专利名称:二氟苯甲酰胺的制备方法本发明涉及一种2，6-二氟苯甲酰胺的制备方法。EP-A-133927(Nitto)揭示了在某种适当的微生物作用下一种腈化合物转化为相应的酰胺。这些微生物在光的照射下可提高它们的活性。所揭示的适宜的特殊类型的微生物是革兰氏阳性细菌(a)棒杆菌属;(b)诺卡氏菌属;(c)芽孢杆菌属;(d)芽孢不动菌属;(e)微球菌属;以及(f)短杆菌属。所揭示的主要用途是从丙烯腈产生丙烯酰胺和从氰基吡啶产生烟酸。尤其揭示了另外的转化为乙腈转化为乙酰胺，甲基丙烯腈转化为甲基丙烯酰胺，戊腈转化为戊酰胺，苄腈转化为苯甲酰胺，丙腈转化为丙酰胺，正丁腈转化为正丁酰胺，丙二腈转化为丙二酰胺，琥珀腈转化为琥珀酰胺，富马腈转化为富马酰胺，氯乙腈转化为氯乙酰胺以及β-羟丙腈转化为β-羟丙酰胺。D.B.Harper在他的《芳香腈化物的微生物代谢》一文中(“Microbial Metabolism of Aromatic Nitriles”，Biochem.J.(1977)165，309-319)描述了利用诺卡氏菌(rhodochrous group)NCIB11216的代谢，使苄腈生成苯甲酸，并描述了腈水解酶的分离和性质。317页表4揭示了利用各种取代苄腈酶进行水解的相对水解率。它说明了2位取代基的位阻对水解率有极大影响。因此2-氟苄腈水解率低于腈水解率的30%，而2-氯苄腈和2-甲基苄腈的水解率实际上为0，同时4-氟苄腈，4-氯苄腈和4-甲基苄腈的水解率比苄腈水解率显然要大得多。因此理所当然地可以预见，具有更大位阻的2，6-二取代苄腈可能完全不被酶水解。Harper确实发现2，6-二氯苄腈(除莠剂敌草腈)即使在高浓度下也不被水解。甚至3，5-二溴苄腈(除莠剂溴苯腈)在高浓度酶中也不被水解，尽管3-溴苄腈的水解率要高70%以上。Harper还记载了Verloop(Residue Rev43(1972)55-103)发现单邻位取代降低芳香族腈的碱性水解率而双邻位取代则完全抑制该过程。令人惊奇的是现在发现2，6-二氟苄腈可被微生物水解。因而，已经出乎意料地发现一种新的微生物能够以比苄腈本身更快的速度水解2，6-二氟苄腈。所以，根据本发明可提供一种2，6-二氟苯甲酰胺的制备方法，该方法包括使2，6-二氟苄腈受到一种适宜的水解微生物或其腈水解酶提取物的作用。
适宜的水解微生物可为具有腈水解酶活性的革兰氏阳性细菌棒杆菌属，诺卡氏菌属，芽孢杆菌属，芽孢不动菌属，微球菌属和短杆菌属。但最好的微生物是一种红球菌属的细菌。微生物本身就适用于制备，但如果需要的话，用已知方法从微生物中得到的腈水解酶提取物也可代用。
一种红球菌属细菌的优选样品是从Shell Haven Refinery，Stanford-le-Hope，Essex，England的污泥处理厂得到的一种土壤分离物，并根据有关微生物贮存的专利程序的国际公认的布达佩斯条约的规定已于1986年3月13日贮存于工业微生物国家保藏中心(NCIB)，Torrey Research Station，135Abbey Road，Aberdeen AB98DG，Scotland，登记注册号NCIB12218。这里所说的微生物就是“红球菌NCIB12218”。
这种新的微生物，红球菌NCIB12218，正如此后所详细描述的那样，能以比它水解苄腈本身更快的速率水解2，6-二氟苄腈。
根据本发明的方法，微生物最好是红球菌NC IB12218或其突变体，且红球菌NCIB12218使用方便。
本发明还包括红球菌NCIB12218及其突变体。
红球菌NCIB12218突变体可用已知方法繁殖分离和筛选。因此突变可以是用化学方法，例如，用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍引起的，也可以是用紫外线辐射的物理方法产生的。
本发明还包括用本发明方法制备的2，6-二氟苯甲酰胺以及利用这样制备的2，6-二氟苯甲酰胺再去制备杀虫化合物。
2，6-二氟苯甲酰胺已知是制备已知杀虫化合物的中间体，例如灭幼脲(diflubenzuzon)(见美国书第1，324，293号)。利用2，6-二氟苯甲酰胺作为杀虫活性化合物中间体的其它方法包括英国书第1，460，419号和EP-A-161019中所描述的方法。
用于本发明的微生物可在一适宜的已知生长培养基上生长，该培养基含有可同化的碳源(例如葡萄糖，乳糖或蔗糖)，可同化的氮源(例如硫酸铵，硝酸铵或氯化铵)，有机微量营养素源(例如酵母膏，麦芽膏，胨或肉膏)和无机微量营养素(例如磷酸盐，镁，钾，钙，锰，锌和/或铁盐)。
