专利名称：超滤提取辣根过氧化物酶的方法辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase, HRP, E. C. I. 11. I. 7)是由酶蛋白和铁卟啉结合而成的一种糖蛋白，该酶由多个同功酶组成，分子量为40kDa，等电点为PH3. 0-9. O。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别在403nm和275nm，所以人们通常采用RZ值卿OD403nm /OD275nm的比值)来表示该酶的纯度，RZ值越大，纯度越高。HRP是最重要的医疗诊断用酶之一(J. Chromat. B 2004，803:237-241 )，该酶不但用于多个生化检测项目，还广泛运用于免疫类试剂盒。除此之外，HRP还可用于工业废水的脱色(Chem. Technol. Biotechnol. 2009，84:126 - 132),过氧化物的去除以及含酹污水的处理(Biotechnol. Bioprocess Eng. 2006，11:462 - 465)等。在自然界中，辣根是HRP含量最高的植物，因此也成为生产HRP最具吸引力的原料。目前，从辣根中分离提取HRP的主要方法有双水相萃取技术(Appl. Biochem.Biotechnol. 1995, 53:147-154)、反胶束萃取技术(Enzyme Microb. Technol.1996，18:332-339)、电泳技术(J. Biol. Chem. 1966，241:2166-2172)及层析技术(J.Membr. Sci. 2003，211:101-111)等。然而这些技术均存在一定的缺陷，其中，双水相萃取技术和反胶束萃取技术获得的产品纯度较低，且容易引起HRP的失活和变性；电泳技术和层析技术的成本昂贵，且难于工业放大。膜分离法通常指利用天然或人工合成的薄膜，以外界能量或化学位差为推动力，对双组份或多组分的混合物进行分离、提纯和富集的方法。膜分离技术是20世纪50年代发展起来的一项高效分离技术，与传统的分离技术相比，具有分离效率高、能耗低、可连续操作、易于放大、无污染等优点。超滤膜是指膜孔径在I-IOOnm之间，具有不对称结构的复合膜。由于其孔径尺寸与生物大分子的尺寸较为接近，故可用于生物大分子如蛋白质等的分离与纯化(FoodChem. 2010, 122: 747-752)。超滤分离是分子级的，即可截留溶液中的大分子溶质，同时使小分子溶质透过；有时也可以通过调节溶液中微环境，使预分离的蛋白质分子和膜表面带有不同性质的电荷，再通过蛋白质分子之间、蛋白质与膜表面之间的静电作用，达到分离的目的。目前，在生物加工领域，超滤技术常用于蛋白质的纯化与浓缩，在工业上已有较多应用，但由于自然体系中蛋白质种类复杂，且存在较多的同工酶，使用超滤法直接分离得到高纯度的功能蛋白质的实例极少，且这方面的研究仍处于实验室规模(J. Membr. Sci.2010，352:231-238)
针对现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种操作简单、易于放大、产品纯度高的辣根过氧化物酶的超滤提取方法。本发明的技术方主要包括以下步骤 (1)、将辣根破碎、浸提、离心得到辣根过氧化物酶粗提液； (2)、将辣根过氧化物酶粗提液用截留分子量为70kDa-100kDa的超滤膜进行超滤分离，得到辣根过氧化物酶超滤液； (3)、将辣根过氧化物酶超滤液用截留分子量为l-30kDa的超滤膜进行超滤浓缩，得到辣根过氧化物酶浓缩液； (4 )、将辣根过氧化物酶浓缩液脱水得到辣根过氧化物酶。为了达到最佳的提取效果，还包括以下技术方案 步骤(I)中的浸提为将破碎后辣根的在水或TriS-HCl缓冲溶液下匀浆，缓冲液的浓度可以选择不大于5M，并调节ph为4-11，离子强度不大于1M，然后在0-10°C搅拌3小时；步骤(I)中的最佳离心温度为4°C，离心力大于5000g，离心时间大于10分钟。步骤(2)和(3)中的过氧化物酶粗提液和超滤液在超滤处理前调节ph为4-11，离子强度不超过1M。步骤(4 )中的脱水为冷冻干燥。在本发明的步骤(2)和(3)中超滤膜的组件形式选择为中空纤维素膜、平板膜或卷式膜，超滤效果较好。本发明具有操作简单、分离浓缩同步进行、产品回收率高、产品纯度达85%以上、并利于工业放大等特点，具有良好的应用前景。

从辣根中提取辣根过氧化物酶的方法，步骤
(1)取I.Okg新鲜的辣根，用蒸馏水洗净，切成5mm左右的小块，在I.5L IOOmM的Tris-HCl缓冲溶液下匀浆，用IM的HCl调匀浆液pH值为5. O ；
(2)将步骤(I)得到的匀浆液在4°C下充分搅拌8小时，离心取上清液I.21L。离心条件为4°C,8000g,25min ；
