专利名称：诱导龙血树产生血竭的2株真菌的制作方法血竭，又叫“云南红药”，在我国中医药学中的记载和应用已有1500余年，历代医学家推崇备至。血竭原名骐鱗竭，始载于《雷公炮炙论》玉石部，《本草述均元》称其有“夺命 之功”；《新修本草》首载其功效为“去五脏邪气、带下、心痛、破积血、金创生肉”;其后《海药本草》指出血竭“主打伤折损”。我国药学鼻祖李时珍在《本草纲目》中誉之为“活血圣药”，更概括其功效为“散滞血诸痛”。在古代医学文献上血竭功效一直被认为是“化瘀止血止痛、生肌敛疮”。由于血竭临床效果显著，需求量大，导致其供应紧张，价格攀升，加快生产血竭显得非常迫切。目前,我国国产血竭的来源植物主要是剑叶龙血树(Dracaena cochinchinensis)和小花龙血树(Dracaena cambodiana)。龙血树是小乔木状植物，莖高3 7m,主要分布在北纬21. 5 23. 6°地区，以东南亚的柬埔寨、老挝、越南等国为主要产地。国内以云南思茅、西双版纳等地为主产区，广西、海南等地也有部分资源，主要分布在云南南部和广西南部海拔250 1700m的热带、亚热带石灰岩山地。由于血竭的供求矛盾突出，其基源植物剑叶龙血树和小花龙血树均已被列为国家三级保护的濒危物种。在自然条件下，龙血树生长十年甚至几十年，有伤口和虫蛀等现象发生的部位，才能产生血竭。血竭产生的周期长，产量低，是影响医药使用的主要问题。目前，血竭的生产主要以砍伤树木获取为主。近年来，也有一些新方法能产生血竭的报道，如，培养植物组织细胞生产血竭的方法，这一方法主要是在实验室条件下，以龙血树的愈伤组织生产血竭；也有报道用激素和化学物质诱导龙血树生产血竭。目前这些方法均不够成熟，无法实现大规模的生产应用。通过对植物与微生物相互作用的研究发现，龙血树与某些真菌相互作用可以产生血竭。发现具有这种作用的活性菌株，并利用它们高效、快速地生产血竭，是提高国产血竭产量，满足医药市场对血竭日益增长的需求的重要途径，也是实现龙血树野生资源保护和可持续利用的有效途径之一。
本发明的目的在于提供2株能够诱导龙血树生产血竭的真菌，将它们接种于龙血树的树干或枝干上，能够使龙血树产生与血竭理化性质相似的红色物质。本发明提供的2株真菌，经鉴定分别为保藏编号为CGMCC No. 4452的赤霉(Gibberella sp.)真菌BJDC-1 和保藏编号为 CGMCC No. 4454 的暗球腔菌(Phaeosphaeriasp.)真菌BJDC-5。这2株真菌于2010年12月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。菌株的保藏和存活证 明见附件。2株真菌的培养特性分别为BJDC-I :在PDA培养基上，菌落白色，菌丝呈条纹辐射状，毛状边缘，气生菌丝不发达，不容易挑取菌丝，无明显可见的分泌物存在。菌落背面乳黄色。用O. 65cm直径的菌饼接种，生长5天，菌落直径5. 25cm。菌丝有粗、细两种，均有隔。细菌丝淡色，直径大约3 μ m ;粗菌丝透明，直径大约6 μ m。产孢结构明显，分生孢子梗为瓶梗状，弯曲明显，顶端膨大。孢子丰富，为淡色，弯曲状，有三种形态第一种弯曲、无隔，长约8μπι;第二种略弯曲、无隔，长约20 μ m,第二种具一隔，长约20 μ m。BJDC-5 :在PDA培养基上，菌落白色，略泛土黄色，短毛致密均匀，毡状，气生菌丝不发达，质地硬，不容易挑取，无明显可见的分泌物存在。菌落背面灰黑色。用直径为O. 65cm的菌饼接菌，生长5天，菌落直径2. 90cm。菌丝有隔，直径4-5 μ m，易断裂。隔连接处两端的菌丝多膨大，有鼓槌状短节。隔与隔之间为淡色与透明相间。不产生分生孢子。2株真菌用荞麦皮培养基培养。荞麦皮培养基组成为荞麦皮、麦麸、玉米粉、硫酸钙和糖类成分；其中糖类成分为葡萄糖、或蔗糖、或葡萄糖和蔗糖2种糖类成分以任意比例混合的混合物。