专利名称：通过发酵生产l-鸟氨酸的方法通过发酵生产L-鸟氨酸的方法背景技术已知L-鸟氨酸有关于肝功能的刺激作用并经常用作药剂配料和在运动营养中使用。目前通过多种方法制备L-鸟氨酸。一种方法是借助微生物的发酵制备。另一种方法是精氨酸的碱水解，例如用氢氧化钡(CN 1594282A)。另一种方法是通过固定具有精氨酸酶活性的微生物的精氨酸生物转化(KR589121B1)。从L-瓜氨酸制备L-鸟氨酸的方法在专利文献(JP 42007767B4)中也已有所描述。特征在于分泌L-鸟氨酸至培养基中的微生物在该文献中已有所描述。所述微生物的实例是棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、芽孢杆菌属 (Bacillus, JP 43010996B4、JP 57041912B)、埃希氏菌属(Escherichia, US 3668072A)、普罗威登斯菌属(Providencia, JP 03195494)或节杆菌属(Arthrobacter, US 3574061)的细菌。生产L-鸟氨酸的微生物特征常常在于对氨基酸L-精氨酸或L-瓜氨酸的营养缺陷(短杆菌、芽孢杆菌、棒状杆菌在EP 392708B1和KR 161147B1中有所描述，而埃希氏菌在US 366072A中有所描述)。另外，对2-噻唑-丙氨酸、磺胺脒或2-氟丙酮酸有抗性的微生物已有描述(日本开放出版号61119194)。EP 0393708B1描述了 L-鸟氨酸生产者特征在于对ornithole和霉酹酸的更低的抗性。所述特性也可以是组合的形式。通过从细胞被动扩散的方式的碱性氨基酸(例如L-赖氨酸、L-精氨酸和L-鸟氨酸)的释放是非常差的(Bellmann 等人(Microbiology 2001; 147:1765-74)) 对赖氨酸已通过实例的方式有很好的描述。Vrlijc等人(Journal of Bacteriology 1995; 177(14) : 4021-7)已研究多种输出缺乏的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)突变体。对于一个突变体，测量到174nML_赖氨酸的细胞内浓度，而在细胞外测量到只有0. 7mM的数值。Vrlijc 等人(Molecular Microbiology 1996;22(5):815-26 和 Journal ofMolecular Microbiology and Biotechnology 1999; 1:327-336)和 EP 0868527B1 鉴定并描述了作为L-赖氨酸输出蛋白(LysE)的新型(exporter)。一个确定的LysE无义突变体不再能运送L-赖氨酸至细胞外。该LysE基因所编码的多肽是长233个氨基酸或氨基酸残基并示于SEQ ID No. 2。在赖氨酸生产者中过表达LysE基因，发现L-赖氨酸的分泌增加。Von Bellmann 等人(Microbiology 2001; 147:1765-74)已就谷氛酸棒状杆菌中的多种碱性氨基酸的运送更详细地表征了 LysE输出蛋白。作者说明所述转运子特异地输出氨基酸L-赖氨酸和L-精氨酸至细胞外。作者还调查了 LysE是否也输出L-鸟氨酸至细胞外。为此目的，首先制备称作ATCC13032: :argF的L-精氨酸营养缺陷的谷氨酸棒状杆菌菌株。在包含40g/l葡萄糖的50ml称为CGXII的基本培养基中培养该菌株(分批培养)。 在24小时的孵育期后测量到60mM L-鸟氨酸，对应7. 9g/l。在细胞内，经过大约70分钟的孵育期在所述菌株的细胞中测量到大约200mM的L-鸟氨酸浓度。为了澄清是否LysE也输出L-鸟氨酸至细胞外，用复制质粒pEC71ysE转化所述菌株13032: : argF。此措施旨在为所述菌株提供增加的LysE活性，从而使得该菌株可以以更高的输出速率转运L-鸟氨酸至培养基中。然而，所述措施没有增加L-鸟氨酸的输出速率。对对照菌株(13032: :argF)和在所述转化子(带有pEC71ysE的13032: :argF)中测定到同样的输出速率(每分钟O. 6nmol (mg 干重))。由此该作者下结论L-鸟氨酸不被LysE输出蛋白所转运。他们还得出在谷氨酸棒状杆菌中一定有另一个未知的对L-鸟氨酸的输出功能(输出蛋白)的结论(Bellmann等人，2001，1771页的图5b)和1772页的21-28行)。在谷氨酸棒状杆菌R中鉴定到一变体LysE (见SEQ ID No. 4)，其与如SEQ ID No. 2 所示的来自菌株ATCC 13032的LysE输出蛋白的氨基酸序列不同在于N末端延伸三个氨基酸残基。所述氨基酸残基的序列是甲硫氨酸、缬氨酸、异亮氨酸(MVI)。来自菌株R的该 LysE多肽在EP 1266966B1已描述为在环区域形成上不同于野生型蛋白(或者更具体地不能再形成所述环)，因此能够实现改进的L-赖氨酸和L-精氨酸的输出的变体。