细菌生长通常在有氧或空气存在下，搅拌(例如振荡或搅动)，温度在20-37℃范围，pH为5-9范围内进行。可用已知方法收集培养的细胞，并按照本发明方法在使用之前，如果需要的话，可在琼脂斜面冷冻或冻干保存菌种。
实现本发明的方法很方便，其温度范围0-37℃，最好20-30℃下，pH范围6-9，最好7-8，并最好有光照。
红球菌NCIB12218具有下述特征并经NCIB鉴定试验在30℃下进行，除注明外生长在Oxoid CM3营养素琼脂培养基上。
细胞形态30℃下在Oxoid CM1营养肉汤+0.75%(重量)琼脂中培养5小时后，在630倍相差显微镜下细胞为小型、平行侧边，稍微弯曲，或呈弯棒状。一些细胞呈团块。
革兰氏阳性芽孢-游动性-菌落形态培养3天后，菌落呈圆形，规则，边缘光滑，表面平滑，不透明，低凸起，淡粉红色，直径约1mm。
在葡萄糖，胨，水，蔗糖培养基上培养37℃±微量45℃-过氧化氢酶+氧化酶，Kovacs-O-F葡萄糖 氧化的
“O-F葡萄糖”即用Hayward和Hodgkiss的(J.Gen.Microbiol.26(1961)133-140)氧化-发酵培养基生产的，并补充有1%(重量)过滤灭菌的D-葡萄糖，用红球菌NCIB12218接种的样品需要培养14天。
红球菌NCIB12218可方便地贮存在4℃营养琼脂斜面上，或在缓冲培养基中分离的细胞贮存在-15℃低温下。已经发现，细胞能在-15℃下贮存一个月而不丧失活性。
从下述实施例中可进一步了解本发明。
实施例1生长培养基按下列组分配制0.2g K2HPO40.2g Mg SO4.7H2O2.5mg Fe SO4.7H2O12.5mg Ca Cl2.2H2O2.5mg MnSO4.3H2O1.0g (NH4)2SO410g 葡萄糖5g 胨3g 酵母膏3g 麦芽膏上述组份溶于900ml水中，用盐酸调pH至7.2，再加水使溶液为1升。
50ml上述生长培养基装入250ml锥形瓶中，用红球菌NCIB12218接种并在30℃下于摇床上培养48小时。
离心收集细胞(在“Sorvall”(注册商标)离心机上，20，000rpm，15分钟)，用50mMpH8磷酸盐缓冲液洗涤，再离心并再悬浮于2.5ml缓冲液中。取出悬浮液的一小部分样品，用于检测其细胞干重。
一定量的悬浮液，经计算含有0.5mg干重红球菌NCIB12218，用上述缓冲液稀释至1ml。悬浮液保持在25℃并用一个60W钨灯在25cm处照射5分钟，然后加入1mg2，6-二氟苄基腈(DFBN)。加入DFBN之后连续照射，使混合液保持在25℃15分钟。随后取出样品用气相色谱(gc)分析DFBN和2，6-二氟苯甲酰胺(DFBAM)以检测反应程度。
用苄腈和2，6-二氯苄腈代替DFBN重复上述过程作为对比。结果列入表1表1底 物产 物产 率2，6-二氟苄腈 2，6-二氟苯甲酰胺 25.5g/g细胞/小时(0.178mol/g细胞/小时)苄腈 苯甲酰胺 15.6g/g细胞/小时(0.146mol/g细胞/小时)2，6-二氯苄腈 2，6-二氯苯甲酰胺 0.053g/g细胞/小时(3×10-4mol/g细胞/小时)
实施例2在400ml实施例1的生长培养基中接种红球菌NCIB12218并在30℃下培养48小时。
收集培养所得细胞并洗涤(方法同实施例1)，将440mg干重的细胞悬浮于2升磷酸盐缓冲液中(同实施例1)。
细胞悬浮液于一玻璃烧杯中在25℃搅拌(磁力搅拌)并用三盏60W钨灯距25cm处照射5分钟。加入75g DFBN，混合液在25℃，有光照条件下保持16小时。此时气相色谱法分析(gc)表明98.9%的DFBN转化为DFBAM。
DFBAM-形成就从溶液中结晶出来。可以直接回收这种晶体沉淀。若从乙酸乙酯中重结晶可得50.3g DFBAM晶体。反应混合物冷却和蒸发后，还可分离16g DFBAM。
实施例3将按实施例2方法制备和照射的50μl红球菌NCIB12218磷酸盐缓冲液悬浮液加入到含有5μl DFBN的1ml正庚烷溶液中。室温下继续照射并搅拌。结晶沉淀。一个半小时后再加入10μl DFBN。18小时后过滤出晶体。分析表明DFBN实际上完全转化为DFBAM。
实施例4按实施例1和2用磷酸盐缓冲液制备一红球菌NCIB12218细胞悬浮液。3.2ml该悬浮液在一玻璃烧杯中于25℃搅拌(磁力搅拌)并按实施例2所描述的照射5分钟。加入正庚烷至体积为50ml。在28℃温度下继续照射和搅拌，并加入3.24g DFBN。气液层析法分析表明，5小时后92%DFBN转化为DFBAM。


本发明提供了一种2，6-二氟苯甲酰胺的制备方法，该方法包括使2，6-二氟苄腈受到一种适宜的水解微生物或其腈水解酶提取物的作用；红球菌NCIB12218或其突变体适用于本方法。