专利名称：油桐幼叶基因组dna提取方法基因组DNA的提取是分子生物学实验很重要的一个环节。基因组DNA的质量和产量，直接影响分子生物实验中与DNA有关的后续实验的进行。药用植物、芳香族植物及木本植物富含次生代谢产物；对这一类富含次生代谢产物的植物，传统的DNA提取方法不易提到高质量的基因组DNA。这类植物叶片内次生代谢产物的种类极其复杂，且不同物种间甚至同一物种间不同季节，不同叶龄的叶片间次生代谢产物的异质性程度都较高；因此，一种植物的基因组DNA提取方法往往不能很好地应用于另一种植物基因组DNA的提取。油桐原产于中国，具有极高的工业价值。从油桐桐果中提取的桐油是我国传统的大宗出口创汇物资。在我国，桐油主要用于油墨和涂料的生产。现今，能源危机不断加剧， 环境问题日益严重，对可持续的新型清洁能源的需求迫在眉睫。油桐被选为能源植物物种， 从油桐果实中提取的桐油可作为生产生物柴油的原料。因此用先进的分子生物学手段深入的研究油桐资源将对选育高产品种以及将桐油转化为生物柴油提供理论依据和技术支持。 目前油桐资源分子方面的研究还处于起步阶段，提取高质量高产量的油桐基因组DNA是开展一系列后续分子生物学实验的基础。油桐叶片富含多糖、单宁、蛋白及多酚类物质，这些次生代谢产物影响油桐基因组DNA的提取。而物种间次生代谢产物的异质性致使其它物种基因组DNA的提取方法并不是油桐基因组DNA的最佳提取方法。研究发现油桐叶片的叶龄影响油桐基因组DNA的提取。经检索，到目前为止，现有技术中还没有专门针对油桐幼叶基因组DNA提取方法的报道。
本发明的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足，针对油桐幼叶富含多糖、 单宁、多酚及蛋白的特点，提出了一种油桐幼叶基因组DNA提取方法(简称方法)。本发明的目的是这样实现的1、本方法包括下列步骤①将幼叶组织样品在液氮速冻下磨成细粉后，取0. 3g鲜叶或0. Ig干样转入2mL 离心管中；②加入1. 5mL洗液，充分混勻后，冰中静止15min，12000rpm离心弃上清液；③重复步骤②两次后，加入500 μ 1预热的3% CTAB提取液，充分混勻，65°C水浴 40min ；④12000rpm常温离心15min，转移上清液到新的1. 5mL离心管中，加入100 μ 1的 24 1的氯仿-异戊醇，充分混勻后，常温12000rpm离心15min，抽提1 2次，抽提后的3上清液转入新的离心管中，加入两倍体积的提前预冷到-20°C的100%酒精；放置于_20°C 冰柜30min，让DNA沉淀充分析出，将析出的DNA沉淀转移到含有ImL 70%酒精的1. 5mL离心管中，漂洗1 2次，每次30min，倒干酒精，待DNA沉淀干燥后，用100 μ 1的Ta ^充分溶解，并用1μ 1浓度为10μ g/mLRNA酶37°C消化30min，该过程得到的DNA样品，称为IstDNA ；⑤对步骤④中转移上清液后离心管底部的组织样品，继续加入500 μ 1的3% CTAB 提取液进行提取，该组织样共循环提取4次，依此又得到3批次DNA样品，分别称为2ndDNA、 3rdDNA 和 4thDNA。所述100%酒精是指纯的酒精溶液。所述70%酒精是指70mL纯酒精用无菌纯净水定容到IOOmL的酒精溶液。本发明所提取的多批次DNA样品中，高生长温度下(30-37°C )采集的未低温储存幼叶IstDNAJndDNAdrfDNA和4thDNA产量较高，浓度大致为300 800ng/μ 1之间。本发明所提取的多批次DNA样品中，长久低温储存及低生长温度下采集的幼叶 IstDNA产量低，纯度差，水浴后可弃掉离心产生的上清液，直接进行后续的3次DNA的提取； 而2η< )ΝΑ、3^ΝΑ，4^ΝΑ产量高，浓度大致为100 700ng/μ 1之间。本发明所使用的洗液的成分为50mM Tris-HCl,5mM EDTA，350mM山梨醇，2% PVP，0.5%β-巯基乙醇，PH值为8.0。所述的2%是指 2g/100mL，所述的 0. 5%是指 0. 5mL/100mL。本发明所使用的3% CTAB 提取液成分为3% CTAB, IOOmM Tris-HCl, 20mM EDTA,1.4M NaCl, 2% PVP, 0. 