专利名称：约氏乳杆菌及其菌剂、应用和预混料的制作方法随着人们对抗生素饲料添加剂带来负面效应的意识不断提高，饲料微生态制剂是作为一种新型的抗生素替代品，具有无毒副作用、无耐药性、无残留、效果显著等诸多优点， 受到了养殖业的欢迎。复合活菌制剂作为微生态制剂的一种，已被广泛应用于畜牧业养殖。其主要有两种或两种以上的不同益生菌菌属组成，注重不同菌属之间的互补性，总体上发挥正组合效应。将具有不同生物功能的益生菌组合成复合活菌制剂以达到维持胃肠道内环境稳定的目的，以助于饲料中各种营养成分消化率的提高。目前，通常应用的菌种主要是乳酸杆菌、芽孢杆菌以及酵母杆菌等，约氏乳杆菌(LactcAacillus johnsonii)是目前欧盟新被批准使用，在我国和美国尚待批准使用的饲用微生物菌种，国内外对其研究较少。约氏乳杆菌(LactcAacillus johnsonii)是普遍存在于人和动物肠道中的有益乳酸菌，可承受胃酸和胆汁的作用而到达小肠的上部并粘附于小肠壁，因而能够有效地抑制肠道病源微生物的生长，从而用于预防和治疗腹泻，防治畜禽坏死性肠炎，调整肠道菌群平衡和调节机体免疫反应等，对人和动物无害，具有很好的市场前景。我国卫生部也于2003 年批准约氏乳杆菌作为保健食品益生菌种。嗜酸乳杆菌(LactcAacillus acidophilus)从动物肠道中分离得到，能分泌抗生物素类物质(嗜酸乳菌素、嗜酸杆菌素、乳酸菌素)对肠道致病菌产生拮抗作用，抑制肠道不良微生物的增殖，调整肠道菌群平衡。另外，短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)经发酵可产生乙酸、琥珀酸、苹果酸和乳酸组成的有机酸。在饲喂过程中添加该菌株，可提高原料的利用率以及改善其适口性。约氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌和短小芽孢杆菌联合应用制备成微生态制剂或预混料， 国内外尚无报导。
本发明的目的是提供一种约氏乳杆菌以及含有该菌株的菌剂。本发明的另一目的是提供该菌剂在制备饲料添加剂中的应用及包含该菌剂的预混料。本发明的目的是通过如下技术方案实现的本发明提供一种约氏乳杆菌(LactcAacillus johnsonii)，其保藏编号为CGMCC No.4926。本发明还提供了包含该约氏乳杆菌的菌剂。进一步，本发明的菌剂还包含嗜酸乳杆菌(LactcAacillus acidophilus) CGMCC No. 5093、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)CGMCC No. 4756，菌剂中约氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、短小芽孢杆菌的配比为约氏乳杆菌嗜酸乳杆菌短小芽孢杆菌= 1-10 1-10 1-10。更进一步，菌剂中约氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、短小芽孢杆菌的配比为约氏乳杆菌 嗜酸乳杆菌短小芽孢杆菌=1 1 1。为保证菌剂中各种菌的活性，本发明的菌剂中还包含冻干保护剂，每克菌剂中冻干保护剂的添加量为125mL。其中，所述的冻干保护剂的组成及含量如下250mL保护剂中蔴糖10g_15g，山梨醇10g-15g，脱脂奶粉13g-18g，蒸馏水加至250mL。本发明的菌剂可制备成饲料添加剂应用。本发明的菌剂添加到预混料可制备成含该菌剂的预混料，其中，预混料中菌剂添加的质量体积比是1-10%0。本发明所述的约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)CGMCC No. 4拟6是申请人从北京猪大肠中筛选出来，经过胃酸、胆盐的驯化和选育得到的，此株约氏乳杆菌抗逆性比较强，具有良好的耐酸性、人工胃肠液耐受性及胆盐耐受性。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期为2011年6月8日，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，简称CGMCC，保藏号是CGMCC No. 4拟6。本发明的嗜酸乳杆菌(LactcAacillus acidophilus)为申请人从猪粪便中分离得到，其生物学特征如下菌落圆整，表面光滑，不透明，乳白色，边缘光滑，革兰氏阳性菌；单个菌体为杆状。本发明的嗜酸乳杆菌经过人工胃液、胆汁液及抗逆性的筛选；可以耐受pH2.0，l%胃蛋白酶的人工胃液，可以耐受0.3%的人工胆汁液，也可以抑制致病性大肠杆菌K88，痢疾杆菌和金黄色葡萄球菌，具有较强的产酸和抑菌能力。本发明的嗜酸乳杆菌(LactcAacillus acidophilus)申请人已于2011年7月沈日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址同上，保藏编号为CGMCC No. 5093。