珍珠质基质蛋白及其编码基因与克隆方法和应用制作方法

张荣庆, 张勇, 谢莉萍, 王洪钟

2003年11月19日

2002年5月9日

2002年5月9日

清华大学

A61K38/17GK1456573SQ0211758

基质蛋白 克隆 编码 珍珠 基因

1.一种珍珠质基质蛋白，具有序列表中序列2的氨基酸序列或将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有序列2蛋白活性的由序列2衍生的蛋白质2.根据权利要求1所述的珍珠质基质蛋白，其特征在于所述蛋白具有序列表中序列2的氨基酸序列3.根据权利要求1或2所述的珍珠质基质蛋白，其特征在于所述蛋白序列的碳端还连接有序列表中序列3的信号肽4.一种体外表达权利要求1所述珍珠质基质蛋白的方法，包括以下步骤1)根据编码权利要求1所述蛋白的基因序列的两端设计引物，在引物的两端分别加上BamHI和XhoI酶切位点；2)通过PCR方法在含有目的基因的克隆中扩增该基因，使产物两端也加上酶切位点；3)利用设计的酶切位点将目的基因插入表达载体；4)转化大肠杆菌；5)表达、分离、纯化目的蛋白5.一种编码珍珠质基质蛋白的DNA序列，它具有下列序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交的DNA序列6.根据权利要求5所述的编码珍珠质基质蛋白的DNA序列，其特征在于所述序列为序列表中的序列17.一种克隆权利要求5所述基因的方法，包括下述步骤1)构建合浦珠母贝外套膜cDNA文库；2)通过PCR方法利用简并引物对cDNA文库进行筛选；3)对所得到的阳性克隆进行序列分析；8.权利要求1所述的蛋白质在提高珍珠质量与产量9.权利要求1所述的蛋白质在制备体外培养材料中的应用10.权利要求1所述的蛋白质在制备医用生物新材料中的应用

本发明涉及一种珍珠质基质蛋白与编码基因及其克隆方法和应用一种珍珠质基质蛋白，具有序列表中序列2的氨基酸序列或将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有序列2蛋白活性的由序列2衍生的蛋白质所述蛋白序列的碳端还连接有序列表中序列3的信号肽一种体外表达上述珍珠质基质蛋白的方法，包括以下步骤1)根据编码权利要求1所述蛋白的基因序列的两端设计引物，在引物的两端分别加上BamHI和XhoI酶切位点；2)通过PCR方法在含有目的基因的克隆中扩增该基因，使产物两端也加上酶切位点；3)利用设计的酶切位点将目的基因插入表达载体；4)转化大肠杆菌；5)表达、分离、纯化目的蛋白一种编码珍珠质基质蛋白的DNA序列，它具有下列序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交的DNA序列其中，所说的严格条件是指在通常采用的杂交体系中，杂交温度在42℃以上一种克隆上述珍珠质基质蛋白基因的方法，包括下述步骤 1)构建合浦珠母贝外套膜cDNA文库；2)通过PCR方法利用简并引物对cDNA文库进行筛选；3)对所得到的阳性克隆进行序列分析；本发明分离、鉴定出的珍珠质基质蛋白的编码基因及其编码的珍珠质基质蛋白，可以广泛应用于提高珍珠的产量与质量、珍珠的体外培养、珍珠质作为新型生物材料及制备医用生物新材料的开发利用等领域在饱和碳酸钙溶液中加入本发明珍珠质基质蛋白，可使碳酸钙结晶形成有序的文石晶体，而不是天然条件下形成的方解石晶体由于其独特的晶体结构和机械强度，所形成的晶体可进一步开发成新型医用生物材料与其它珍珠质基质蛋白配合使用，本发明珍珠质基质蛋白可使碳酸钙在体外形成珍珠质样晶体，使珍珠的工业生产成为可能随着生物工程技术的发展，可通过控制本发明珍珠质基质蛋白编码基因在珍珠贝体内的表达周期，人为控制珍珠形成的时期，从而提高珍珠质量与产量实施例2、序列表中的序列2在体外的表达本发明的第二个目的是提供一种体外表达珍珠质基质蛋白的方法，包括以下步骤1)根据编码成熟蛋白的氨基酸序列的两端设计引物，在引物的两端分别加上BamHI和XhoI酶切位点；所设计引物的序列为上游引物GCGGATCCGGCGGAGATGGTGAC； 下游因物GCCTCGAGTTATTGCAAAAAAATGAATATC2)通过PCR方法在含有目的基因的克隆中扩增该基因，使产物两端也加上酶切位点，其中，PCR的条件为50μl反应体系，加入含有目的基因的质粒1μl为模板，两种引物各50pmol，95℃变性后加入2U Taq DNA聚合酶，95℃变性45sec，54℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环后于72℃延伸10min3)利用设计的酶切位点将目的基因插入pGEX-4T表达载体；6)转化大肠杆菌；7)表达、分离目的蛋白；8)纯化目的蛋白经分析证实得到的蛋白质为碳端连接有序列表中序列3信号肽的序列2蛋白质序列表<160>3<210>1<211>362<212>DNA<213>合浦珠母贝(Pinctada fucata)<220><223><400>1gcacgaggca gataaaaggt cggtgcccaa ccacagtcat gaaacccttt gttacactcg 60caagcttgat cgtcttaatt gcctctgttt ctgccggcgg agatggtgac tatggcaaat 120acggcggtgt cagttacgga cctggcatca accttggagg tggtagtcta agtgccggag 180gaggtgttat cgggcttgga ggcgtcggag gtggtagtct aggtgccgga ggcgtcggcc 240cagttggtgg aattaccata tggactcacc ttttcacctg gatatacctt tttcatggat 300gtttgatatt catttttttg caataaatgg ccgggcacat acaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360aa362<210>2<211>76<212>PRT<213>合浦珠母贝(Pinctada fucata)<220><223><400>2gly gly asp gly asp tyr gly lys tyr gly gly val ser tyr gly1 5 10 15pro gly ile asn leu gly gly gly ser leu ser ala gly gly gly20 25 30val ile gly leu gly gly val gly gly gly ser leu gly ala gly35 40 45gly val gly pro val gly gly ile thr ile trp thr his leu phe50 55 60thr trp ile tyr leu phe his gly cys leu ile phe ile phe leu65 70 75gln76<210>3<211>19<212>PRT<213>合浦珠母贝(Pinctada fucata)<220><223><400>3Met Lys Pro Phe Val Thr Leu Ala Ser Leu Ile Val Leu Ile Ala1 5 10 15Ser Val Ser Ala19