另一 LysE 变体已由 Gunji 和 Yasueda 所描述(Journal of Biotechnologyl27, 2006, 1- 13)。此作者对专性甲基营养型细菌甲基营养嗜甲基菌 (Methylophilus methylotrophus)的L-赖氨酸的形成有兴趣。他们用称为pSE的含有谷氨酸棒状杆菌ATCC13869LysE基因的质粒转化甲基营养嗜甲基菌以改进甲基营养嗜甲基菌的赖氨酸的形成。然而，此作者发现他们在甲基营养嗜甲基菌中能够以稳定方式建立的只有突变形式的LysE基因(lysE24)。由于插入一个胸腺嘧啶残基，在所述lysE24等位基因中LysE基因的开放读框已被移位，导致在432bp后该读框的终止。截短的读框编码在C 端比谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的野生型LysE蛋白质短92个氨基酸残基的LysE蛋白质。 它的长度是141个氨基酸残基。另外，该截短蛋白质的最后6个C端氨基酸(残基135-141) 不同于所述野生型LysE氨基酸序列的氨基酸。测试了携带在质粒上(pSE24)的所述修饰的LysE等位基因的甲基营养嗜甲基菌菌株的赖氨酸形成。为此，以分批补料的形式培养50 小时在O. 31称作SEIIc的基本培养基中测定该菌株。此作者发现转化子也形成了少量的 (O. 07mM，对应11.8mg/l)L-鸟氨酸，以及O. 55mM L-赖氨酸和O. 19mM L-精氨酸。如作者所解释，这一观察到的L-鸟氨酸的形成是由于该突变转运子的底物特异性的改变或者可能地该菌株的细胞内L-精氨酸库的改变。EP 1266966B1 (发明人=Gunji和Yasueda)描述了 LysE24转运子在分泌L-赖氨酸和L-精氨酸上的积极作用。
发明目的
本发明的目的是提供用于发酵制备L-鸟氨酸的新方法。
发明详述
本发明涉及制备L-鸟氨酸的方法，其特征在于进行以下步骤
a)在培养基中发酵分泌L-鸟氨酸的细菌，所述细菌选自棒状杆菌、芽孢杆菌、链霉菌、节杆菌和肠杆菌，其过表达编码具有L-鸟氨酸输出蛋白活性的多肽的多核苷酸，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID No. 2的氨基酸序列具有至少(彡)35%、彡40%、彡50%、 彡 55%、彡 60%、彡 65%、彡 70%、彡 75%、彡 80%、彡 85%、彡 90%、彡 92%、彡 94%、彡 96%、彡 97%、 彡98%、彡99%或100%，优选地彡70%，特别优选地彡90%，非常特别优选地彡96%和最优选地100%的相同性，5CN 102947460 A书明说3/24 页
b)在所述培养基中积累所述L-鸟氨酸，其中获得发酵液，
c)其中排除以DSM23239保藏的质粒pEC71ysE的过表达，
d)其中所编码的多肽的长度，适当地是彡146至彡286个氨基酸或氨基酸残基。
优选选择选自彡171至彡286、彡196至彡261、彡203至彡258、彡218至彡243、 彡228至< 236和彡228至< 233个氨基酸或氨基酸残基的范围内的长度。
特别优选在彡203至彡258、彡218至彡243、彡228至彡236和彡228至彡233 的范围内的长度，非常特别的优选在彡228至彡236和彡228至彡233的范围内的长度。
在本文以下提及的L-鸟氨酸，该术语也包含其盐，例如L-鸟氨酸盐酸盐或L-鸟氨酸硫酸盐。
根据本发明的方法使用选自棒状杆菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属、节杆菌属和肠杆菌属的细菌。
在棒状杆菌属中，优选基于以下物种的菌株·
Corynebacterium efficiens,例如模式菌株 DSM44549,
谷氨酸棒状杆菌，例如模式菌株ATCC13032或R菌株，和
产氛棒状杆菌(Corynebacteriumammoniagenes),例如 ATCC6871 菌株，
非常特别优选谷氨酸棒状杆菌物种。
某些谷氨酸棒状杆菌物种的代表在现有技术中也以其它名称为人所知。这些包括例如
菌株ATCC13870,被称为嗜醋酸棒状杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilum),
菌株DSM20137,被称为百合棒状杆菌(Corynebacterium Iilium),
