具抗肿瘤活性的马氏珠母贝全脏器糖蛋白、糖胺聚糖及其提取工艺制作方法

吴红棉, 陈方, 雷晓凌, 吴铁, 洪鹏志

2001年11月14日

2000年4月30日

2000年4月30日

湛江海洋大学, 广东医学院医药科技开发中心

A61K35/56GK1321469SQ0010519

马氏珠 母贝 抗肿瘤 脏器 活性

1.一种具有抗肿瘤及抗凝等医药作用的医药组合物，其特征在于该组合物含有马氏珠母贝(Pinctada martensi(Dunker))全脏器的提取物2.如权利要求1所述的医药组合物，其特征在于其中马氏珠母贝全脏器提取物的化学本质是马氏珠母贝所含的糖蛋白、糖胺聚糖3.如权利要求1所述的医药组合物所含的马氏珠母贝全脏器提取物，其特征是提取工艺以马氏珠母贝全脏器为原料，经冻融或盐溶、有机溶剂(丙酮、乙醇、醋酸乙酯)沉淀得马氏珠母贝全脏器糖蛋白；经胃蛋白酶、胰蛋白酶、枯草杆菌中性蛋白酶水解，经脱色、有机溶剂沉淀后用吸附、等电点沉淀、透析、醇沉、CTAB沉淀等法除杂，粗提物再经醇沉、CTAB络合法纯化，得马氏珠母贝全脏器糖胺聚糖制品4.如权利要求3所述的提取工艺，其特征在于原料是马氏珠母贝(Pinctada martensi(Dunker))全脏器5.如权利要求3所述的提取工艺，其特征在于提取所得的马氏珠母贝全脏器糖蛋白、糖胺聚糖具抗肿瘤活性及抗凝等药理活性6.如权利要求3所述的提取工艺，其特征是按此工艺提取所得的一系列化合物中有若干级分具有抗肿瘤活性7.如权利要求3所述的提取工艺，其特征在于水解所用酶是胃蛋白酶、胰蛋白酶、枯草杆菌中性蛋白酶8.如权利要求3所述的提取工艺，其特征在于冻融、盐溶或酶解后用有机溶剂(丙酮、乙醇、醋酸乙酯)沉淀，然后用1.0％活性碳及0.5％硅藻土吸附，PH2.0及PH7.0等电点除蛋白及透析脱盐，透析液用60％乙醇-乙酸钠沉淀及5％CTAB沉淀，所得级分再经60％乙醇-乙酸钠沉淀及5％CTAB络合，得一系列化合物9.如权利要求3所述的提取工艺，其特征在于纯化中CTAB络合法中用1.0ml Nacl解离

