专利名称：正十六烷二元酸生产方法长链二元酸是一系列特殊合成材料的基础单体原料，长链二元酸及其衍生单体可以生产尼龙，粉末涂料，香料，热熔胶特种润滑油，热熔胶棒等产品，应用非常广泛。 国外生产长链二元酸的方法主要有两种，一种是化学合成法，一种是化学合成法，以丁二烯为原料，通过化学合成法生产二元酸，另一种是生物合成法利用微生物发酵取得。化学合成法工艺复杂，成本高，而且不能生产比十二碳更长的二元酸，现在已经基本被淘汰。 发酵法生产长链二元酸是70年代微生物发酵技术在石油化工领域的应用，具有 原料来源广，反应专一性强和反应温和等特点，在国内外受到普遍重视。目前对十二碳， 十三碳二元酸的研究已经非常成熟，已经在工业规模上进行生产，对十四碳二元酸研究也 已取得阶段性成效，出现了有实际生产价值的专利文献，中国专利03105127. 8，CN1432648A 提出生产十四碳二元酸的方法，在二十五吨罐内，发酵清液中十四碳二元酸产量最高达 242. 8g/L，后处理收率82 % ，纯度达到98. 2 % 。 但是对十六碳二元酸的研究却仍然处于实验室摸索阶段，通常情况下发酵十六烷 二元酸产品含氮量高，一般在5-6卯m，多的高达8ppm以上，产品在医药中间体应用受到限 制，同时在应用于高档尼龙上已受到限制，因此，需要继续研究解决生产十六碳二元酸产品 含氮量高的问题。
本发明的目的在于提供一种正十六烷二元酸生产方法，科学合理，方便操作，获得 的产品纯度高，含氮量低，提高产品质量，扩大产品应用范围。 本发明所述的正十六烷二元酸生产方法，包括发酵转化和产物分离纯化，其特征 在于发酵转化中培养基含有柠檬酸、氨水、辅酶Q10、生物素、铁离子、铜离子和锌离子。 其中 柠檬酸浓度为l-5g/1。 氨水浓度为l-5卯m。 辅酶QIO浓度为0. OOOl-lOO卯m，优选为0. 001-20卯m。 生物素(维生素H)浓度为0. OOOl-lOO卯m，优选为0. 001-50卯m。铁离子浓度为l-1000卯m，优选为10-200卯m，由氯化亚铁提供。铜离子浓度为0. 001—-100卯m，优选为0. 01-30卯m，由硫酸铜提供。锌离子浓度为0. 001-50卯m，优选为0. 01-28卯m，由硫酸锌提供。 发酵过程中最好补加l-5g/1的磷酸盐和l-8g/1的硝酸盐，改善效果。 分离纯化采用盐析法，将发酵完的培养液降到15-2(TC，直接加入重量浓度为
35-30 %氯化钠进行盐析预处理，可获得更好的效果。 在实际操作中，通常先制备发酵种子，用于本发明的培养基。 10个巴林糖度的麦芽汁加2%琼脂制成的古体克氏瓶斜面。 烷烃液体种子培养基包含蔗糖10-50g/L，金属磷酸盐l-12g/L，酵母膏 1. 0-3. Og/L，玉米桨1. 0-3. Og/L，尿素1. 0-3. Og/L， NaClO. 5-1. 5g/L， nC16正构烷烃体积浓 度O-O. 5% (V : V)，自来水配制，pH自然。 通常，培养种子的过程为取一环接种酵母菌体，涂布在克氏瓶麦芽汁固体斜面 上，于28-3(TC培养40-48小时。取上述培养好的克氏瓶2_3个，将菌种全部刮入100ml无 菌水中，适当摇匀后作为一级种子罐的种子。接种一级种子罐后，28-3(TC培养24-32个小 时，当菌株生长光密度(0D)达到0.5以上，接种二级种子罐，28-3(TC培养16-24小时，当菌 株生长光密度(0D)达到0. 5以上，准备接种发酵罐。 在获得发酵种子后，将其接种于发酵罐中，进行间歇式发酵。过程通常分为两个阶 段 (1)菌体生长阶段即让菌体在适合生长的条件下生长，直到菌体生长到一定程 度(如光密度大于0. 6)。 (2)生产阶段当菌体生长到预定程度(如光密度大于0.6)后，添加nCw烷烃，从 而在热代假丝酵母作用下生产a，"-正长链十六碳二元酸。 在本发明中，把生长好的种子接入pH4. 0-7. 0，最好为5. 5_6. 5的培养基中，发 酵培养基的组成葡萄糖10-50g/L，磷酸二氢钾l-12g/L，柠檬酸l-5g/L、氯化钠0. lg/L、 氨水流加维持浓度l-5卯m、辅酶Q100. OOlppm—-20卯m、生物素0. 