主要采用几种不同的路线来发现SNP :SPDNA序列测定方法、PCR-SSCP与DNA测序结合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。在这些SNP检测技术中，DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法，但是，其检测费用极其昂贵，且需要有DNA测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非常熟练的技术人员和经验，所以，DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想SNP检测方法；当然，利用PCR-SSCP与DNA测序结合法检测SNP可以适当降低检测费用，但是，PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验过程中存在假阳性问题，所以，也并非理想的SNP检测手段;AS-PCR方法作为一种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；而引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术检测SNP位点，需要平板读数仪、基因芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。PCR-RFLP方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后使用限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖或聚丙烯凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。PCR-RFLP方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了其费用昂贵、操作繁琐、假阳性率高的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求。STMNl (Stathmin)基因抑制微管形成，因为其在杏仁体的外侧核(LA)以及将后天恐惧和先天恐惧的刺激信息发送到外侧核的丘脑和皮层结构中高表达。Brocke等人报导编码STMNl的基因有两个影响人类恐惧和焦虑刺激的行为反应的SNP(rsl82455，rs213641)。提高饲料转化率能减少生长所需的饲料数量，能减少生产费用，也能减少含氮废料的数量。在不影响动物成长的前提下，减少RFI能减少饲料喂养量，能减少背部脂肪，能减少费用。因此，研究家禽STMNl基因遗传变异和分子遗传特征具有重要理论和实践意义。关于动物STMNl基因遗传变异的研究国内外多见于人、鼠等动物，而未见北京鸭STMNl基因遗传变异或SNP研究的报道。由于目前北京鸭STMNl基因遗传变异领域的研究 匮乏，使该基因位点的功能研究及该基因遗传变异与经济性状关联的研究成为空白。
本发明解决的问题在于提供北京鸭STMNl基因单核苷酸多态性检测方法及其应用，寻找与北京鸭经济性状相关的SNP作为分子标记，加快北京鸭良种繁育速度。本发明的目的在于提供北京鸭STMNl基因的单核苷酸多态性，该基因单核苷酸多态性包括北京鸭STMNl基因外显子4第48位为C或T的单核苷酸多态性。本发明的还一目的在于提供北京鸭STMNl基因的单核苷酸多态性的检测方法，本发明通过以下技术方案来实现以包含STMNl基因的待测北京鸭全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增北京鸭STMNl基因；用限制性内切酶Ec0RII消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定北京鸭STMNl基因外显子4第48位的单核苷酸多态性；所述的引物对P为上游引物Pl :GCAGAGGAGAAGCTGACCCAC 21下游引物P2 CATCAACCCAGGAGCGAGTG 20。所述的PCR扩增反应程序为94°C预变性 5min ;94°C变性 30s，54. 6°C退火 30s，72°C延伸 30s，35 个循环；72°C延伸IOrnin0所述的琼脂糖凝胶电泳为浓度为2. 5%的琼脂糖凝胶电泳。所述的根据琼脂糖凝胶电泳结果，STMNl基因外显子4第48位的碱基多态性为CC 型为 3 个片段:10bp、201bp 和 536bp ;CT 型为 5 个片段:10bp、201bp、262bp、274bp 和536bp ;TT型为4个片段IObp、20Ibp、262bp和274bp。由于片段IObp太小，在琼脂糖凝胶不能观察到，片段262bp和274bp大小相差太小，在琼脂糖凝胶上不易分开，形成了 I条带，所以在琼脂糖凝胶上，CC基因型可以观察到2条带(201bp和536bp)，CT基因型可以观察到3条带(201bp、262bp+274bp和 536bp)，TT基因型可以观察到 2 条带(201bp和 262bp+274bp)。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果本发明公开了与北京鸭生长发育相关的功能基因STMNl的核苷酸多态性，该核苷酸多态性能够作为一个分子遗传标记，利用标记位点信息和数量性状的表型信息，更准确估计动物个体的育种值，提高选择效率，加快育种进展。本 发明对STMNl基因的SNP进行了基因分型和基因频率分析，结果显示STMNl基因的核苷酸多态位点能够成为分子遗传辅助育种的标记。