本发明涉及从马氏珠母贝全脏器提取的糖蛋白、糖胺聚糖，及其提取工艺，上述糖蛋白、糖胺聚糖化合物具有抗肿瘤、抗凝等活性，可作为抗肿瘤药的医药组合物恶性肿瘤严重危害人类的健康，而抗癌化疗药都呈现出一定的毒性从动、植物中提取一些具有抗肿瘤活性的天然化合物，用于生产高效低毒的抗肿瘤药物是抗肿瘤药物研究的一个方向珍珠为名贵中药，有报道珍珠层粉对小鼠肉瘤S-180有抑制作用，作为育成珍珠和珍珠层的母体—珠母贝全脏器，是否也含有相同或相似作用的糖蛋白、糖胺聚糖化合物，未有研究报道本研究组已证实马氏珠母贝全脏器的提取物具有显著的抗癌作用，其单独应用有显著抑制肿瘤细胞的增殖作用，与其它化疗药合用可显著增敏化疗药的抑瘤作用，同时对抗其抑制免疫的不良反应本发明的目的在于从马氏珠母贝全脏器提取一种或数种具有抗癌活性的天然化合物，确定其化学本质及结构特征，了解其理化特性，为临床医学提供一种新的抗肿瘤药物本发明涉及从马氏珠母贝全脏器提取的糖蛋白、糖胺聚糖二类化合物这二类化合物是从马氏珠母贝全脏器提取，纯化后经化学组成测定、气相色谱分析 红外光谱分析、高效液相色谱分析鉴定证实其化学本质及结构特征的本研究组从马氏珠母贝全脏器提取糖蛋白、糖胺聚糖的工艺为马氏珠母贝全脏器冻融、盐溶、有机溶剂沉淀或用等体积丙酮浸泡脱脂，滤除丙酮液后烘干粉碎，用胃酶、胰酶或胰酶、枯草杆菌中性蛋白酶酶解，灭酶后用硅藻土、活性碳(2∶3)脱色，经有机溶剂(丙酮、乙醇、醋酸乙酯)沉淀后干燥成粉末；上述粉末用1.0％活性碳及0.5％硅藻土脱色，pH2.0及pH7.0除杂蛋白及透析脱盐，透析液用60％乙醇-乙酸钠沉淀及5％CTAB沉淀所得级分再经60％乙醇-乙酸钠沉淀及5％CTAB络合，得一系列化合物主要级分经化学组成测定氨基己糖含量为52.5％，其中氨基半乳糖含量为34.3％，己糖醛酸含量为7.3％；经醋酸纤维素薄膜电泳显示为单一区带，Rf在0.3～0.4之间；经抗肿瘤试验结果显示对体内S-180肉瘤和艾氏腹水癌有显著增敏阳性对照药的抑瘤作用，抑瘤率分别达61.96％与46.3％；对体外培养HL-60细胞有一定的杀伤作用；同时，抗凝血实验结果显示提取物有一定的抗凝作用，抗凝效果为肝素的二百分之一上述两种化合物作为医药组合物，特别是抗肿瘤的药理活性，是通过下述实验证实的实施例一1、材料与方法马氏珠母贝全脏器糖胺聚糖由权利要求书所述工艺提取而得台盼兰、5-Fu、替加氟KM小鼠由广东医学院实验单位中心提供，普通级，体重20±2g，雌雄各半移殖性肿瘤S180肉瘤和艾氏腹水癌(EAC)由中山医科大学肿瘤研究中心提供，广东医学院药理教研室肿瘤研究小组常规传代培养无菌条件下，两次实验分别抽取S180和艾氏腹水癌(EAC)腹水液，用N.S以1∶1稀释(台盼兰染色计数为8.0×106个/ml和6.5×106个/ml)，无菌接种(每鼠0.2ml)于KM小鼠右腋下接种后次日随机分成生理盐水组、阳性对照组(5-FU或替加氟)、低剂量受试药组(马氏珠母贝全脏器糖胺聚糖)、高剂量受试药组(马氏珠母贝全脏器糖胺聚糖)、及阳性对照药与受试药合用组共五组每组小鼠分别灌胃给药(0.1ml/10g体重)，连续10天，第11天处死，称体重，解剖取肉瘤称重2、实验结果马氏珠母贝全脏器糖胺聚糖对S180肉瘤和艾氏腹水癌(EAC)的抑瘤作用见表1、2表1.马氏珠母贝全脏器糖胺聚糖对S180的抑瘤作用组别剂量 动物数体重瘤重 抑瘤(mg/kg) 给药前给药后率(％)(1)N.S对照组1321.6±2.5 30.6±4.70.92±0.4(2)5-FU 25 1022.3±2.4 27.9±3.40.60±0.4334.5*(3)马氏珠母贝全 50 1121.3±2.7 29.1±4.50.86±0.366.5脏器糖胺聚糖(4)马氏珠母贝全 2001222.0±2.5 28.3±3.70.79±0.4714.1脏器糖胺聚糖(5)(2)+(3) 1222.2±2.7 26.6±1.80.35±0.1661.96**P＜0.05**P＜0.001表2.