专利名称：Apoe基因检测试剂盒及扩增方法和检测方法载脂蛋白E(apolipoproteinE, apoE)是血衆载脂蛋白一个重要组成部分，是1973年首先在正常人的极低密度脂蛋白(VLDL)中发现的，由299个氨基酸组成的单一多肽链，相对分子量为34kD的糖蛋白。人类apoE主要存在于VLDL、LDL、CM和CM残骸(Chy1micronremm-ants)中，也存在于β -VLDL和HDL的亚类HDL1和HDLc中。它主要在肝脏合成，约占血浆apoE的2/3-3/4。ApoE是血浆中重要的载脂蛋白之一，对血脂代谢起重要的调节作用，近年来研究发现，APOE基因多态与冠心病、老年性痴呆(Alzheimer’ s, AD)及老化等疾病有关。Apo E是一个多态性蛋白，有三个常见的异构体，即E2、E3和E4，其基因APOE上存在 2 个 SNP 位点:Cysl 12Arg(rs429358)和 Argl58Cys (rs7412)，野生型基因为 Cysll2、Argl58，表达为E3蛋白；E4蛋白为rs429358突变，即Argl 12 ;E2蛋白为rs7412突变，即Cysl58。ApoE的主要生理功能是通过与LDL受体结合并参与LDL代谢过程，APOE基因的变异可影响LDL受体结合活性而影响脂质代谢，进而影响疾病的发生。
APOE基因上两个中国人常见SNP直接影响APOE酶的活性，影响多疾病的发生。本发明提供一种利用多重PCR结合分子开关技术对APOE基因进行基因检测的试剂盒及其多重PCR扩增方法和检测 方法。本发明采用的技术方案:一种APOE基因检测试剂盒，所述试剂盒包括检测基因APOE rs429358位点和rs7412位点的引物及内参引物。所述试剂盒包括检测APOE基因rs429358位点的两个正向引物、APOE基因rs7412位点的两个正向引物、APOE基因内参上游引物及一个反向共用引物。所述检测APOE基因rs429358位点的引物碱基序列如下所示:正向野生型引物:TGGGCGCGGACATGGAGGACGTGT正向突变型引物:TGGGCGCGGACATGGAGGACGTGC所述检测APOE基因rs7412位点的引物碱基序列如下所示:正向野生型引物:TCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAGC正向突变型引物:TCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAGT所述APOE基因内参上游引物和共用下游引物:正向内参引物:CCGCAGGGCGCTGATGGACGAGACCATG反向共用弓I物:CCCGCACGCGGCCCTGTTCCACCA。所述的APOE基因检测试剂盒所采用的检测方法，对受检样本DNA分别用野生型和突变扩增缓冲液进行扩增，在每个反扩增反应中同时对2个目的片段和I个内参片段进行扩增，扩增片段由大到小依次是:内对照398bp，rs429358264bp，rs7412129bp ;扩增后经凝胶电泳在紫外光下见到根据片段大小区分开的产物条带，根据条带的有无判断2个SNP位点的基因型。所述的APOE基因检测试剂盒的多重PCR扩增方法，包括以下步骤:预变性由1次循环构成，其条件为:温度为94°C，时间为5分钟；PCR扩增由30次循环构成，其条件为:变性:温度为94 °C，时间为30秒；退火:温度为65°C，时间为30秒；延伸:温度为72°C，时间为90秒；扩增结束后于4°C保存至电泳检测。本发明与现有技术相比具有下列优点和效果:(I)本发明采用多重PCR扩增技术，在一次PCR反应中对2个包含SNP位点的DNA片段和I个内参片段同时进行扩增，提高检测效率降低检测成本。(2)本发明采用SNP敏感性分子开关技术，使3’端不能与模板互补的引物所引发的扩增非成熟性终止，无法形成产物，避免假阳性结果的产生。(3)引入内参，为阴性结果的判读提供依据，避免假阴性结果的产生。(4)本发明扩增后只需通过DNA凝胶电泳及凝胶成像系统即可完成检测，不需添置贵重设备，快速，准确，灵敏，特异，重复性好，大幅降低了检测成本和操作复杂程度，适合临床和科研使用。(5)无需DNA提取，只需裂解全血细胞，将细胞裂解后的悬液加入反应体系即可完成扩增，免去DNA提取的步骤和成本并避免气溶胶污染。(6)本发明的试剂盒，分别提供野生型和突变型的2X扩增缓冲液，使用者只要全血裂解悬液和聚合酶即可进行扩增，减少了操作步骤，提高劳动速率，可以实现高效率检测。(7)本发明的试剂盒所提供的野生型和突变型2X扩增缓冲液，使用了不同颜色的扩增指示染料，方便加样时区分，避免人为错误。扩增后即可直接进行凝胶电泳，无需加A loading buffer,操作方便快捷。本发明公开了一种APOE基因检测试剂盒及扩增方法和检测方法。所述试剂盒对APOE基因上明显改变其产物活性的两个常见的多态性位点进行分型，包括rs429358SNP位点和rs7412SNP位点。试剂盒包含野生型2×扩增缓冲液、突变型2×扩增缓冲液、聚合酶，两种缓冲液中分别含有对应SNP野生型和突变型表型的序列特异性引物和内参引物，可在两个多重PCR反应中完成对上述两个SNP位点的分型，从而对APOE基因进行基因分型，为该基因所表达的酶的活性的预测提供分子生物学依据。