001ppm-50卯m、镁离子 lppm-80卯m、锰离子l卯m-100卯m、铁离子lppm-1000ppm、铜离子0. 01ppm-30卯m、锌离子 0. 01ppm-28ppm，KN030 . 5-1. 5g/L，在25_35°C ，最好在28-32。C通风发酵140-170小时。4-6 小时开始流加葡萄糖，8小时开始流加氨水，20小时前，pH控制在4. 5，以菌体生长为主。当 菌体生长光密度大于0.6，开始流加烷烃，控制发酵液中烷烃浓度维持在5% (V : V)左右， 同时调节pH至7. 0，48小时内，每四小时用NaOH溶液调节pH至7. 0， 48-72小时，每四小时 用NaOH溶液调节pH至7. 5， 72-120小时，每四小时用NaOH溶液调节pH至7. 8， 120小时至 放罐，每四小时用NaOH溶液调节pH至8. 0. 28小时开始补加辅酶Q10，72小时开始补加磷 酸二氢钾，根据发酵情况适时补加硝酸钾，补加浓度为硝酸钾l-5g/L，硝酸钾l-8g/L。
在发酵过程中或发酵结束后，将生产的a ，"-正长链十六碳二元酸从发酵液中 分离出来，在发酵结束后，降温到l(TC，加入适量的氯化钠盐析，过滤，得到含菌体的二元酸 钠盐，加水升温95°C ，加入液碱调ph9. 0，活性炭脱色，酸化结晶，烘干得二元酸粗算，经过 冰醋酸精制得二元酸。总收率为92. 5% ，总酸为99. 0，单酸为97. 1 % ，含氮量2. 9ppm，都在 3ppm以下。用本发明发酵生产十六碳二元酸的方法，在20n^罐上发酵144小时，原液十六 烷二元酸含量高达190g/L以上，发酵重量转化率达90%以上，后处理收率大于92%，产品 纯度97%以上。 本发明充分分析了产二元酸酶系的特点，以磷酸盐、其他微量无机盐、葡萄糖、柠 檬酸、氯化钠、氨水为原料发酵培养基生产十六烷二元酸，在发酵培养基中不使用酵母膏、 玉米浆和尿素，最终产品含氮量低，产品纯度高，提高产品质量，扩大产品应用范围，而且科 学合理，方便操作，利于工业化操作。

下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1 (1)取一接种环菌种，涂布在克氏瓶麦芽汁斜面上29t:培养两天。 (2)取上述菌种斜面一个，用10ml无菌水将菌体全部洗下，接入装有300ml烷烃
种子培养基的5L三角瓶中，于29t:培养24小时。烷烃种子培养基的成分为蔗糖15g/L，
KH2P048g/L，酵母膏2g/L，玉米浆lg/L，尿素1. 5g/L， C16正烷烃40ml/L，自来水配置，pH自然。 (3)在装有16L培养基的30L发酵罐中，按10 %的接种量接入上述种子液，开始发 酵。发酵培养基成分为葡萄糖10g/L，柠檬酸3g/L， KH2P048g/L， NaCllg/L， KN037g/L氨水 流加、辅酶Q10补加5ppm、生物素l卯m、镁离子20卯m、锰离子10卯m、铁离子50卯m、铜离子 18卯m、锌离子25卯m，无菌水配制，pH自然。加入到空消后的发酵罐中。于29°C，600rpm，通 气量0. 8vvm，罐压1. OMpa条件下培养，5小时开始流加葡萄糖，8小时开始流加氨水，20小 时前，pH控制在4. 5，以菌体生长为主，当菌体生长光密度大于0. 6，开始流加烷烃，控制发 酵液烷烃浓度维持在5% (V : V)左右，同时调节pH至7.0，48小时内，每四小时用NaOH调 节pH至7. 0，72小时，每四小时用NaOH溶液调节pH至7. 5， 72-120小时，每四小时用NaOH 溶液调节pH至7. 8， 120小时至放罐，每四小时用NaOH溶液调节pH至8. 0。发酵至24， 48， 72小时时批式补加1% (W : V)的磷酸二氢钾和1X硝酸钾，发酵92小时时补加5ppm的辅 酶Q10，从接种到结束，总培养时间为142小时，发酵液中湿菌体80g/L，残烃3.4%，放罐体 积22L，加入烷烃总量4500ml，用乙醚萃取NaOH滴定法测定发酵原液DC16含量为186. 5g/ L，将培养基降温到15°C，向发酵液中按体积比加入15%的氯化钠，让十六烷二元酸钠盐全 部析出，并压滤得到滤饼，加水升温，加入液碱调ph9. 0，活性炭脱色，酸化结晶，烘干得二元 酸。冰醋酸精制，总收率为92. 5% ，总酸为99. 0，单酸为97. 1 % ，含氮量2. 9ppm。