5% β _ 巯基乙醇，ρΗ 值为 8. 0。所述的3%是指3g/100mL，所述的2%是指2g/100mL，所述的0. 5%是指 0. 5mL/100mL。本发明所使用的TaiE 成分为=IOmM Tris-HCl,0. ImM EDTA，pH 8. O0工作原理油桐幼叶中富含的次生代谢产物，例如多糖、单宁、多酚等在DNA提取过程中与DNA共分离或抑制DNA的提取等。在用3% CTAB提取液裂解细胞前，先用洗液反复预处理液氮研磨的叶片组织样，前后共处理3次，可大量除去干扰DNA分离的次生代谢产物。预处理后的幼叶组织样加入3% CTAB提取液在65°C下裂解细胞，离心转移的上清再经过氯仿异戊醇的萃取、酒精的沉淀，得到絮状的DNA沉淀，最后利用70%乙醇洗涤DNA沉淀，得到第1次DNA沉淀，即lstDNA。而离心转移上清后位于离心管底部的组织样可继续加 3 % CTAB提取液，进行新一轮的DNA提取，依此组织样共循环提取4次，又得到3批次DNA 样本。本发明可分离到高质量(少多糖、少多酚、少色素和蛋白质等)、高产量(1份组织样得到4批次DNA沉淀)的油桐基因组DNA，满足分子生物学实验对DNA浓度和质量的要求。2、油桐基因组DNA的鉴定本方法提取的油桐基因组DNA样品，可经0.8%的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测其浓度和质量。3、本方法的用途本方法可以从油桐幼叶鲜样和干样中提取高产量高质量的基因组DNA。长久低温储存状况下(_70°C )的油桐幼叶和低的生长温度下(15°C -25°C )采集的油桐幼叶，叶内化学成分发生质的改变，致使本方法四次循环提取中第1次提取得到的基因组DNA产量非常低(琼脂糖凝胶检测不到)，纯度也差O60/280 <1.8)，而后续三次得到的基因组DNA产量较高，纯度好，故组织样只提取1次的传统方法较难从长久低温储存的油桐幼叶和低的生长温度下采集的油桐幼叶中提取到高产量和高质量的基因组DNA ；但本方法可克服这种长久低温储存和低的生长温度对幼叶DNA提取的影响，后3次提取能较好地得到高产量高质量的基因组DNA，满足分子生物学后续实验对DNA浓度和质量的要求。本发明具有下列优点和积极效果①本方法中的洗液，先后处理油桐幼叶组织样3次，能有效地去除叶片内富含的多酚、多糖、单宁等次生代谢产物；②本方法中循环提取的步骤是传统基因组DNA提取方法中所没有的，1份组织样可进行4次基因组DNA提取，得到4次基因组DNA样本，使基因组DNA产量显著提高；③本方法能从长期低温(_70°C )储存的幼叶和低的生长温度下(15°C -25°C )采集的油桐幼叶中提取到高质量高产量的基因组DNA。本发明适用于油桐幼叶基因组DNA的提取。
图1是用本方法提取的低温生长的油桐幼叶混合样鲜样基因组DNA的电泳图片 (11月份，气温20°C左右，10个基因型的混合样)；图中1、2、3、4分别为lst、2nd、3rf、4thDNA的电泳图片，设置2个重复。图2是图一所述叶片硅胶干燥处理的情况，设置3个重复。图3是用本方法提取的高生长温度下采集的油桐6个基因型幼叶鲜样基因组DNA 的电泳图片(7月份，气温37°C左右)；图中1、2、3、4分别为lst、2nd、3rf、4thDNA的电泳图片，设置2个重复，A、B、C、D、E、 F代表6个基因型。图4是用本方法提取的低温储存1年的高生长温度下采集的幼叶混合样基因组 DNA的电泳图片(7月份，气温37°C左右，10个基因型的混合样)；图中1、2、3、4分别为lst、2nd、3rf、4thDNA的电泳图片，设置2个重复。英译汉UCTAB =Cetyltrimethyl Ammonium Bromide，十六烷基三甲基溴化铵；2、EDTA =Ethylene Diamine Tetraacetic Acid,乙二胺四乙酸；3, PVP =Polyvinyl Pyrrolidone，聚乙烯吡咯烧酮；4、β -Mercaptoethanol 巯基乙醇。

