专利名称：一种黑松体细胞胚胎发生和植株再生方法黑松(Pinus thunbergii)属裸子植物门，松柏纲,松杉目，松科,松属，常绿乔木, 高可达30m。喜光，耐干旱瘠薄，不耐水涝，不耐寒，适生于温暖湿润的海洋性气候区域，最宜在土层深厚、土质疏松，且含有腐殖质的砂质土壤生长。因其耐海雾，抗海风，也可在海滩盐土地方生长，生长快，寿命长。材质优良供建筑、家具用材。海滩、河滩可作造林树种，也是园林绿化树种，也可作盆景树种。黑松原产日本及朝鲜半岛东部沿海地区。我国山东、江苏、安徽等省普遍栽培。但当前黑松易感染松材线虫病造成大量死亡，且种苗繁殖技术无法满足大面积的黑松造林。通过植物组织培养快速繁殖植株再生，不仅是造林所需大量苗木的一个重要生产途径，也是生产优良无性系的捷径。针叶树组织培养研究始于上世纪50年代，由于再生难度大，研究进展缓慢。直到 80年代中后期，随着分子生物学研究的迅速发展以及林业生产对优质种苗的需求，才掀起了针叶树种组织培养再生植株研究的热潮。但从目前的研究进展看，针叶树种组织培养植株再生是植物组织培养中难度较大的一个领域。针叶树的组织培养包括器官发生和体细胞胚胎发生两种，其中体细胞胚胎发生是指单倍体或双倍体的体细胞在特定条件下，未经性细胞融合而通过与合子胚胎发生类似的途径发育出新个体的形态发生过程。通过离体培养可以从植物各种器官、组织以及细胞和原生质体中形成类似合子胚的结构，被称为不定胚或胚状体，经体细胞胚胎发生形成的胚状体称为体细胞胚。Gupta等(1993)认为，与器官发生相比，体细胞胚胎发生具有数量多、速度快、结构完整、再生率高等优点。国外针叶树种体细胞胚胎发生研究起步较早，Hakman等(1985)研究挪威云杉未成熟合子胚培养首次获得胚性组织及成熟体胚。在松属树种方面，1986年，Gupta以糖松(P. Iambertiana)成熟胚为外植体首次经体细胞胚胎发生途径获得了完整植株。 Taniguchi (2001)以抗松材线虫病黑松的未成熟胚为材料，建立了 11个黑松细胞系，但每培养皿成熟的体细胞胚平均为32个，体细胞胚萌发率为28%。Salajova等(2005)以欧洲黑松未成熟的合子胚为外植体，胚性愈伤组织诱导率为5. 54%，体细胞胚萌发率最高为 47. 86%。在国内，1988年中科院植物所郭仲琢等人首次研究报道了云杉属青杆体细胞胚胎发生。黄健秋等(1995)以云南松成熟胚为外植体的胚性愈伤组织诱导率最高可达35.8%， 并获得了再生植株。申晓辉等(2005)以红松5个家系未成熟合子胚为材料，胚性愈伤组织平均诱导率为11.72%。王伟达等人(2009)以未成熟合子胚为外植体，建立杂种落叶松胚性愈伤组织诱导和植株再生体系，胚性愈伤组织诱导率最高为10%，再生植株的移栽成活率为41. 8%。
发明目的针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种黑松体细胞胚胎发生和植株再生方法，为黑松大规模无性繁殖育苗提供一种高效途径，解决当前造林种苗紧缺的问题。技术方案为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下一种黑松体细胞胚胎发生和植株再生方法，包括以下步骤(I)在诱导培养基上，温度23°C，暗培养，直至将无菌的未成熟黑松合子胚诱导出胚性愈伤组织，诱导培养基采用DCR基本培养基，在其中添加I 4mg/L2，4-D、0. 