专利名称：甲鱼油中ω－3多不饱和脂肪酸的提取方法甲鱼是我国传统的上等中草药村，具有极高的药用价值，是滋阴补肾的佳品，有滋阴壮阳，软坚散结、化淤和延年益寿的功能。甲鱼油中富含人体必需脂肪酸ω-3多不饱和脂肪酸，尤其是其中的二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，被称为天然的血液净化剂，具有减少血栓形成、预防中风、预防动脉硬化及心肌梗死、降低血压、减缓发炎、减轻并改善类风湿性关节炎、改善并减轻结肠性结肠炎等作用。当人体内有足够ω-3多不饱和脂肪酸时，可以预防肿瘤、智力障碍、记忆力下降以及自身免疫性疾病，并有效预防心血管疾病并提高运动的耐受力。近年来对甲鱼油提取的研究较多，如韩玉谦等(超临界CO2萃取甲鱼油的研究，《中国油脂》，2003，28(10))介绍了用超临界CO2萃取技术从甲鱼中提取分离甲鱼油，探讨了影响萃取率的主要因素，并确定了适宜工艺条件为20Mpa，45℃，CO2流量为1.8kg/(h*g)原料，萃取时间为6h，该方法得到的甲鱼油中不饱和脂肪酸的含量高达70％以上，其中多不饱和脂肪酸含量大于26％。由于甲鱼油多不饱和脂肪酸中最有医药价值的是EPA和DHA，所以仍然需要对二者进一步提取纯化。目前常用的方法均存在一定缺陷，如尿素包合法需先酯化处理，包合步骤复杂，并且包合过程中可形成致癌物氨基甲酸酯；分子蒸馏法的高温和长时间会导致多烯酸的氧化和分解；吸附分离法中的洗脱剂易增加污染，不宜大规模制备。所以仍需要提供一种操作简便、效率高、产品稳定的甲鱼油中ω-3多不饱和脂肪酸的提取方法。
本发明的提取方法包括以下步骤(1)将干燥甲鱼油粉碎为直径为0.1-5.0mm的颗粒，然后在萃取压力18-22Mpa、温度40-60℃、以体积/重量计的CO2流量为1.5-3ml/g的条件下进行超临界CO2萃取3-6h，再在压力7-9Mpa、温度35-55℃的条件下进行分离，得到萃取物；(2)往在步骤(1)得到的萃取物中按照体积比(g/ml)1∶4-16的比例加入丙酮，搅拌0.5-2h，再在温度-60℃至-40℃下放置6-10h，弃去上清液，得ω-3多不饱和脂肪酸提取物。其中，在步骤(1)中，优选的提取条件为萃取压力为20Mpa，温度为50℃，CO2流量为1.5-2ml/g，分离压力为8Mpa，温度为45℃，萃取时间为5-6h；在步骤(2)中，优选的提取条件为在步骤(1)所得提取物中按体积比1∶10-13的比例加入丙酮，搅拌1-2h后于温度-50℃下放置8-10h。在步骤(2)中，当萃取物与丙酮的比例高于1∶4时，放置的温度不能低于-50℃，否则混合物会冻结成膏状，无上清液析出。当萃取物与丙酮的比例低于1∶16时，并不能使最终的提取物中EPA和DHA的含量增加。当放置温度高于-40℃时，含两个或两个以上烯键的脂肪酸的提取率降低。
另外，在步骤(2)中，弃去的上清液为丙酮溶液，所剩下的沉淀物即为ω-3多不饱和脂肪酸提取物，其中含有的少量丙酮可以通过自然挥发除去，或者在温度25-45℃下烘干至无丙酮味即可。
本发明所述的干燥甲鱼油可以通过商品购买得到，如山东省临清市甲鱼养殖基地生产的干燥甲鱼油。或者通过已知方法从甲鱼中进行提取，如前述的韩玉谦等(超临界CO2萃取甲鱼油的研究，《中国油脂》，2003，28(10))介绍的方法。
所述的超临界CO2萃取工艺中使用的设备及气体均可通过商品购买得到，如美国Applied Separations(ASI)公司生产的超临界萃取仪，上海德邻仪器设备有限公司生产的R-401超临界萃取系统，江苏华安超临界萃取公司生产的HA-221-50-06型超临界萃取装置等。在本发明中，对所涉及的仪器没有特殊限定。
使用本发明的提取方法，甲鱼油中ω-3多不饱和脂肪酸的提取率为60-75％。
