专利名称：牵涉心肌梗死后重塑和心力衰竭的微小rna的鉴定的制作方法心脏病及其表现，包括冠心病、心肌梗死、充血性心力衰竭和心脏肥大，清楚地呈现了美国当今的一项重大健康风险。诊断、治疗和支持罹患这些疾病的患者的花费完全达到数十亿美元。心脏病的一种特别严重的表现是心肌梗死。心肌梗死(MI)(更通常称为心脏病发作)是一种在对心脏的一部分的血液供应被中断(最通常是由于易损斑块的破裂所致)时发生的医学状况。所致的缺血或氧缺乏引起心脏组织的损伤和潜在的死亡。它在全世界对于男性和女性都是主要死亡原因。仅在美国，冠状动脉性心脏病占死亡的五分之一， 而且大约7，200，000名男性和6，000，000名女性正在承受某种形式的冠状动脉性心脏病。 这些之中，1，200，000人每年遭受新的或复发的冠状动脉发作(coronary attack)，并且他们之中的约40%由于发作而死亡。这意味着大约每65秒，就有一名美国人死于冠状动脉事件。若受损的对心脏的血流量持续得足够久，则它触发缺血性级联，其中心脏细胞死于坏死，并且在其位置上形成胶原瘢痕。最近的研究指示来自凋亡的细胞死亡也在心肌梗死后的组织损伤过程中发挥作用。因此，患者的心脏会受到永久地损伤。此瘢痕组织还使患者面临潜在危及生命的心律失常的风险，而且可以导致心室壁瘤的形成，所述心室壁瘤可以破裂，伴有灾难性后果。受损伤的心脏组织比正常的心脏组织更缓慢地传导电脉冲。受损伤的与未受损伤的组织间的传导速度差异可以触发被认为是许多致命性心律失常的原因的再进入或反馈环。心输出量和血压可能下降到危险的水平，其可以导致进一步的冠状动脉缺血和梗死的扩散。在对梗死组织的直接影响外，梗死周围的边界区中的相邻组织也经历由改变的基因调节触发的病理性重塑。此重塑导致此区域中的进一步的肌细胞丧失、增生和进一步的胶原沉积。梗死后，远处的心肌(myocardium)通过心肌细胞肥大和间质性纤维化的发作来响应梗死。如此，虽然对梗死组织的损伤可能到临床上诊断并解决MI时已在很大程度上不可挽回，但是由于MI后重塑所致的进一步变化呈现治疗性干预的一个很有可能的点。然而，目前，没有解决心脏病的此方面的已知治疗。以鉴定可容许对受损伤的心脏恢复功能的治疗性靶物为目的，已经广泛研究了与 MI后重塑有关的基因表达和信号传导途径的变化。目前，已经描述了微小RNA在心脏肥大和心力衰竭中的关键作用，指向调节心脏病的一种新模式。微小RNA(miRNA)是长度为约18 至约25个核苷酸的小的、非蛋白质编码RNA，其源自单独的miRNA基因、蛋白质编码基因的内含子、或经常编码多种紧密相关的miRNA的多顺反子转录物。参见Carrington等的综述 Science，第301卷(5631) =336-338,2003) miRNA通过促进靶mRNA的降解(在它们的序列完全互补时)，或者通过抑制翻译(在它们的序列含有错配时)来充当其阻抑物。miRNA 通过 RNA 聚合酶 II (pol II)或 RNA 聚合酶 III (pol III ；参见 Qi 等 Q006) Cellular&Molecular Immunology，第3卷411-419)转录，并且产生自一般长几千个碱基的初始转录物，其称作初级miRNA转录物(pri-miRNA)。pri_miRNA在细胞核中被RNA酶 Drosha加工成约70至约100个核苷酸的发夹形前体(pre-miRNA)。转运到胞质后，发夹 pre-miRNA被Dicer进一步加工以生成双链miRNA。然后，成熟的miRNA链掺入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，在那里它通过碱基对互补性与其靶mRNA结合。在miRNA碱基与 mRNA靶物完全配对的相对罕见的情况中，它促进mRNA降解。更通常地，miRNA与靶mRNA形成不完美的异双链体，影响mRNA稳定性或者抑制mRNA翻译。基于小鼠和人中的一大批遗传研究，变得越来越清楚的是，miRNA实际上积极参与心脏重塑、生长、传导、和收缩性(综述见van Rooij和Olson(2007) Journal of Clinical hvestigation，第117卷(9) :2369-2376)。牵涉心血管疾病的miRNA的鉴定和表征对于开发用于治疗心血管疾病，诸如心肌梗死和心力衰竭的新治疗方法是重要的。发明概述本发明部分基于数种miRNA的发现，所述miRNA在人的心肌梗死和心力衰竭后在心脏组织中受到调节。调控这些鉴定出的miRNA呈现一种用于治疗或预防心肌梗死、心脏重塑、和心力衰竭的新治疗方法。因而，本发明提供了一种在有此需要的受试者中治疗或预防心肌梗死、心脏重塑、或心力衰竭的方法，包括调控一种或多种鉴定的miRNA在受试者的心脏细胞中的表达或活性。