实施例2 在装有3000L培养基的5000L发酵罐中，按10%的接种量接入实施例1中同比 放大的种子液，开始发酵。发酵培养基成分为葡萄糖10g/L，柠檬酸4g/L， KH2P048g/L， NaCllg/L， KN037g/L氨水流加、辅酶Q10补加l卯m、生物素10卯m、镁离子20卯m、锰离子 10卯m、铁离子150卯m、铜离子25卯m、锌离子l卯m，无菌水配制，pH自然。加入到空消后的 发酵罐中。于29t:，250rpm，通气量0. 65vvm，罐压1. OMpa条件下培养，4小时开始流加葡 萄糖，10小时开始流加氨水，20小时前，pH控制在4. 5，以菌体生长为主，当菌体生长光密 度大于0.6，开始流加烷烃，控制发酵液烷烃浓度维持在5% (V : V)左右，同时调节pH至 7. 0， 48小时内，每四小时用NaOH调节pH至7. 0， 72小时，每四小时用NaOH溶液调节pH至 7. 5,72-120小时，每四小时用NaOH溶液调节pH至7. 8， 120小时至放罐，每四小时用NaOH 溶液调节pH至8.0。发酵至24，48，72小时时批式补加5% (W : V)的磷酸二氢钾和2%硝 酸钾，发酵92小时时补加lppm的辅酶Q10，从接种到结束，总培养时间为142小时，发酵液 中湿菌体80g/L，残烃3. 4%，放罐体积22L，加入烷烃总量15001，用乙醚萃取NaOH滴定法 测定发酵原液D&e含量为186. 5g/L，将培养基降温到18°C，向发酵液中按体积比加入25% 的氯化钠，让十六烷二元酸钠盐全部析出，并压滤得到滤饼，加水升温，加入液碱调ph10，活
5性炭脱色，酸化结晶，烘干得二元酸。冰醋酸精制，总收率为93. 5%，总酸为99. 57，单酸为 98. 1%，含氮量2. 5ppm。
实施例3 在装有160001培养基的25000L发酵罐中，按10%的接种量接入实施例1中同 比放大的种子液，开始发酵。发酵培养基成分为葡萄糖10g/L，柠檬酸5g/L， KH2P048g/L， NaCllg/L， KN037g/L氨水流加、辅酶Q10补加10卯m、生物素.01卯m、镁离子20卯m、锰离子 10卯m、铁离子5ppm、铜离子l卯m、锌离子5ppm，无菌水配制，pH自然。加入到空消耗的发 酵罐中。于29°C ， 180rpm，通气量0. 5vvm，罐压1. OMpa条件下培养，4-6小时开始流加葡萄 糖，8小时开始流加氨水，20小时前，pH控制在4. 5，以菌体生长为主，当菌体生长光密度大 于0.6，开始流加烷烃，控制发酵液烷烃浓度维持在5% (V : V)左右，同时调节pH至7.0， 48小时内，每四小时用NaOH调节pH至7. 0， 72小时，每四小时用NaOH溶液调节pH至7. 5， 72-120小时，每四小时用NaOH溶液调节pH至7. 8， 120小时至放罐，每四小时用NaOH溶液 调节pH至8.0。发酵至24，48，72小时时批式补加5% (W : V)的磷酸二氢钾和6%硝酸 钾，发酵92小时时补加5ppm的辅酶Q10，从接种到结束，总培养时间为142小时，发酵液中 湿菌体80g/L，残烃3. 4% ，放罐体积22L，加入烷烃总量4500ml，用乙醚萃取NaOH滴定法测 定发酵原液D&e含量为186. 5g/L，将培养基降温到15°C，向发酵液中按体积比加入30%的 氯化钠，让十六烷二元酸钠盐全部析出，并压滤得到滤饼，加水升温，加入液碱调ph9. 0，活 性炭脱色，酸化结晶，烘干得二元酸。冰醋酸精制，总收率为94. 5% ，总酸为99. 7% ，单酸为 98. 5%，含氮量2. 2ppm。


本发明涉及一种正十六烷二元酸生产方法，属于化工技术领域，包括发酵转化和产物分离纯化，其特征在于发酵转化中培养基含有柠檬酸、氨水、辅酶Q10、生物素、铁离子、铜离子和锌离子，其中发酵过程中需要补加1-5g/l的磷酸盐和1-8g/l的硝酸盐；分离纯化采用盐析法，将发酵完的培养液降到15-20℃，直接加入重量浓度为5-30％氯化钠进行盐析预处理。科学合理，方便操作，获得的产品纯度高，含氮量低，提高产品质量，扩大产品应用范围。