②加入1. 5mL洗液，充分混勻后，冰中静止15min，12000rpm离心弃上清液；③重复步骤②两次后，加入500 μ 1预热的3% CTAB提取液，充分混勻，65°C水浴 40min ；④12000rpm常温离心15min，转移上清液到新的1. 5mL离心管中，加入100 μ 1的 24 1的氯仿-异戊醇，充分混勻后，常温12000rpm离心15min，抽提2次，抽提后的上清液转入新的离心管中，加入两倍体积的提前预冷到_20°C的100%酒精；放置于-20°C冰柜 30min,让DNA沉淀充分析出，将析出的DNA沉淀转移到含有ImL 70%酒精的1. 5mL离心管中，漂洗2次，每次30min，倒干酒精，待DNA沉淀干燥后，用100 μ 1的Ta ^充分溶解，并用 1 μ 1浓度为10 μ g/mL RNA酶37°C消化30min，该过程得到的DNA样品，称为IstDNA ；⑤对步骤④中转移上清液后离心管下部的组织样品，继续加预热的CTAB提取液， 充分混勻，进行新一轮的DNA提取步骤，这个过程中得到的DNA样品为2ndDNA，依此循环又得到 3rfDNA 和 4thDNA。二、琼脂糖凝胶电泳法检测本方法提取的油桐幼叶基因组DNA如图1，本方法对11月份气温20°C左右采集的油桐幼叶鲜样提取的4次DNA， IstDNA在琼脂糖上没有检测到条带，2nd、3rd、4thDNA均检测到清晰且明亮的电泳条带。说明本方法适合低温度下生长的油桐幼叶鲜叶基因组DNA的提取。如图2，本方法对11月份气温20°C左右采集的油桐幼叶经硅胶干燥后提取的4次 DNA，lstDNA在琼脂糖上没有检测到条带，2nd、3rd、4thDNA均检测到清晰且明亮电泳条带。说明本方法适合低温度下生长的油桐幼叶干样基因组DNA的提取。如图3，本方法对来自7月份的未经低温储存的油桐6个基因型幼叶鲜样提取的4 次DNAastJndJnUthDNA均检测到清晰且明亮电泳条带。和图1、图2相比，不同点在于6 个基因型的IstDNA均检测到清晰明亮的电泳条带。说明油桐幼叶内次生代谢产物随生长温度的降低表现出明显的异质性，对基因组DNA的提取造成明显的影响。进一步说明本方法适合不同温度下生长的油桐幼叶DNA的提取。如图4，本方法对储存1年的7月份幼叶混合样提取的4批次基因组DNA，IstDNA在琼脂糖上没有检测到条带，而2ndDNA，3rfDNA，4thDNA均检测到清晰且明亮电泳条带。和图3 相比，不同点在于来自7月份的油桐幼叶储存1年后，IstDNA在琼脂糖凝胶上没有检测到条带。说明低温长时间储存可能导致油桐幼叶内次生代谢产物成分发生变化，与未储存前表现出明显的异质性，对DNA的提取造成明显的影响。进一步说明本方法适合低温长时间储存条件下的油桐幼叶基因组DNA的提取。图1至图4，综合分析，可看到如果采用传统基因组DNA提取方法，组织样只进行1 次提取，对长久储存的油桐幼叶、生长温度较低采集的油桐幼叶提取基因组DNA，得到的基因组DNA产量可能很低。而用本发明方法，能够极大的提高油桐幼叶基因组DNA的产量，还可克服不同环境下油桐幼叶叶片间化学成分异质性对DNA提取的影响，拓宽了用于油桐基因组DNA提取的幼叶范围。三、紫外分光光度计法检测本方法提取的油桐幼叶基因组DNA的质量和产量以本方法提取的低生长温度下采集的幼叶4批次基因组DNA为例，用紫外分光光度计(型号为Ultrospec 1100)检测其质量和产量。分别测定4批次DNA在波长260纳米和280纳米的吸光值，并计算A260/A^0比值，结果见下表


本发明公开了一种油桐幼叶基因组DNA提取方法，涉及分子生物学实验中植物基因组DNA分离提取技术。本方法主要包括预处理叶片组织样、细胞的破碎、非DNA成分的抽提、DNA的析出、离子的去除和组织样品的循环提取。本发明使用洗液预处理油桐幼叶组织样3次，能有效地去除叶片内富含的蛋白、多酚、多糖等次生代谢产物；本发明对油桐幼叶组织样进行循环提取，该步骤在传统基因组DNA提取方法中是不存在的，本方法1份组织样可进行4次基因组DNA提取，使基因组DNA产量显著提高；本发明能从长期低温储存的幼叶中，以及不同生长温度下采集的新鲜幼叶中提取到高产量和高质量的基因组DNA。本发明适用于油桐幼叶基因组DNA的提取。