在一个实施方案中，所述一种或多种miRNA选自下组let-7 家族成员、miR-15b、miR-21、miR_199a、miR_199b、miR-214、miR-10a、miR-10b、miR-16、 miR-146a> miR—146b、miR-22U miR-222> miR-497> miR-20a> miR—20b、miR-93> miR-10U miR-126> miR-30 方 員、miR—143、miR-145> miR—150、miR-29a-c> miR-34a> miR-34c> miR-574、miR-451、miR-499、miR-100、miR-378、miR-24, miR-379、miR-762、miR-335、 miR-711、miR-149、miR-218、miR-181a-d、miR-22、和 miR-185。在一个实施方案中，所述方法包括对受试者施用一种或多种鉴定的miRNA的抑制剂。例如，抑制剂可以是选自下组的miRNA的表达或活性的抑制剂let-7家族成员、 miR-15b> miR-2U miR-199a> miR-199b> miR—214、miR-10a> miR—10b、miR—16、miR-146a> miR-146b、miR-221、miR-222、miR-30 家族成员、和 miR-497。一种或多种 miRNA 的抑制剂可以包括微小RNA拮抗剂(antagomir)、反义寡核苷酸、或抑制性RNA分子。在另一个实施方案中，所述方法包括对受试者施用一种或多种鉴定的miRNA的激动剂。在一些实施方案中，激动剂提高选自下组的miRNA的表达或活性miR-20a、miR-20b、 miR-93、miR-101、miR-126、miR-143、miR-145、miR-150、miR-29a、miR-29b、和 miR_29c。在某些实施方案中，一种或多种miRNA的激动剂是包含一种或多种miRNA的成熟序列的多核苷酸。激动剂可以在体内自表达构建体表达。在一些实施方案中，所述方法可以进一步包括对所述受试者施用第二心脏肥大疗法，诸如β阻断剂、肌力药(i0n0tr0pe)、利尿药、ACE-I、AII拮抗剂、BNP、-Ca++阻断剂、内皮缩血管肽受体拮抗剂、或HDAC抑制剂。可以与所述miRNA调控剂(例如，抑制剂或激动剂)同时或者在所述miRNA调控剂之前或之后施用第二疗法。附图简述附图形成本说明书的一部分，并且包括在内以进一步表明本发明的某些方面。可以通过与本文中所呈现的具体实施方案的详细描述结合参考这些附图中的一幅或多幅来更好地理解本发明。图1 响应MI的miRNA概况分析。A 对心脏切片的Masson三色染色(Masson Trichrome staining)指示MI后3天的瘢痕形成，伴有肌细胞肥大、进行中的肌细胞损失和胶原沉积。梗死后14天，存在着变薄的伸展开的梗死，其导致非梗死区域中的间质性纤维化和心脏肥大。(I，梗死；BZ，边界区；R，远处的心肌)。B:微阵列分析指示miRNA响应 MI而非常受到动力学调节。即使在初始梗死愈合后，即MI后14天，11种miR在边界区中受到重叠地上调，而15种miR受到下调。C:在MI后3天和14天，边界区区域中的上调的 miR(左侧小图)和下调的miR(右侧小图)的柱状图。D 实时PCR分析确认与假操作的动物(n = 3-4)相比响应MI的miRNA的调节。E 与未衰竭的心脏(n = 5-6)相比响应MI的人心脏样品中的指定miRNA的实时PCR分析。F 3个未衰竭的人心脏和5个MI后的人心脏中的miR-21的Northern印迹分析。图2 :miR-29在MI后的梗死区域中受到下调。A :miR-29家族成员的序列比对指示保守的种子区(5’端的bp 2-8)和miRNA3’端中的高水平序列保守。B 对多种组织的 Northern印迹分析指示所有三种miR-四成员在表达方面的较大重叠，其中在肺和肾中的表达水平较高。在miR-四成员中，miR-29b表现为在心脏中最高度表达。C:对miR-四的实时PCR分析指示与无血清培养基(SF)中保持的或用去氧肾上腺素(PE)刺激的心肌细胞相比要在成纤维细胞中高度表达的此miR。D 对MI后3天的心脏组织的Northern印迹分析显示与假操作的动物相比响应MI的miR-四的一致下调。miR-29的下调在边界区中比在远处的心肌中更明显。E 实时PCR分析指示要响应MI而受调节的所有miR-四成员。虽然下调在MI后3天的梗死边界区(BZ)中最明显，但是此下调在梗死后14天在已经发生初始梗死愈合时仍存在。图3 :miR-29调节胞外基质蛋白的表达。A 关键的纤维化基因的3’UTR区中潜在的miR-四结合位点。B 对MI后3天的边界区和远处的心肌两者中的预测的靶基因的实时 PCR分析。miR-四表达降低与胶原(C0L1A1、C0L1A2和C0L3A1)和肌原纤蛋白(FBNl)的表达升高相关联。没有观察到弹性蛋白(ELNl)的显著变化。C:对用增加量的miRj9b-l/ miR-29a簇转染的COS细胞的Northern印迹分析显示miR-四的有效的过表达。