荞麦皮培养基的配制方法为(I)硫酸钙和糖类成分用水配成混悬液，硫酸钙的加入量按重量百分比计算为O.5% -I. 5%，糖类成分的加入量按重量百分比计算为O. 5% -I. 5%。硫酸钙微溶于水，糖类成分能溶于水。由于它们在配方中的用量较少，采用混悬液的方式加入，可以保证它们在培养基中均匀分散。(2)荞麦皮、麦麸和玉米粉三种干料按体积比为1-5 1-3 O. 05-0. I的比例混合均匀。(3)将含有硫酸钙和糖类成分的混悬液搅拌均匀，加入荞麦皮、麦麸和玉米粉混合的干料中，搅拌，使混合均匀。干料和混悬液的重量(g)与体积(mL)比为I : O. 8-1. 6。培养基PH自然，测量值一般在6. 5-8. O之间。试管或罐头瓶等玻璃器皿，容器装量20-60%，121。。灭菌 120-180 分钟。2株真菌的培养方法将2株真菌分别自低温保藏的斜面试管菌种活化后，转接于PDA培养基的平皿中，恒温25°C暗培养。培养至菌落直径大约3cm左右时，挑取边缘菌块，转接于装有上述固体培养基的罐头瓶中，20-28°C暗培养。待菌丝生长充满培养基约一半时，将培养的固体菌种转接于新的、相同的培养基中，于相同条件下培养。菌丝长满培养基后的菌种可以用于接种龙血树,诱导龙血树产生血竭；也可以作为大规模培养真菌的种子菌种使用。将2株真菌的固体培养物接种于龙血树的树干或枝干上，能够诱导龙血树产生血竭。接种的时候，菌株可以单独使用，也可以2株同时使用。当使用混合菌种接种时，先将单独培养的各菌株的固体培养物以所需要的比例混合均匀，之后进行接种使用。(I)固体培养基的制作配制蔗糖和硫酸钙浓度均为O. 5%的混悬液；将荞麦皮、麦麸和玉米粉这3种材料按体积比为I : I : O. 05的比例混合均匀；每公斤干料中加入混悬液I. 2升，搅拌均匀。培养基分装后，于121°C灭菌165分钟。(2)菌种的准备挑取经PDA平板活化的BJDC-I菌落边缘的菌种块，接种到装有上述固体基质的罐头瓶中，于23-25°C暗培养15天。将生长旺盛的真菌菌丝块再一次转接到装有荞麦皮培养基的罐头瓶中，于23-25°C暗培养20天，待用。(3)接种孔的准备选取树龄10年，胸径> IOcm的小花龙血树，在树干或枝干上按照左右间隔5cm，上下间隔8cm的距离，用电钻或手工打孔器打孔，孔口略向上，直径为lcm，深约3cm。如果接种前孔周围植物组织比较干燥，用无菌水喷洒孔壁，使其保持湿润。(4)接菌将真菌YNDC-I的培养物用无菌镊子或小勺接入接种孔中，接种量约为 3克，轻轻按压，保证菌种与开孔周围植物组织的接触，但不要将接种物压得过于致密。用少量无菌棉覆盖接种孔口，再用麻绳缠绕固定。以上处理重复3次。结果2个月之后观察，在接种部位及其周围有深红色物质形成，表面闪光，粘性。真菌BJDC-I诱导小花龙血树树干或枝干变色，形成深红色物质的范围(左右宽度，上下宽度)数据见表I。从以上处理的接种部位取下木材，放入75%以上浓度的酒精中，可以使酒精溶液变成鲜红色。将颜色变化部位取出，阴干，称重，数据见表I。实施例2利用BJDC-5号真菌促进龙血树生产血竭。(I)固体培养基的制作配制葡萄糖浓度I. 5 %，硫酸钙浓度I %的混悬液；将荞麦皮、麦麸和玉米粉这3种材料按体积比为5 3 O. I的比例混合均匀；每公斤干料中加入混悬液I. 6升，搅拌均匀。培养基分装后，于121°C灭菌180分钟。(2)菌种的准备挑取经PDA平板活化的BJDC-5菌落边缘的菌种块，接种到装有上述固体基质的罐头瓶中，于20-23°C暗培养15天。将生长旺盛的真菌菌丝块再一次转接到装有荞麦皮培养基的罐头瓶中，于20-23°C暗培养40天，待用。(3)接种孔的准备选取树龄10年，胸径> IOcm的剑叶龙血树，在树干或枝干上按照左右间隔8cm，上下间隔15cm的距离，用电钻或手工打孔器打孔，孔口略向上，直径为I. 5cm,深约5cm。如果接种前孔周围植物组织比较干燥，用无菌水喷洒孔壁，使其保持湿润。