提取物中的EPA和DHA含量可以通过气相色谱法测定，其含量按重量计为所得提取物的25-30％。本发明将超临界CO2萃取技术与低温结晶技术相结合提取甲鱼油中的有效成分EPA和DHA，操作简便、萃取条件温和、无溶剂污染，所得到的提取物无氧化、分解、异构化等反应，最终的产品无溶剂污染，性质稳定，适于制备药品和营养品，具有较高的医药价值。

实施例1(1)将3.3kg干燥甲鱼油粉碎为直径为2.0mm的颗粒后装入萃取釜内，进行超临界CO2萃取，萃取压力为22Mpa，温度为40℃，CO2流量为1.8ml/g，萃取时间为4h，分离压力为8Mpa，温度为45℃，得萃取物；(2)将步骤(1)所得萃取物中按体积比1∶10的比例加入丙酮，搅拌1h后于温度-60℃下放置8h，弃去上清液，得提取物2.16kg。
本实施例中使用的仪器为江苏华安超临界萃取公司生产的HA-221-50-06型超临界萃取装置，使用的萃取气体为北京普莱克斯气体公司生产的CO2(食品级，纯度为99.99％)。
实施例2(1)将4kg干燥甲鱼油粉碎后装入萃取釜内，进行超临界CO2萃取，萃取压力为20Mpa，温度为50℃，CO2流量为2ml/g，萃取时间为6h，分离压力为10Mpa，温度为40℃，得萃取物；(2)将步骤(1)所得萃取物中按体积比1∶12的比例加入丙酮，搅拌1h后于温度-50℃下放置10h，弃去上清液，所得沉淀物于35℃烘箱内至无丙酮味，得提取物2.99kg。
其他条件同实施例1。
实施例3提取物中EPA和DHA的含量测定按照《中华人民共和国标准》中关于“食品中二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的测定”(GB/75009.168-2003)的方法，对本发明提取物中EPA和DHA的含量进行测定，具体操作如下1、供试品溶液的制备取实施例2所得ω-3多不饱和脂肪酸提取物1g，按下列步骤进行处理后作为供试品溶液(1)、皂化将提取物置于50ml具塞容量瓶中，加入正己烷使其充分溶解并定容至10ml，取所得溶液2ml置于10ml具塞试管中，并加入2mol/l氢氧化钾-甲醇溶液1ml，充分振荡10min，放入60℃的水浴中加热2min，然后冷却至室温；(2)、甲酯化向上述试管中加入2mol/l盐酸-甲醇溶液2ml，充分振荡10min，放入50℃的水浴中加热2min，弃去下层溶液，再以2ml蒸馏水洗涤上层正己烷溶液并弃去水层；(3)、用无水硫酸钠对正己烷溶液进行脱水，然后将脱水后的溶液于60℃下浓缩，定容至1ml，作为供试品溶液。
2、对照品溶液的制备取EPA和DHA两种脂肪酸甲酯标准品(美国Nu Chek Prep公司生产，公司货号分别为U-84-M和U-99-M)，每种标准品分别用正己烷配制成0.5、1.0和2.5mg/ml三个浓度的溶液，作为对照品溶液。
3、色谱条件Stabilwax空心石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μl)(美国Restek公司)；AUTOSYSTEM XL型GC气谱仪(美国PE公司)；载气为He，其流量为1.0ml/min；程序升温从230℃以5℃/min的速度降至225℃，维持5min，再以5℃/min的速度升至250℃；进样口温度为250℃，检测器温度为260℃，分流比为10∶1，线速30cm/min，衰减16。
4、测定结果取上述供试品溶液和对照品溶液各1μl，分别进样，重复3次，结果显示使用本发明方法得到的提取物中，EPA+DHA的含量为28.92％，其中EPA的含量为11.73％，DHA的含量为17.19％。


本发明提供了一种甲鱼油中ω－3多不饱和脂肪酸的提取方法，该方法是将超临界CO