专利名称：一种人乳头瘤病毒(hpv)的分型定量检测方法及试剂盒的制作方法人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,简称HPV)是一种嗜上皮性病毒，有高度的特异性。根据致病力强弱，HPV被分为高危型和低危型两种，“是否能致癌”是危险度大小的主要标志。全世界每年宫颈癌的新发病例大约有500，000，是除乳腺癌之外威胁女性生命健康的第二大恶性肿瘤。HPV和宫颈癌的病因学关系已经明确，从HPV感染到宫颈癌发生需要较长时间，在此期间通过检测可以了解是否感染HPV，早发现早治疗，从而有效预防宫颈 癌的发生。目前主要的技术方法如下1.原位杂交优点是特异性好；缺点是操作繁琐费时耗力、需要大量较纯的DNA。2. DNA直接捕捉法优点是有大量的数据支持该技术的应用，能检测高危型别；缺点是灵敏度低于PCR ;不能确定具体的HPV亚型。3.亚型特异性PCR :优点是特异性较好；缺点是劳动强度大。4.通用引物PCR:优点是灵敏度高，一次可以扩增多种亚型；缺点是不能区分确定具体HPV的亚型。5. PCR产物直接测序优点是在确定目前尚未知道的HPV亚型感染以及突变研究时尤其有用；缺点是不是十分灵敏，特别是对HPV混合感染的临床样本更是如此，不宜作为体外诊断方法。6. PCR-酶联免疫分析法优点是灵敏度高；缺点是样本消耗大。7. PCR-固相反向杂交法优点是效率高、一次实验可分出多个HPV亚型；缺点是重复性较差。8.荧光定量PCR:优点是灵敏度高、操作方便、耗时短；缺点是通量少、一次只能检测1-2个亚型、且不能确切分型。9.优点是成本相对较低，操作简单；缺点是可以观察到细胞形态的变化，但不能确定发生细胞形态变化的病因；取样的部位决定检测的结果。综上，目前的人乳头瘤病毒(HPV)的主要检测方法存在操作繁琐费时耗力、灵敏度低、劳动强度大、样本消耗大、重复性较差、通量少的缺点。
本发明的目的是提供一种灵敏度高、重复性好、准确性强、灵活性强、成本低的人乳头瘤病毒(HPV)的分型定量检测方法。本发明采用如下技术方案本发明的一个方面涉及一种人乳头瘤病毒(HPV)的分型定量检测方法，包括如下步骤⑴收集宫颈样品；⑵样品DNA提取；(3)以提取的DNA样品为模板进行PCR反应；(4)以毛细电泳的方法分离样品。优选地，所述步骤(2)包括如下子步骤I)取500 μ L细胞保存液于1. 5mL EP管中，13000g离心5分钟,去掉上清液,底部为宫颈脱落细胞；2)向含有宫颈脱落细胞的EP管中加入500 μ L裂解液，裂解10分钟；3)向裂解液中加入100 μ L磁珠吸附游离的DNA ；4)用清洗液将磁珠清洗两次；5) 100 μ L 洗脱液洗脱 DNA。优选地，所述步骤(3)包括按比例在样品板上加入试剂和样品、以及混匀后按一定温度进行热循环反应的子步骤。优选地，所述步骤⑶的子步骤中的热循环温度分别为94°C、60°C、70°C、4°C。优选地，所述步骤(4)包括制备GeXP遗传分析仪样品、准备分离液、毛细电泳分离样品、结果分析的步骤。 本发明的另一方面涉及一种用于上述方法的试剂盒，包括以下试剂引物管、溶液X、PCR缓冲剂、25mM氯化镁、聚合酶以及阳性对照。本发明的有益效果为1.灵敏度高、重复性好采用激光诱导荧光-PMT，具有超高灵敏度。2.准确性强=GeXP采用毛细管电泳对PCR产物进行分离检测，可将非特异性扩增产物、引物二聚体和特异性扩增产物分离，最大程度降低假阳性。3.高通量本系统采用双(96孔)板、自动加样和样品追踪技术，实现单个反应检测30-40个位点，可同时做192个反应(如192个患者样品，每个样品检测19种呼吸道病毒，22个位点)，一天出结果；对于交叉感染患者，本方法可一次性给出准确报告，避免漏检。4.精确定量可精确定量病原体基因拷贝数。5.灵活性强可随时根据需求增加或删减HPV亚型。6.成本低利于大规模推广。的分型定量检测方案，具体亚型见表I。本发明的25种HPV亚型的特异性引物是针对各亚型基因组上的致癌基因E6/E7设计的，再通过多重PCR和毛细电泳的方法，根据扩增片段长度的不同将各亚型分辨出来。建立了可靠的样品质量及反应过程的对照(表I)a)人DNA完整性的对照内参β -globin :确保在检验过程中对样品质量的判断，避免假阴性。b)正常反应对照内参pcDNA3.1 (+):监控PCR反应效率，避免假阴性。2.通过人为加入反应内参pcDNA3. 1(+)对HPV亚型的拷贝数进行定量。3. 25种HPV分型检测的引物序列(见表2)。表1.检测的HPV亚型和反应参照

本发明公开了一种人乳头瘤病毒(HPV)的分型定量检测方法，包括如下步骤(1)收集宫颈样品；(2)样品DNA提取；(3)以提取的DNA样品为模板进行PCR反应；(4)以毛细电泳的方法分离样品。本发明具有灵敏度高、重复性好、准确性强、灵活性强、成本低的优点。