专利名称：微生物发酵生产低温β-半乳糖苷酶的方法^ -半乳糖苷酶(EC3. 2. I. 23)又称为乳糖酶，^ -D-半乳糖苷半乳糖水解酶，是一种无毒副作用的生物酶制剂。它能够在特定的条件下水解P-D-半乳糖苷键(￠-1,4-糖苷键)，将乳糖水解成a -D-葡萄糖和3 -D-半乳糖，同时乳糖酶具有转移半乳糖苷的作用，能把半乳糖连接到乳糖上，生成低聚半乳糖(李玉强等，食品添加剂，2001)。早期￠-半乳糖苷酶生产方法主要是从哺乳动物组织和一些植物中提取，存在生产成本高、纯度低、生产工艺复杂等问题(张莉，东北农业大学学报，2009);利用微生物发酵生产3 -半乳糖苷酶工艺比较简单、生产成本较低、纯度高(周春雷等，极地研究，2010)。目前国内对微生物发酵生产￠-半乳糖苷酶的研究集中于中、高温酶，主要是￠-半乳糖苷酶产生菌筛选、理化性质及酶分子特性的研究(刘文玉等，新疆农业科学，2007 ;李玉强等，食品添加剂，2001)，对低温￠-半乳糖苷酶的研究尚在起步阶段，产业化、规模化生产及应用还未见报道。与中、高温木聚糖酶相比，低温￠-半乳糖苷酶具有更松散、柔顺的分子结构，使其在自然条件下具有高酶活及高催化效率，从而提高底物利用率，降低能耗，缩短作用过程的时间；另外，低温P -半乳糖苷酶对热敏感，可通过温和的热处理使其变性失活，从而控制酶水解程度，使产品品质不受影响，这将有助于低温￠-半乳糖酶的推广和使用(李兴峰等，中国食品学报，2003)，这些优势都是中、高温￠-半乳糖苷酶所无法比拟的。利用低温￠-半乳糖苷酶在降低生产成本及降低能耗方面的巨大优势，可从根本上摆脱中、高温酶的加热、冷却设备和工艺，这将为人类摆脱生存和发展中所面临的诸如疾病、能源危机以及环境污染等困境提供现实的机遇。因此，微生物发酵生产低温￠-半乳糖苷酶具有广阔的开发潜力和应用前景。
本发明是提供一种微生物发酵生产低温P -半乳糖苷酶的方法，该方法主要是微生物经过低温驯化后，在10 16°c液体发酵生产低温￠-半乳糖苷酶，这种生产方法获得的低温￠-半乳糖苷酶粗酶液酶活可达115U/ml，如再经过分离和纯化可以得到不同浓度和纯度的酶制剂。添加该酶制剂只需在10 16°C催化就可明显提高原料的转化率。该酶制剂应用操作简单、方便、快捷、成本低，可以从根本上避免中温、高温酶的加热、冷却设备和工艺。本发明所述的一种微生物发酵生产低温P -半乳糖苷酶的方法具体包括以下步骤(I)将产生￠-半乳糖苷酶的微生物逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低温环境中生长良好；(2)按常规方法将低温驯化后的P -半乳糖苷酶产生菌在10 16°C逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(3)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的3 9%接种量接入液体发酵培养基中，在10 16°C培养72 144h时，即微生物发酵生产低温P -半乳糖苷酶结束；(4)将(3)的发酵液4，000 8，OOOrpm离心收集菌体，用蒸馏水洗涤数次之后离心收集沉淀；(5)将沉淀悬浮于缓冲液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm离心，收集到的上清为P-半乳糖苷酶粗酶液；(6)根据不同需要和使用对象不同，将(5)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。本发明中使用的菌种来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，初期活化和生长条件按菌种保藏单位提供的说明进行。0 -半乳糖苷酶产生菌(例如，CICC菌种编号10138或6046)，菌种先活化、低温驯化后，按本发明产酶条件发酵生产低温P -半乳糖苷酶，低温驯化后的菌株在4°C环境中可保存2个月，用10 25%甘油制成的菌悬液、在_80°C条件下可以长期保藏。(6)将(5)的发酵液4，000 8，OOOrpm离心收集菌体，用蒸馏水洗涤数次之后离心收集沉淀。(7)将沉淀悬浮于缓冲液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm离心，收集到的上清为￠-半乳糖苷酶粗酶液。(8)根据不同需要和使用对象不同，将(7)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。实施例二 (I)培养基制备①菌种活化培养基蛋白胨10. 0g，酵母膏15. 0g,NaCl 5. 0g，K2HPO4 2. 5g，蒸馏水I. 0L, pH 7. 2,121°C高压蒸汽灭菌 30min。②菌种低温驯化培养基乳糖5.0 15. 0g，蛋白胨8.0 12. 0g，酵母膏5. 0 15. OgjNaCl 4. 0 8. 0g，K2HPO4 2. 0 4. 