本发明提供的检测方法为STMNl基因的SNP与经济性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国北京鸭标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的北京鸭种群。图I为北京鸭STMNl基因外显子4的747bp克隆测序PCR产物电泳图；图2为北京鸭STMNl基因外显子4的747bp PCR产物的EcoRII酶切电泳检测STMNl基因多态性的电泳结果图；泳道I :CT基因型个体(10bp、201bp、262bp、274bp和536bp);泳道2、3 :TT基因型个体(10bp、201bp、262bp和274bp);泳道4、5 :CC基因型个体(10bp、201bp和536bp) ；M Marker (2000bp);由于片段IObp太小，在琼脂糖凝胶不能观察至IJ，片段262bp和274bp大小相差太小，在琼脂糖凝胶上不易分开，形成了 I条带，所以在琼脂糖凝胶上，CC基因型可以观察到2条带(201bp和536bp)，CT基因型可以观察到3条带(201bp、262bp+274bp 和 536bp)，TT 基因型可以观察到 2 条带(201bp、262bp+274bp)。图3为北京鸭STMNl基因SNP的不同基因型测序峰图，其中图3a、图3b和图3c分别代表CC、TT和CT基因型。图4为EcoRII PCR-RFLP方法检测北京鸭STMNl基因外显子4的SNP分析。品种样品样品名称样品来源采样方式采样时间
北京鸭 500 血样中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京鸭育种场随机采样 2010.6月2、血样基因组DNA的提取、纯化(I)取20 μ L抗凝全血置于I. 5mL的离心管中，再添加500 μ L IXSTE缓冲液、15μ L20% SDS和20 μ L0. Olmg/μ L蛋白酶K，置于55°C水浴锅中，过夜消化。(2)将离心管取出，添加500 μ L饱和酚，于冰盒中轻摇20min，离心IOmin (IOOOOr/min) ο
(3)取上清，放到新的离心管中(无菌)，加入500yL饱和酚，于冰盒中轻摇20min,离心 IOmin (10000r/min)。(4)取上清，移入新的灭过菌的离心管中，加入500yL氯仿-异戊醇(24 I)，于冰盒中轻摇 20min,离心 IOmin (10000r/min)。(5)取上清，移到无菌的新的离心管中，加入500mL冰无水乙醇(_20°C )，来回颠倒沉淀物(DNA),离心IOmin (10000r/min),轻轻倒掉上清液。(6)加入ImL 70%乙醇,清洗DNA, 10000r/min离心5min,弃上清液。(7)重复步骤6。(8)置于通风橱中，干燥2 4h，使其水分挥发。(9) DNA完全干燥后，加入200 μ L灭菌后的TE溶液，在4°C冰箱中放置3天，以溶
解 DNA。(10)将提取到的DNA短期(_20°C )或长期(_70°C )保存，使用前取出稀释即可。3、DNA池的构建(I) I %琼脂糖凝胶电泳检测选部分DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，选择DNA样品条带均一、无拖尾、无降解的样品进行DNA池的构建。(2) OD 值测定用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD26tl/OD280的比值。如0D26(i/0D28(i比值小于I. 6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于I. 8，则应该考虑去除RNA纯化。DNA 浓度(μ g/mL) = 50 X OD260 值 X 稀释倍数(3)北京鸭DNA池的构建DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50mg/l·! L，然后从50个北京鸭个体浓度为50ng/ μ L DNA样品中取10 μ L混合构建成品种DNA池。4、克隆测序PCR扩增引物设计由于北京鸭STMNl基因的序列不完整，故从NCBI数据库中(http://www. ncbi.nlm. nih. gov/)获得原鸡的GenBank登录号为NM_001001858. I的STMNl基因DNA序列，然后利用Primer 5. O设计北京鸭STMNl基因外显子4的747bp片段的PCR引物对，其引物对序列如下上游引物Pl :GCAGAGGAGAAGCTGACCCAC 21下游引物P2 : CATCAACCCAGGAGCGAGTG 20。5、PCR克隆北京鸭STMNl基因以北京鸭的DNA池为模版，用设计的克隆测序引物进行PCR扩增，PCR总反应体系为25 μ L，见表2 ；PCR总反应程序，见表3。表2PCR反应体系


本发明公开了北京鸭STMN1基因的单核苷酸多态性及其检测方法，其基因单核苷酸多态性包括以包含STMN1基因的待测北京鸭全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增北京鸭STMN1基因；用限制性内切酶EcoRII消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定北京鸭STMN1基因外显子4第48位的核苷酸碱基多态性。本发明是一种在DNA水平上筛查和检测与北京鸭经济性状密切相关的分子遗传标记，为北京鸭快速选育提供了分子依据。