马氏珠母贝全脏器糖胺聚糖对艾氏腹水癌(EAC)的抑瘤作用组别 剂量 动物数体重瘤重 抑瘤(mg/kg) 给药前 给药后 率(％)(1)N.S对照组 1024.6±2.2 30.7±4.1 2.12±1.16(2)替加氟5 1024.3±2.7 32.8±6.8 1.58±0.8925.6(3)马氏珠母贝全 5 1024.8±3.2 29.6±2.9 1.60±0.7724.5脏器糖胺聚糖(4)马氏珠母贝全 101025.9±1.8 31.1±3.5 1.89±0.5710.1脏器糖胺聚糖(5)(2)+(3) 1024.3±3.0 29.1±4.8 1.14±0.7046.3**P＜0.05实验结果表明马氏珠母贝全脏器糖胺聚糖(50mg/kg)对S180肉瘤虽然抑瘤作用较弱(抑瘤率6.5％)，但可显著增敏阳性对照药5-FU(25mg/kg，抑瘤率达34.5％，P＜0.05)的抑瘤作用，抑瘤率达61.9％(P＜0.001)；马氏珠母贝全脏器糖胺聚糖(5mg/kg)对艾氏腹水癌(EAC)有抑瘤作用，抑瘤率达24.5％，而且与阳性对照药替加氟(5mg/kg，抑瘤率达25.6％，P＜0.05)有协同作用，抑瘤率达46.3％(P＜0.01)且两次实验前后各组小鼠体重变化与生理盐水对照组无显著差异，说明实验结果可靠3、结论马氏珠母贝全脏器糖胺聚糖对体内S180肉瘤和艾氏腹水癌(EAC)有显著增敏阳性对照药的抑瘤作用，抑瘤率分别达61.9％和46.3％实施例二1、材料与方法马氏珠母贝全脏器糖胺聚糖由权利要求书所述工艺提取而得HL-60细胞由中山医科大学肿瘤研究中心提供，广东医学院药理教研室肿瘤研究小组常规传代培养于24孔培养板内，接种HL-60细胞悬液，接种细胞数为5.0×104个/ml，每组设3个平行孔，分别加入不同浓度的5-FU及马氏珠母贝全脏器糖胺聚糖，空白组加入等量的培养基，置于37℃、5％CO2孵化箱培养24h，用台盼兰染色计数活细胞试验结果重复两次2、实验结果马氏珠母贝全脏器糖胺聚糖对HL-60细胞的杀伤作用见表3表3、马氏珠母贝全脏器糖胺聚糖对HL-60细胞的杀伤作用组别剂量例数 成活细胞数 杀伤率(％)IC50(1)N.S对照组 培养基97.06(2)5-FU0.001 94.67±2.133.85(3)马氏珠母贝全脏器1.0 94.33+1.7 38.671.72糖胺聚糖(4)马氏珠母贝全脏器0.1 95.25±2.125.64糖胺聚糖(成活细胞数为×104个/ml)实验结果表明马氏珠母贝全脏器糖胺聚糖(1.0mg/ml，0.1mg/ml)在用药24h时对HL-60细胞的杀伤率分别为38.7％和25.6％，IC50为1.72mg/ml5-FU(0.01mg/ml)对HL-60细胞的杀伤率为33.85％，实验结果可靠提示马氏珠母贝全脏器糖胺聚糖对体外培养HL-60细胞具有一定的杀伤作用3、结论马氏珠母贝全脏器糖胺聚糖剂量为1.0mg/ml及0.1mg/ml时对体外培养HL-60细胞杀伤率分别达38.7％和25.6％实施例三用前述方法对马氏珠母贝全脏器糖蛋白进行研究，也初步证明这种化合物有类似的抗肿瘤活性实施例四用马氏珠母贝全脏器糖胺聚糖、糖蛋白进行了其它药理学方面的研究，初步证明其有一定的抗凝作用，抗凝效果为肝素的二百分之一；也有对抗抗癌化疗药物抑制免疫的副作用的作用