5g，蒸馏水 I. 0L，pH 值自然，121°C高压蒸汽灭菌30mino③液体种子培养基蛋白胨8.0 12. 0g，酵母膏12.0 16. 0g，NaCl 4.0 7. 0g，K2HPO4 I. 5 3. 5g，琼脂15. 0 25. Og,自来水I. 0L，pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。④发酵产酶培养基乳糖15. 0 25. 0g，蛋白胨5. 0 15. 0g, NaCl 4. 0 7. Og,K2HPO4LO 3. 5g，自来水1.01，？11值自然，1211高压蒸汽灭菌30min。(2)将产生P -半乳糖苷酶的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；(3)将⑵活化好的菌种逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低温环境中生长良好；(4)按常规方法将低温驯化后的P -半乳糖苷酶产生菌在10 16°C培养24 36h而后按5 8%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(5)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的5 7%接种量接入50L液体发酵培养基中，在12 14°C培养96 120h时，即微生物发酵生产低温P -半乳糖苷酶结束；(6)将(5)的发酵液4，000 8，OOOrpm离心收集菌体，用蒸馏水洗涤数次之后离心收集沉淀。(7)将沉淀悬浮于缓冲液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm离心，收集到的上清为￠-半乳糖苷酶粗酶液。(8)根据不同需要和使用对象不同，将(7)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。实施例三(I)培养基制备①菌种活化培养基蛋白胨10. 0g，酵母膏15. 0g,NaCl 5. 0g，K2HPO4 2. 5g，蒸馏水I.0L, pH 7. 2,121°C高压蒸汽灭菌 30min。②菌种低温驯化培养基乳糖5.0 15. 0g，蛋白胨8.0 12. 0g，酵母膏5.0
15.0g, NaCl 4.0 8.0g，K2HP042. 0 4. 5g，蒸馏水 I. 0L, pH 值自然，121°C高压蒸汽灭菌30mino③液体种子培养基蛋白胨8.0 12. 0g，酵母膏12.0 16. 0g，NaCl 4.0 7. 0g，K2HPO4L 5 3. 5g，琼脂15. 0 25. Og,自来水I. 0L，pH值自然，121 °C高压蒸汽灭菌30min。④发酵产酶培养基乳糖15. 0 25. 0g，蛋白胨5. 0 15. 0g, NaCl 4. 0 7. Og,K2HPO4LO 3. 5g，自来水1.01，？11值自然，1211高压蒸汽灭菌30min。(2)将产生P -半乳糖苷酶的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；(3)将⑵活化好的菌种逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低温环境中生长良好；(4)按常规方法将低温驯化后的P -半乳糖苷酶产生菌在10 16°C培养24 36h而后按5 8%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(5)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的7 9%接种量接入100L液体 发酵培养基中，在14 16°C培养72 96h时，即微生物发酵生产低温￠-半乳糖苷酶结束；(6)将(5)的发酵液4，000 8，OOOrpm离心收集菌体，用蒸馏水洗涤数次之后离
心收集沉淀。(7)将沉淀悬浮于缓冲液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm离心，收集到的上清为￠-半乳糖苷酶粗酶液。(8)根据不同需要和使用对象不同，将(7)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。


本发明所述的一种微生物发酵生产低温β-半乳糖苷酶的方法是将产生β-半乳糖苷酶的微生物逐级低温驯化，使其在低温环境中生长良好；将低温驯化后的β-半乳糖苷酶产生菌在10～16℃逐级扩大培养，按发酵液体积的3～9％接种量接入液体发酵培养基中，在10～16℃培养72～144h时，即微生物发酵生产低温β-半乳糖苷酶结束；发酵液在4,000～8,000rpm离心收集菌体，数次洗涤后收集沉淀，悬浮于缓冲液中，并加石英砂研磨，10,000～14,000rpm离心收集上清即为粗酶液；根据不同需要和使用对象不同，可以将粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。