D 使用预测的靶基因的内源UTR序列的萤光素酶实验。miRj9b-l/miRj9a的表达阻抑萤光素酶的表达，而阻抑在表达无关的miR，即miR-206时是缺乏的。图4 :miR-29表达响应TGF β。A 实时PCR分析指示所有三种miR-四家族成员在成纤维细胞中响应TGF0而下调。B :Northern分析，其显示了 miR-四表达在miR-208突变体动物中受到上调，这与BNP表达升高刚好一致，如通过实时PCR所测定的。图5 :miR-29抑制在体内诱导纤维化。A :anti-miR-29和错配(mm)miRj9寡核苷酸的化学结构。B:Northern印迹分析，其显示了响应静脉内注射80mg/kg anti-miR-四或 mm miR-29中任一或相当体积的盐水的3天后的组织特异性敲低。C 对肝提取物的实时PCR 分析指示响应miR-四敲低的胶原表达的明显升高。此效应在盐水或mm miR-四注射后是缺乏的。D 对在连续两天静脉内注射80mg/kg anti-miR-四或mm miR-四寡核苷酸中任一或相当体积的盐水后3周收集的组织的Northern印迹分析。anti-miR-四的注射在心脏、肝和肾中产生对miR-四的严格敲低(severe knockdown)，而肺中的miR-四水平表现得不受影响。E 对心脏提取物的实时PCR分析指示响应miR-四敲低的心脏胶原表达的升高。F: 实时PCR分析，其指示在miR-29b模拟物处理后2天在成纤维细胞中的miR_29b表达升高， 而miR-29a水平未改变，并且miR_29c水平仅略微升高。G 成纤维细胞中的miR_29b过表达阻抑胶原基因的表达，如通过实时PCR分析所测定的。发明详述本发明部分基于在心肌梗死后受到调节的miRNA子集的鉴定。具体地，发明人发现了在梗死区的边界区中显著受到调节的40种miRNA和在心肌梗死(MI)诱导后3天在远处的心肌中受到调节的22种miRNA。此外，69种miRNA的表达在MI诱导后2周在梗死区的边界区中是改变的，而40种miRNA在远处的心肌中受到调节。另外，发明人发现了在来自衰竭的人心脏的心脏组织中受到调节的不同的、但是重叠的miRNA子集。发现在来自人心力衰竭患者的心脏组织中31种miRNA受到显著上调，而45种miRNA受到显著下调。 受调节的miRNA的重叠提示这些miRNA可能牵涉不同心脏病过程，而且积极地影响疾病状态。因而，本发明提供了一种在有此需要的受试者中治疗或预防心肌梗死、心脏重塑、或心力衰竭的方法，包括调控表3-6中所列的一种或多种miRNA在该受试者的心脏细胞中的表达或活性。在某些实施方案中，所述一种或多种miRNA选自下组let-7家族成员(例如 let-7a、let-7b、let_7c、let_7d、let_7e、let_7f、let_7g、禾口 let_7i) (SEQ ID NO :1-8) > miR-15b(SEQ ID NO :9)、miR_21(SEQ ID NO :10)、miR_199a(SEQ ID NO :11)、miR_199b(SEQ ID NO :12-13)、miR-214 (SEQ ID NO :14)、miR_10a(SEQ ID NO : 15)、miR-10b (SEQ ID NO: 16)、miR-16(SEQ ID NO : 17)、miR_146a (SEQ ID NO :18)、miR_146b (SEQ ID NOs :19-20)、 miR-221(SEQ ID NO :21)、miR_222(SEQ ID NO :22)、miR_497(SEQ ID NO :23)、miR_20a(SEQ ID NO :24)、miR-20b(SEQ ID NO :2 、miR-93 (SEQ ID NO :26)、miR-101 (SEQ ID NO :27)、 miR-126(SEQ ID NO :28)、miR-30 家族成员(例如 miR_30a、miR_30b、miR_30c、miR_30d、 和 miR-30e) (SEQ ID NO :29-33)、miR-143 (SEQ ID NO :34)、miR-145 (SEQ ID NO :35)、 miR-150(SEQ ID NO :36)、miR-29a_c (SEQ ID NOs :37-39)、miR_34a (SEQ ID NO :40)、 miR-34c(SEQ ID NOs :41-42)、miR-574 (SEQ ID NO :43-44)、miR-451 (SEQ ID NO :45)、 miR-499 (SEQ ID NO :46)、miR-100 (SEQ ID NO :47)、miR-378 (SEQ ID NO :48)、miR-24 (SEQ ID NO :49)、miR-379(SEQ ID NO :50)、miR-762 (SEQ ID NO :51)、miR-335 (SEQ ID NO: 52)、miR-711 (SEQ ID NO :53)、miR-149 (SEQ ID NO :54)、miR-218 (SEQ ID NO :55)、 miR-181a-d(SEQ ID NO :56-59)、miR-22 (SEQ ID NO :60)、和 miR-185 (SEQ ID NO :61)。