5 2mg/L 6-BA、30g/L麦芽糖、Ig/L肌醇、450mg/L谷氨酰胺、500mg/L水解酪蛋白、250mg/LMES和6g/ L琼脂粉；(2)采用DCR基本培养基，在其中附加2mg/L 2，4_D、lmg/L 6-BA、15g/L麦芽糖，Ig/L肌醇、450mg/L谷氨酰胺、500mg/L水解酪蛋白、250mg/L MES和6g/L琼脂粉，对胚性愈伤组织进行维持与增殖培养，温度23°C，暗培养，每2 3周继代一次；(3)先采用DCR基本培养基，在其中附加I. 2g/L活性炭、15g/L麦芽糖、I g/L肌醇、 450mg/L谷氨酰胺、500mg/L水解酪蛋白、250mg/L MES和6g/L琼脂粉，23°C，暗培养7 10d，对步骤(2)的胚性愈伤组织进行预处理；再采用DCR基本培养基，在其中附加10 30mg/L 脱落酸、O 50g/L 聚乙二醇(6000)、60g/L 麦芽糖、250mg/L MES、450mg/L 谷氨酰胺、500mg/L水解酪蛋白、8g/L肌醇、8g/L琼脂粉和2g/L AC，温度23°C，暗培养65 75d， 对预处理后的胚性愈伤组织进行体细胞胚的成熟培养；(4)先采用DCR基本培养基，在其中附加2g/L AC、8g/L琼脂粉和20g/L麦芽糖， 温度23°C，先暗培养5 7d，再光照度20001x及16/8小时的光/暗培养13 15d，对步骤(3)的成熟体细胞胚进行萌发培养；然后采用WPM基本培养基，在其中附加I. Omg/L IBA、O.2mg/L NAA、15g/L蔗糖、O. I g/L肌醇和6g/L琼脂粉，光照度20001x及16/8小时的光/ 暗培养I个月，进行体细胞胚植株再生；(5)采用WPM基本培养基，在其中附加珍珠岩、O. I g/L肌醇和15g/L蔗糖，光照培养，对再生植株进行壮苗I个月以上；(6)采用体积比为I : I : I珍珠岩、土和河沙为基质，对再生植株进行移栽。步骤(I)中，无菌的黑松未成熟合子胚制备方法为将黑松球果的珠鳞剥离后取出种子，放入灭菌的小三角瓶中，在超净工作台上用无菌纱布包好，先用75%乙醇表面消毒 30s,再用O. I %升萊灭菌4min,无菌水冲洗4次后用无菌滤纸吸去纱布表面的水分,最后用两把镊子剥取雌配子体，水平放置于诱导培养基上。步骤(I)中，诱导培养时间为7 9周。步骤(I)中，胚性愈伤组织诱导的最佳配方为DCR培养基+4mg/L2，4-D+2mg/ L6-BA+30g/L 麦芽糖。步骤(2)中，胚性愈伤组织稳定增殖继代次数为5次以上。步骤(3)中，对胚性愈伤组织进行体细胞胚成熟培养的最佳配方为DCR培养基 +30mg/L ABA+25g/L PEG+60g/L 麦芽糖。步骤(6)中，移栽的再生植株的根长不小于2cm。有益效果与现有的黑松器官发生继代培养方法相比，本发明的黑松体细胞胚胎发生和植株再生方法优点包括繁殖率高,每培养皿成熟的体细胞胚达144 216个，体细胞胚的萌发率为63. 8%、植株转化率为43. 5%。体细胞胚成熟阶段仅需经历70d左右，这样每年可以获得大量的体胚苗，优于黑松器官发生继代培养方法。因此，本发明为黑松体细胞胚胎发生与再生植株工厂化奠定基础，具有较好的实用性，能够产生很好的经济效益和社会效应。图I是诱导初期珠孔端伸出粘性物质示意图；图2是诱导后期珠孔周围块状物质示意图；图3是胚性愈伤组织示意图；图4是非胚性愈伤组织示意图；图5是成熟的体细胞胚示意图；图6是萌发的体细胞胚示意图；图7是体细胞胚再生植株示意图；图8是壮苗阶段的体细胞胚再生植株示意图；图9是移栽后的体细胞胚再生植株示意图。