菌株ATCC17965，被称为栖糖蜜棒状杆菌(Corynebacterium melassecola),
菌株ATCC14067,被称为黄色短杆菌(Brevibacterium f Iavum),
菌株ATCC13869,被称为乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum),和
菌株ATCC14020,被称为散枝短杆菌(Brevibacterium divaricatum)。
术语“产谷氨酸小球菌(Micrococcus glutamicus) ”已同样用于谷氨酸棒状杆菌。某些Corynebacterium efficiens物种的代表在现有技术中也已称为热产氨棒状杆菌 (Corynebacterium thermoaminogenes),例如菌株 FERM BP-1539。
在芽孢杆菌属中，优选枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)物种。
在节杆菌属中，优选朽1檬节杆菌(Arthrobacter citreus)物种。
在肠杆菌科中，优选埃希氏菌属、欧文菌属(Erwinia)、普罗威登斯菌属、泛菌属(Pantoea)和沙雷氏菌属(Serratia)。特别优选埃希氏菌属和沙雷氏菌属。非常特别优选埃希氏菌属的大肠杆菌物种(Escherichia coli)、沙雷氏菌属的粘质沙雷氏菌物种(Serratia marcescens)和普罗威登雷斯菌属的雷氏普罗威登斯菌物种(Providencia rettgeri)。
用于过表达L-鸟氨酸输出蛋白的方法的细菌或菌株(起始菌株)，优选具有分泌L-鸟氨酸至周围的营养培养基并在其中积累L-鸟氨酸的能力。该表述“生产”在本文如下也用于此意。更具体地，用于所述过表达方法的菌株具有在营养培养基中浓缩或积累 ^0. lg/l、0.3g/l) lg/1、彡3g/l) 10g/l L-鸟氨酸的能力。起始菌株优选通过诱变和选择、通过重组DNA技术或通过两种方法的组合制备的菌株。6
显而易见且不需要进一步解释，适用于本发明的方法的细菌也可以通过首先在野生型菌株(例如在谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC 13032或在菌株ATCC 14067)中过表达编码具有L-鸟氨酸输出蛋白活性的多肽的多核苷酸，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID No. 2具有至少(> )35%相同性，适当地所编码的多肽的长度位于如上所述的长度范围内，接下来再通过在现有技术中所描述的进一步的遗传方法使所述细菌生产L-鸟氨酸。只用所提及的多核苷酸转化野生型(例如菌株ATCC13032、ATCC14067、ATCC13869或ATCC17965)不会导致根据本发明的方法。
分泌或产生L-鸟氨酸的谷氨酸棒状杆菌物种的菌株的实例是
在US 5188947中所描述的乳发酵短杆菌FERMBP 2344和谷氨酸棒状杆菌FERMBP 2345。
分泌或产生L-鸟氨酸的柠檬节杆菌物种的菌株的实例是
在US 5188947中所描述的柠檬节杆菌FERMBP 2342。
分泌或产生L-鸟氨酸的枯草芽孢杆菌物种的菌株的实例是
在JP 57041912中所描述的枯草芽孢杆菌B0R32 (FERMP 3647)。
分泌或产生L-鸟氨酸的雷氏普罗威登斯菌物种的菌株的实例是
在JP 03195494所描述的雷氏普罗威登斯菌ARGA6(FERM P11147)。
分泌或产生L-鸟氨酸的大肠杆菌物种的菌株的实例是
在US 3668072 中所描述的大肠杆菌 B1919(ATCC 21104)。
L-鸟氨酸生产细菌通常对氨基酸L-瓜氨酸或L-精氨酸是营养缺陷的。作为替代，也可以考虑对L-瓜氨酸或L-精氨酸是营养延缓(bradytrophic)的L-鸟氨酸生产细菌。术语营养缺陷和营养延缓的定义可以在例如W001/09286的第9页上找到。在本领域营养延缓型也称为渗漏突变体。所用的营养延缓细菌具体是其中的基因产物ArgF(鸟氨酸氨基甲酰转移酶)、ArgG (精氨琥珀酸合酶)或ArgH (精氨琥珀酸裂解酶)的活性与野生型中的活性相比大于(>)零但等于或小于(()10%，优选 > 零并< 1%的细菌。
现有技术已公开称为LysE基因并编码具有L-赖氨酸输出蛋白活性的蛋白质或多肽的多核苷酸。所述多肽也称为缩写LysE。