本发明的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)为申请人首次在国内分离到的一株来源于动物消化道的新的短小芽孢杆菌，为申请人从牛的瘤胃中分离得到的一株芽孢杆菌优势菌株，经过生理生化及 16s RNA分析鉴定，表明该菌属于短小芽孢杆菌，其分类命名为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，已于2011年4月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 地址同上,简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No. 4756。本发明中的约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)CGMCC No. 4拟6容易在猪肠道内存活并发挥益生作用，其安全性亦有保证。此外该菌具有很强的胃酸耐受能力，同时具有一定的胆盐耐受能力，对动物肠道常见致病菌大肠杆菌K88，K99和金黄色葡萄球菌有抑制作用，这些都符合微生态制剂的要求。另外，本发明中的嗜酸乳杆菌(LactcAacillus acidophilus)CGMCC No. 5093、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)CGMCC No. 4756亦为申请人从众多菌株中筛选得到，具有很好的益生功能和抗逆性能。上述三种菌联合使用制备成菌剂、制备成饲料添加剂及添加到预混料中，国内外尚无报导。本发明的含上述三种菌的活菌制剂作为饲料添加剂添加到饲料中，经饲养动物后，可显著提高断奶仔猪生产性能，降低仔猪腹泻率，提高经济效益。具有推广应用前景，并且为寻找抗生素替代品提供了理论与实践基础。通过下列实施例将更具体的说明本发明，但是应理解所述实施例仅是为了说明本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围。 实施例1约氏乳杆菌CGMCC No. 4926抗逆性的验证取约氏乳杆菌CGMCC No. 4拟6菌液ImL接种于IOmL MRS培养基中，37°C恒温厌氧培养20h，然后取菌悬液3mL，12000rpm离心5min后，弃去上清，将菌体沉淀加入IOml pH2.0，l%胃蛋白酶的人工胃液中，37°C静置池；12000rpm离心5min，弃去上清，将菌体沉淀加入IOml浓度为0. 3%的人工胆盐中，37°C静置池。振荡混勻后，取菌悬液ImL用无菌生理盐水梯度稀释涂MRS培养基平板。37°C恒温厌氧培养20h后，纯化菌落。初筛得到的菌株再进行进一步复筛。(1)人工胃液的耐受性取约氏乳杆菌CGMCC No. 4926菌液ImL接种于IOmLMRS培养基中，37°C恒温厌氧培养20h后，取ImL菌液用无菌生理盐水梯度稀释涂MRS培养基平板计活菌数。另外取ImL 上述菌液加入9mL人工胃液中，37°C静置池，平板菌落计数法计残存活菌数，残存活菌率为 93. 7%。(2)人工胆盐的耐受性取约氏乳杆菌CGMCC No. 4926菌液ImL接种于IOmL MRS培养基中，37°C恒温厌氧培养20h后，取ImL菌液用无菌生理盐水梯度稀释涂MRS培养基平板计活菌数。取ImL上述菌液加入9mL人工胆盐培养基中，37°C静置池，平板菌落计数法计残存活菌数，残存活菌率为85. 7%。验证性实验表明本发明的约氏乳杆菌CGMCC No. 4926的抗逆性强，可以耐受人工胃液，人工胆盐，因此在经过动物胃肠道环境后，还有大量活菌可以顺利进入动物的肠道， 在肠道中存活，发挥益生功能。生理盐水的配置方法是0. 85%的氯化钠，高压灭菌后备用。人工胃液的配制方法是胃蛋白酶，0.85%的氯化钠，用HCl调pH值到2. 0，细菌过滤器过滤备用。人工胆盐的配置方法是在液体肉汤中添加0. 3%的猪胆盐(分析纯)，高压灭菌后备用。 实施例2约氏乳杆菌CGMCC No. 4926抑菌能力的验证将LB固体培养基融化，冷却至45°C。加入过夜培养的E. coli K88、K99和金黄色葡萄球菌(每毫升培养基加入1微升菌液)，震荡混勻，倒入无菌平板，水平凝固，在每个琼脂平板上轻轻放置4只牛津杯，其间距应相等。每只牛津杯中加入50 μ L约氏乳杆菌菌液， 盖好皿盖，小心移至37°C培养箱，平皿正放静置培养。培养20h后，打开皿盖，移去牛津杯， 用卡尺测量抑菌圈直径(结果见表1)。表1抑菌圈的测定
本发明属于微生态制剂技术领域，具体涉及一种约氏乳杆菌及其菌剂、应用和预混料。本发明中的约氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、短小芽孢杆菌具有很好的益生功能和抗逆性能，将上述三种菌联合使用制备成菌剂、制备成饲料添加剂及添加到预混料中，经饲养动物后，可显著提高断奶仔猪生产性能，降低仔猪腹泻率，提高经济效益。具有推广应用前景，并且为寻找抗生素替代品提供了理论与实践基础。