(3)利用截留分子量为70kDa的平板式超滤膜(聚醚砜材质，O.09m2)对步骤(2)获得的I. 21L上清液进行超滤分离，获得滤出液O. 96L。分离条件进口压力O. 3MPa，出口压力O. 2MPa，流速 I. 4L/h ；
(4)利用截留分子量为30kDa的平板式超滤膜(聚醚砜材质，O.09m2)对步骤(3)获得的O. 96L滤出液进行超滤浓缩，获得截留液O. 24L。分离条件进口压力O. 4MPa，出口压力O. 5MPa，流速 I. lL/h ；
(5)将步骤(4)获得O.24L截留液冷冻干燥后，得HRP1. 63g，经SDS-PAGE电泳分析，HRP纯度为91%。实施例2
从辣根中提取辣根过氧化物酶的方法，步骤
(I)取I. 5kg新鲜的辣根，用蒸馏水洗净，切成5mm左右的小块，在2. 5L 2OmM的Tris-HCl缓冲溶液下匀浆，用IM的HCl调匀浆液pH值为5. 5 ;(2)将步骤(I)得到的匀浆液在4°C下充分搅拌8小时，离心取上清液2.27L。离心条件为4°C,8000g,20min ；
(3)利用截留分子量为IOOkDa的平板式超滤膜(聚醚砜材质，O.09m2)对步骤(2)获得的2. 27L上清液进行超滤分离，获得滤出液I. 84L。分离条件进口压力O. 3MPa，出口压力O. 2MPa，流速 I. 8L/h ；
(4)利用截留分子量为30kDa的平板式超滤膜(聚醚砜材质，O.09m2)对步骤(3)获得的I. 84L滤出液进行超滤浓缩，获得截留液O. 25L。分离条件进口压力O. 4MPa，出口压力O. 5MPa，流速 I. 4L/h ；
(5)将步骤(4)获得O.25L截留液冷冻干燥后，得HRP2. 52g，经SDS-PAGE电泳分析，HRP纯度为89. 3%。实施例3
从辣根中提取辣根过氧化物酶的方法，步骤
(1)取I.Okg新鲜的辣根，用蒸馏水洗净，切成5mm左右的小块，在I. 5L水下匀浆，用IM的HCl调匀浆液pH值为4. O ;
(2)将步骤(I)得到的匀浆液在10°C下充分搅拌3小时，离心取上清液I.ISL0离心条件为4°C,5000g,30min ；
(3)利用截留分子量为70kDa的平板式超滤膜(聚醚砜材质，O.09m2)对步骤(2)获得的I. 18L上清液进行超滤分离，获得滤出液O. 94L。分离条件进口压力O. 3MPa，出口压力O. 2MPa，流速 I. 4L/h ；
(4)利用截留分子量为30kDa的平板式超滤膜(聚醚砜材质，O.09m2)对步骤(3)获得的O. 94L滤出液进行超滤浓缩，获得截留液O. 23L。分离条件进口压力O. 4MPa，出口压力
O.5MPa，流速 I. lL/h ；
(5)将步骤(4)获得O.23L截留液冷冻干燥后，得HRP1. 60g，经SDS-PAGE电泳分析，HRP纯度为88. 7%。实施例4
从辣根中提取辣根过氧化物酶的方法，步骤
(1)取I.Okg新鲜的辣根，用蒸馏水洗净，切成5_左右的小块，在1.5L水下匀浆，用氢氧化钠调匀衆液pH值为11 ；
(2)将步骤(I)得到的匀浆液在OV下充分搅拌3小时，离心取上清液I.15L。离心条件为4°C,6000g,30min ；
(3)利用截留分子量为70kDa的平板式超滤膜(聚醚砜材质，O.09m2)对步骤(2)获得的I. 15L上清液进行超滤分离，获得滤出液O. 93L。分离条件进口压力O. 3MPa，出口压力
O.2MPa，流速 I. 4L/h ；
(4)利用截留分子量为IkDa的平板式超滤膜(聚醚砜材质，O.09m2)对步骤(3)获得的O. 93L滤出液进行超滤浓缩，获得截留液O. 27L。分离条件进口压力O. 4MPa，出口压力
O.5MPa，流速 I. lL/h ；
(5)将步骤(4)获得O.23L截留液冷冻干燥后，得HRP1. 64g，经SDS-PAGE电泳分析，HRP纯度为88. 5%。 实施例1-4中步骤(3)和(4)中超滤膜的组件形式为中空纤维素膜、平板膜或卷式膜。本发明经操作条件改进及超滤膜 优化，也可用于分离和纯化其它过氧化物酶。


本发明属于生物分离工程与技术领域，具体是应用超滤技术从辣根中分离提取辣根过氧化物酶的方法。本发明的技术方主要包括以下步骤(1)、将辣根破碎、浸提、离心得到辣根过氧化物酶粗提液；(2)、将辣根过氧化物酶粗提液用截留分子量为70kDa-100kDa的超滤膜进行超滤分离，得到辣根过氧化物酶超滤液；(3)、将辣根过氧化物酶超滤液用截留分子量为1-30kDa的超滤膜进行超滤浓缩，得到辣根过氧化物酶浓缩液；(4)、将辣根过氧化物酶浓缩液脱水得到辣根过氧化物酶。本发明具有操作简单、分离浓缩同步进行、产品回收率高、产品纯度达85%以上、并利于工业放大等特点，具有良好的应用前景。