如本文中所使用的，术语“受试者”或“患者”指任何脊椎动物，包括但不限于人和其它灵长类(例如，黑猩猩和其它猿和猴物种)、家畜(例如，牛、绵羊、猪、山羊和马)、家养哺乳动物(例如，犬类和猫类)、实验室动物(例如，啮齿类诸如小鼠、大鼠和豚鼠)、和禽类(例如，家养的、野生的和猎禽诸如鸡、火鸡及其它家禽、鸭、鹅等)。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在其它实施方案中，受试者是人。在要治疗的受试者是人的此类实施方案中，要调控的一种或多种miRNA是人miRNA序列。如本文中所使用的，术语“调控”指miRNA的生物学活性的变化或变更。调控可以是miRNA表达水平的变化、miRNA的结合特征(例如对靶mRNA或对RISC复合物的组分)的变化、或与miRNA有关的生物学或功能性特征的任何其它变化。调控可以是miRNA的表达或功能的升高或降低。术语“调控”指能够改变或变更如上文所描述的miRNA的表达或生物学活性的任何分子或化合物。在一个实施方案中，所述方法包括对受试者施用表3-6中所列的一种或多种 miRNA(或对应的人miRNA)的抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制剂靶向pre_miRNA或 pri-miRNA序列。在其它实施方案中，所述抑制剂靶向成熟的miRNA序列。在另一个实施方案中，所述抑制剂是一种或多种选自下组的成熟miRNA序列的表达或活性的抑制剂let-7 家族成员(例如 let-7a、let-7b、let_7c、let_7d、let_7e、let_7f、let_7g、禾口 let_7i) (SEQ ID NO :1-8)、miR-15b(SEQ ID NO :9)、miR_21 (SEQ ID NO : 10)、miR_199a(SEQ ID NO: 11)、miR-199b(SEQ ID NO :12-13)、miR-214 (SEQ ID NO : 14)、miR-10a (SEQ ID NO :15)、 miR-lOb(SEQ ID NO : 16)、miR_16(SEQ ID NO : 17)、miR_146a(SEQ ID NO : 18)、miR_146b(SEQ ID NOs :19-20)、miR-221 (SEQ ID NO :21)、miR-222 (SEQ ID NO :22)、miR-497 (SEQ ID NO: 23)、和 miR-30 家族成员 H^i^nmiR-30a、miR-30b、miR-30c、miR-30cUnmiR-30e) (SEQ ID NO :29-33)。在某些实施方案中，一种或多种miRNA的抑制剂是反义寡核苷酸。反义寡核苷酸可以包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或其组合。优选地，反义寡核苷酸具有至少一处化学修饰(例如，糖或主链修饰)。例如，合适的反义寡核苷酸可以由一个或多个“构象约束性”或二环糖核苷修饰(BSN)，，构成，所述修饰对含有BSN的寡核苷酸与其互补微小RNA靶标链间形成的复合物赋予增强的热稳定性。例如，在一个实施方案中，反义寡核苷酸含有至少一个“锁定核酸(locked nucleic acid)”。锁定核酸(LNA)含有2，_0，4，-C-亚甲基核糖核苷(结构A)，其中核糖糖模块为“锁定”构象。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸含有至少一个2’，4’-C-桥接的2’脱氧核糖核苷(⑶NA，结构B)。参见例如美国专利 No. 6，403，566 禾口 Wang 等(1999) Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters，第 9 卷 1147-1150，通过提及而将这两篇都完整收入本文。在又一个实施方案中，反义寡核苷酸含有至少一个经修饰的核苷，其具有结构C中所显示的结构。靶向一种或多种miRNA的反义寡核苷酸可以含有BSN(LNA、CDNA等)或其它经修饰的核苷酸和核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的组合。本发明涉及鉴定牵涉心脏组织中的心力衰竭和心肌梗死后重塑过程的miRNA。描述了调控这些鉴定的miRNA作为对于心肌梗死、心脏重塑、和心力衰竭的治疗。