(4)接菌将真菌BJDC-5的培养物用无菌镊子或小勺接入接种孔中，接种量约为5克，轻轻按压，保证菌种与开孔周围植物组织的接触，但不要将接种物压得过于致密。用少量无菌棉覆盖接种孔口，再用麻绳缠绕固定。以上处理重复3次。结果2个月之后观察，在接种部位及其周围有深红色物质形成，表面闪光，粘性。真菌BJDC-5诱导剑叶龙血树树干或枝干变色，形成深红色物质的范围(左右宽度，上下宽度)数据见表I。从以上处理的接种部位周围取下木材放入75%以上浓度的酒精中，可以使酒精溶液变成鲜红色。将颜色变化部位取出，阴干，称重，数据见表I。比较例I(I)固体培养基的制作配制葡萄糖和蔗糖浓度均为O. 6%，硫酸钙浓度为I. 5%的混悬液；将荞麦皮、麦麸和玉米粉这3种材料按体积比为3 3 O. I的比例混合均匀；每公斤干料中加入混悬液I. O升，搅拌均匀。培养基分装后，于121°C灭菌120分钟。(2)接种孔的准备选取树龄8年以上，胸径彡IOcm的小花龙血树，在树干或枝干上按照左右间隔5cm，上下间隔8cm的距离，用电钻或手工打孔器打孔，孔口略向上，直径为I. 2cm,深约4cm。如果接种前孔周围植物组织比较干燥，用无菌水喷洒孔壁，使其保持湿润。(3)空白处理用少量无菌棉覆盖接种孔口，再用麻绳缠绕固定。以上处理重复3次。(4)阴性对照处理将灭菌后的荞麦皮培养基用无菌镊子或小勺接入接种孔中，接种量约为3克，轻轻按压，保证培养基与开孔周围植物组织的接触，但不要将接种物压得过于致密。用少量无菌棉覆盖接种孔口，再用麻绳缠绕固定。以上处理重复3次。结果2个月之后观察，空白处理的接种孔周围变化很小，仅有很小范围的颜色变化，与周围组织颜色相比，呈浅红色；阴性对照处理的接种孔周围变化也很小，仅有很小范围的颜色变化，颜色为浅红。从以上2种处理的接种部位周围取下木材放入75%以上浓度的酒精中，可以使酒精溶液变成浅红色。真菌诱导扩散的范围(左右和上下宽度)数据见表I。将颜色变化部位取出，阴干，称重，数据见表I。比较例2(I)固体培养基的制作配制葡萄糖浓度为O. 5%、蔗糖浓度为1%，硫酸钙浓度为I. 5%的混悬液；将荞麦皮、麦麸和玉米粉这3种材料按体积比为3 2 O. I的比例混合均匀；每公斤干料中加入混悬液O. 8升，搅拌均匀。培养基分装后，于121°C灭菌150分钟。(2)菌种的准备分别挑取经PDA平板活化的真菌BJDC-I和BJDC-5的菌落边缘的菌种块，接种到装有上述固体基质的罐头瓶中，于26-28°C暗培养至菌丝生长充满培养基质的2/3-5/4，待用。(3)接种孔的准备选取树龄8年以上，胸径彡IOcm的剑叶龙血树，在树干或枝干上按照左右间隔8cm，上下间隔IOcm的距离，用电钻或手工打孔器打孔，孔口略向上，直径为I. 5cm，深约5cm。如果接种前孔周围植物组织比较干燥，用无菌水喷洒孔壁，使其保持湿润。(4)接菌将真菌BJDC-I和BJDC-5的培养物按体积比约为O. 5 : I的比例混合均匀；用无菌镊子或小勺将上述混合菌种接入接种孔中，接种量约为3-4克，轻轻按压，保证菌种与开孔周围植物组织的接触，但不要将接种物压得过于致密。用少量无菌棉覆盖接种孔口，再用麻绳缠绕固定。重复3次。结果2个月之后观察，在接种部位及 其周围有深红色物质形成，表面闪光，粘性。2种真菌混合物诱导龙血树树干或枝干变色，形成深红色物质的范围(左右宽度，上下宽度)数据见表I。从以上处理的接种部位周围取下木材放入75%以上浓度的酒精中，可以使酒精溶液变成鲜红色。将颜色变化部位取出，阴干，称重，数据见表I。表2.龙血树接种2种真菌后颜色变化范围及变化范围木材的采收重量

本发明公开了2株真菌，它们分别是保藏编号为CGMCC No.4452的赤霉属(Gibberellasp.)真菌BJDC-1和保藏编号为CGMCC No.4454的暗球腔菌属(Phaeosphaeria sp.)真菌BJDC-5。将它们接种到龙血树的树干或枝干上，能诱导龙血树产生血竭，在提高中药血竭产量，保护龙血树野生资源方面有广阔的应用前景。