输出蛋白是位于细胞的细胞膜上并从所述细胞的细胞质中向输出代谢物(例如 L-赖氨酸或L-鸟氨酸)进入周围的培养基的蛋白。如果为此所需的能量以三磷酸腺苷 (ATP)的形式提供，这被称为初级主动运输或初级输出。如果所述能量以离子梯度的形式， 例如钠离子，提供，称之为次级主动运输或次级输出(Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko and L. Stryer ;Biochemie [生物化学]第五版，378-384 页，Spektrum Akademischer Verlag [出版商]，Heidelberg, Germany, 2003)。测定L-鸟氨酸输出蛋白活性的操作说明可以在 Bellmann 等人(Microbiology 2001; 147:1765-74)中找到。
在本发明的研究过程中，发现棒状杆菌属(优选谷氨酸棒状杆菌)和微球菌属 (优选藤黄微球菌(Micrococcus Iuteus))的赖氨酸输出蛋白具有除L-赖氨酸输出蛋白活性外的L-鸟氨酸输出活性。
本发明的方法利用编码对L-鸟氨酸具有输出活性的多肽的基因，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID No. 2的氨基酸序列具有至少(彡)35%、彡40%、彡50%、彡55%、彡60%、 彡 65%、彡 70%、彡 75%、彡 80%、彡 85%、彡 90%、彡 92%、彡 94%、彡 96%、彡 97%、彡 98%、彡 99%或100%，优选地≥70%，特别优选地≥90%，非常特别优选地≥96%，最优选地≥100%的相同性，所编码的多肽的长度适当地位于上述的长度范围内。
适合的L-鸟氨酸输出蛋白的实例是谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032 (SEQID No. 2)、 谷氨酸棒状杆菌R(SEQ ID如.4)、谷氨酸棒状杆菌々1014067出0 ID No. 5)，谷氨酸棒状杆菌 ATCC13869(EQ ID No. 7), Corynebacterium efficiens YS314(EQ ID No. 9), 溶血棒状杆菌(Corynebacterium diphteriae) NCTC 13129 (SEQ ID No. 10)、纹带棒状杆菌(Corynebacterium striatum)ATCC6940(SEQ ID No. 11) > Corynebacterium aurimucosum ATCC700975 (SEQ ID No. 12)、马氏棒状杆菌(Corynebacterium matruchotii) ATCC33806(SEQ ID No. 13) > Corynebacterium pseudogenitalium ATCC33035 (SEQ ID No. 14)、拥挤棒状杆菌(Corynebacterium accolens) ATCC49725 (SEQ ID No. 15)、 Corynebacterium glucuronalyticum ATCC51867(SEQ ID No. 16)、藤黄微球菌 NCTC2665(SEQ ID No. 17)^Corynebacterium tubuculostearicum SK141(SEQ ID No. 18)和马氏棒状杆菌ATCC14266(SEQ ID No. 19)的赖氨酸输出蛋白或LysE多肽。SEQ ID No. 18 和SEQ ID No. 19在本领域中也称为ArgO多肽。
在本研究中，测定了谷氨酸棒状杆菌ATCC14067和谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的 LysE基因的核苷酸序列(SEQ ID No. 6和SEQ ID No. 8)。谷氨酸棒状杆菌ATCC14067和谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的LysE多肽的氨基酸序列如SEQ ID No. 5和7中所示。它们与如SEQ ID No. 2所示的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032LysE的氨基酸序列相同。
表I列出来自国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda, MD, US)的数据库采集的棒状杆菌属的各种代表菌和藤黄微球菌的LysE多肽的录入号。另外，表I对序列列表中所示的LysE多肽的氨基酸序列作出引用。最后，表I显示所编码的LysE多肽的长度(氨基酸的数目)。
表I:


本发明涉及使用微生物通过发酵生产L-鸟氨酸的方法，其特征在于增加所述氨基酸的输出。