专利名称：棕点湍蛙抗菌多肽及其在制药中的应用的制作方法 自从抗生素发明以来，人类在控制和治疗微生物感染疾病中取得了较大的成就。但随着“传统抗生素”的持续使用，不断产生出诸多新问题.目前，微生物抗药性已成为临床微生物感染疾病治疗的重大问题，以至于某些病原细菌已没有临床治疗的一线药物。在目前，万古霉素抗性的葡萄球菌、肠球菌以及其他革兰氏阴性感染疾病，均是世界范围内的临床难题，三类主要引起脑膜炎的细菌在临床上也出现了强的抗药性，抗青霉素、氯霉素脑膜炎双球菌、肺炎球菌，对抗新头孢菌素抗生素的肺炎球菌也广泛出现。因此，新一类抗生素的研制已成为当务之急和国际上的热点。研究发现，多肽抗生素具有广谱的抗菌活性，同时具有“传统抗生素”无法比拟的优越性如在最小作用浓度时，快速而广谱地杀灭微生物(包括目前临床抗药菌)；对真菌也有抑制作用；不会诱导抗药菌株的产生；对于拒不感染和全身感染都有效，有希望成为新一代抗菌剂，其研制已受到广泛重视。很多两栖类动物在中国属于传统中药和民族药物而广泛应用，如中华蟾蜍(Bufo gargarizans)，大蹼铃蟾(Bombina maxima)，黑斑蛙(pelophylaxnigromaculata)，沼蛙(Hylarana guentheri)和泽蛙(Euphlyctislimnocharis)等。这些两栖类动物的皮肤和内脏具有广泛的药理活性和临床疗效。已报道药理活性有广谱抗微生物作用、抗肿瘤、镇痛、局部麻醉、免疫调节、心血管系统作用等。在国外，两栖类皮肤特定药理活性单体化合物的寻找已是新药发明的热点。据国内外文献报道，已从各种生物来源分离得到不同的活性多肽，有些已进入临床治疗。如从爪蟾(Xenopus laevis)皮肤分泌液获得的活性多肽Magainin具广谱抗微生物作用，同时具有抗肿瘤活性，在美国已获准作为广谱抗菌药物，其基因工程产品已进入三期临床；Intrabiotics公司生产的活性多肽IB-367已获准用于治疗癌症病人因多种细菌感染而引起的口腔溃疡一期临床试验；Applied Microbiology公司与Astra公司合作用活性多肽nisin治疗胃溃疡的临床试验也取得良好的疗效。我国对两栖类药物的应用有悠久的历史，但对其活性成分和药理性质的研究主要集中于生物碱等有机小分子，对其皮肤活性肽类物质研究不多。
本发明的目的在于提供一种新的棕点湍蛙抗菌多肽。本发明的目的还在于提供一种棕点湍蛙抗菌多肽的药物用途，特别是棕点湍蛙抗菌多肽在制备治疗病原微生物感染疾病的药物中的应用。本发明的目的是这样实现的。棕点湍蛙(Amolops loloensis)主要分布于四川、云南省，是我国特色资源动物之一。本发明利用乙醚刺激棕点湍蛙，收集到棕点湍蛙皮肤分泌液，经离心去除沉淀，冷冻干燥后经一系列的生物化学手段分离纯化得到一种多肽，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构，根据所得到的氨基酸序列合成该多肽。采用飞行时间质谱法测定分子量，等电聚焦测定等电点，自动氨基酸测序仪确认其氨基酸序列结构。本发明的多肽是一种单链多肽，并命名为棕点湍蛙抗菌多肽，其分子量1706.96道尔顿，等电点8.75，多肽全序列为苯丙氨酸—亮氨酸—脯氨酸—脯氨酸—丝氨酸—脯氨酸—色氨酸—赖氨酸—谷氨酸—苏氨酸—苯丙氨酸—精氨酸—苏氨酸—苏氨酸；或表示为Phe Leu Pro Pro Ser Pro Trp Lys Glu Thr Phe Arg Thr Thr1 5 10发明人将本发明的棕点湍蛙抗菌多肽全序列结构经蛋白数据库进行搜索比较未发现有任何相同的多肽。本发明的棕点湍蛙抗菌多肽是从天然生物资源得到的产物，具有显著的抑制细菌生长的作用，可用于制备病原微生物感染疾病的治疗药物。本发明取得的进步意义是利用我国自然资源，为制备治疗病原微生物感染疾病的药物提供了又一选择。