5组织有两种状态一种为胚性愈伤组织，白色、透明的具有粘性，如图3所示；另一种为非胚性愈伤组织，黄色或褐色不透明，结构紧实没有粘性，如图4所示。诱导培养基采用DCR基本培养基，在其中附加4mg/L 2，4-D、2mg/L 6_BA、30g/L麦芽糖、lg/L肌醇、450mg/L谷氨酰胺、500mg/L水解酪蛋白、250mg/L MES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)和6g/L琼脂粉，ρΗ5· 8， 121 °C高温高压灭菌20min。胚性愈伤组织的维持与增殖阶段将诱导的胚性愈伤组织转接在维持与增殖的培养基上，培养温度23°C，暗培养，每2-3周继代一次，前3次继代，胚性愈伤组织增殖速度很慢，到第5次继代胚性愈伤组织增殖速度开始加快，此后进入稳定增殖状态。胚性愈伤组织的维持与增殖培养基采用DCR基本培养基，附加2mg/L 2，4_D、lmg/L 6-BA, 15g/L麦芽糖、 lg/L肌醇、450mg/L谷氨酰胺、500mg/L水解酪蛋白、250mg/L MES和6g/L琼脂粉，pH5. 8， 121 °C高温高压灭菌20min。体细胞胚的成熟阶段首先将维持与增殖阶段的胚性愈伤组织转入预处理培养基中进行预处理，培养温度23°C，暗培养7 IOd ;再挑取预处理培养基中生长良好的胚性愈伤组织于20mL不含激素的DCR液体培养基中，剧烈震荡形成良好的悬浮液，然后用ImL移液枪吸取悬浮液分散在放有抽纸的无菌滤纸上，水分吸干后，再将带有培养物的滤纸放在成熟培养基上，培养温度23°C，暗培养65 75d形成成熟的体细胞胚，如图5所示。预处理培养基采用DCR基本培养基，附加I. 2g/L活性炭、15g/L麦芽糖、18/1肌醇、4501!^/1谷氨酰胺、500mg/L水解酪蛋白、250mg/L MES和6g/L琼脂粉，pH5. 8，121°C高温高压灭菌20min。 成熟培养基采用DCR基本培养基，附加30mg/L ABA, 25g/L PEG，60g/L麦芽糖，250mg/L MES, 450mg/L谷氨酰胺，500mg/L水解酪蛋白，8g/L肌醇，8g/L琼脂粉，2g/LAC，pH5. 8，121 °C高温高压灭菌20min。体细胞胚的萌发与植株再生阶段将诱导的成熟体细胞胚水平放置于萌发培养基上，培养温度23°C，先暗培养5 7d，再光照度20001x及16/8小时的光/暗培养13 15d。 暗培养5d的体胚子叶由黄色变为淡绿色，光照后子叶墨绿色，逐渐张开；胚轴伸长；基部有微小红色根尖，如图6所示，统计的体细胞胚萌发率为63. 8%。然后进行萌发的体细胞胚植株再生，将萌发的体细胞胚转入植株再生培养基中，光照度20001x及16/8小时的光/暗培养I个月后长出初生针叶，嫩白色根长Icm左右，如图7，统计的植株转化率为43. 5%。萌发培养基采用DCR基本培养基，附加2g/L AC、20g/L麦芽糖和8g/L琼脂粉，pH5. 8，121°C高温高压灭菌20min。植株再生培养基采用WPM基本培养基，附加I. Omg/L IBA、0. 2mg/LNAA、 15g/L鹿糖、0. lg/L肌醇和6g/L琼脂粉，pH5. 8,121 °C高温高压灭菌20min。再生植株的壮苗阶段将再生植株转入珍珠岩培养基中，光照度20001x及16/8小时的光/暗培养2个月后，再生植株根长2cm左右，如图8所示。珍珠岩培养基采用WPM基本培养基，附加珍珠岩、15g/L蔗糖和O. lg/L肌醇，加入珍珠岩，可形成空隙，培养液充在珍珠岩中，有利于根吸收营养，促进植株生长和根的进一步伸长。再生植株的移栽阶段待壮苗培养的体细胞胚再生植株根长2cm以上进行移栽， 移栽前3d逐渐将封口膜揭开，使幼苗适应外界的环境，移栽时将幼苗根部的珍珠岩小心洗掉，移栽在珍珠岩、土和河沙构成体积比I : I : I的基质中，如图9所示。移苗一个月内注意保持空气湿度、温度和基质湿度的稳定，移栽I个月的再生植株成活率为50%。实施例2