下面的实施例用于进一步说明本发明。但本发明的内容并不受此限制。
实施例一、棕点湍蛙抗菌多肽的制备将从我国云南省得到的活体棕点湍蛙用水清洗干净，置于带盖的玻璃容器中，滴加无水乙醚(1升体积容积加1毫升无水乙醚)，密闭容器3-5分钟，可见大量的泡沫状物质从棕点湍蛙皮肤分泌出来，收集分泌物，离心(10000rpm，20分钟)、冷冻干燥后保存。详细制备过程为第一步Sephadex G-50凝胶过滤柱层析，按上述方法获得的原材料棕点湍蛙皮肤分泌液冻干粉300mg溶解于5ml纯净水，10000rpm 4℃离心10min去除沉淀。Sephadex G-50凝胶过滤柱(长1000mm，直径26mm)用0.1M Na2HPO4-NaH2PO4 pH 6.0缓冲液平衡，充分后将样品上于该柱。用同样缓冲液洗脱，收集活性峰。
第二步反相高压液相色谱为Sephadex G-50凝胶过滤得到的活性成分的峰上样于经含1‰三氟乙酸的超纯水充分平衡的C18反相柱(长300mm，直径5mm)用含1‰三氟乙酸的乙晴缓冲液从0％至100％的梯度洗脱。收集具有抗菌作用的活性峰。
第三步纯化的棕点湍蛙抗菌多肽用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用飞行时间质谱法(Time of flight mass spectrometry，TOF-MS)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
通过上述方法制备的棕点湍蛙抗菌多肽，分子量1706.96道尔顿，等电点8.75，多肽全序列为苯丙氨酸—亮氨酸—脯氨酸—脯氨酸—丝氨酸—脯氨酸—色氨酸—赖氨酸—谷氨酸—苏氨酸—苯丙氨酸—精氨酸—苏氨酸—苏氨酸；或表示为Phe Leu Pro Pro Ser Pro Trp Lys Glu Thr Phe Arg Thr Thr1 5 10将本发明的棕点湍蛙抗菌多肽全序列结构经蛋白数据库进行搜索比较，未发现有任何相同的多肽。
二、棕点湍蛙抗菌多肽抑制细菌生长的作用实验抗菌活性检测，采用杯碟法，培养基为普通琼脂培养基。分别注入加热融化的培养基20ml于平皿中作为底层，使其在皿底内均匀摊布，凝固后，另取培养基适量加热融化后，分别在每皿中加入5ml菌悬液，摇匀，使其在底层上均匀摊布，作为菌层。冷却后，在平皿中等距离均匀放入已消毒的不锈钢杯6个。第一个钢杯加入0.1-0.3mg/ml浓度的待测化合物溶液0.1ml，其余钢杯采用二倍稀释法加入样品液，37℃培养，观察抑菌圈大小。抑菌圈10mm以上的作为最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)。细菌菌株来源于昆明医学院第一附属医院，此试验重复四次，取平均值，结果如表1。
表1棕点湍蛙抗菌多肽抑制细菌生长的作用

实验证明，棕点湍蛙抗菌多肽具有显著的抑制细菌生长的作用，可用于制备病原微生物感染疾病的治疗药物。


本发明公开了一种棕点湍蛙抗菌多肽及其在制药中的应用。通过生物化学手段，从棕点湍蛙皮肤分泌液中分离纯化得到抗菌多肽并测定其序列，按照所得的序列合成该多肽。棕点湍蛙抗菌多肽是一种单链多肽，分子量1706.96道尔顿，等电点8.75，多肽全序列为苯丙氨酸—亮氨酸—脯氨酸—脯氨酸—丝氨酸—脯氨酸—色氨酸—赖氨酸—谷氨酸—苏氨酸—苯丙氨酸—精氨酸—苏氨酸—苏氨酸。实验证明棕点湍蛙抗菌多肽具有显著的抑制细菌生长的作用，可用于制备治疗病原微生物感染疾病的药物。