黑松体细胞胚胎发生和植株再生方法同实施例I。其中，在胚性愈伤组织的诱导阶段，培养基中的2，4_D浓度采用lmg/L、2mg/L和 4mg/L 3个梯度进行试验,6-BA米用O. 5mg/L、lmg/L和2mg/L 3个梯度进行试验,本试验9 个处理中，从诱导的结果上看，仅在4mg/L 2，4-D+2mg/L 6-BA的DCR培养基上诱导出2块胚性愈伤组织，胚性愈伤组织诱导率为3. 33%。因此，该阶段诱导黑松胚性愈伤组织的最佳配方是=DCR 培养基 +4mg/L2，4-D+2mg/L6-BA+30g/L 麦芽糖。其中，在体细胞胚的成熟阶段，进行体细胞胚的成熟培养时，培养基中ABA的浓度采用 10mg/L、25mg/L 和 30mg/L 3 个梯度进行试验，PEG6000 采用 0g/L、25g/L 和 50g/L 3 个梯度进行试验，从结果上看，30mg/L ABA+25g/L PEG组合获得的体细胞胚数量最多，每克愈伤组织体细胞胚数达72个，其次是25mg/LABA+50g/L PEG组合每克愈伤组织体细胞胚数达 51个，I Omg/L ABA+50g/LPEG组合每克愈伤组织体细胞胚数达43个，没有PEG处理中每克愈伤组织也获得了 9个体细胞胚，但ABA和PEG组合更有利于提高体胚的数量。因此，黑松成熟体细胞胚的最佳配方为DCR培养基+30mg/L ABA+25g/L PEG+60g/L麦芽糖，每克愈伤组织体细胞胚数达72个。实施例3本发明的黑松体细胞胚胎发生和植株再生方法，繁殖率高，胚性愈伤组织增殖阶段每2 3周继代一次，胚性愈伤组织增殖很快，每块胚性愈伤组织增殖一次后变为2 3 块(I块胚性愈伤组织约Ig)，取预处理增殖的I块胚性愈伤组织于20mL不含激素DCR悬浮液中，用移液枪吸取2mL悬浮液分散在放有抽纸的无菌滤纸上，水分吸干后，再将滤纸放在成熟培养基上，每培养皿成熟培养基上形成2 3块胚性愈伤组织，本试验每块胚性愈伤组织形成体细胞胚数量达72个，这样每培养皿成熟的体细胞胚达144 216个。因此，预处理增殖的I块胚性愈伤组织经过移液枪吸取悬浮液后形成10培养皿，成熟培养后体细胞胚数量为1440 2160个，本试验体细胞胚的萌发率为63. 8%、植株转化率为43. 5%和I个月的再生植株成活率为50%。体细胞胚成熟阶段要经历70d左右，这样每年可以获得数量巨大的体胚苗，而黑松器官发生继代周期为3个月，每个种子培养的无菌苗每年只能增殖256 个组培苗，生根率为23.3%，因此本发明的优势相当明显。另外体细胞胚具有胚根和胚芽两极性，成苗率较高，而黑松器官发生组培苗生根困难，生根率低。此外，黑松体细胞胚的萌发与植株再生分开进行，有利于提高体细胞胚的萌发率和植株转化率，最后又用珍珠岩培养基来壮苗，珍珠岩疏松，有助于体胚苗根系的伸长。本发明为黑松体细胞胚发生与再生植株工厂化奠定基础，具有很好的实用性。


本发明公开了一种黑松体细胞胚胎发生和植株再生方法，该方法采用未成熟合子胚诱导出胚性愈伤组织，经过维持与增殖、成熟阶段获得体细胞胚，再经过萌发阶段获得再生植株，最后进行再生植株的移栽。本发明的黑松体细胞胚胎发生和植株再生方法，繁殖率高，在成熟培养基上培养70d后，平均每培养皿成熟的体细胞胚达144~216个，体细胞胚萌发率为63.8%，植株转化率为43.5%。这样每年可以获得大量的体胚苗，为黑松体细胞胚发生与再生植株工厂化奠定基础，解决当前造林种苗紧缺的问题，具有很好的实用性。