专利名称：一种用乙醇分级沉淀纯化dna的方法
本发明目的是提供一种乙醇分级沉淀纯化PCR扩增产物的方法，以及所述纯化方法适用于基于OLE方法的SNP分型检测的应用，该纯化方法具有成本低，操作简单方便，适用性广，所纯化制备的DNA纯度高，环境友好等特点。本发明采用的技术方案是一种用乙醇分级沉淀纯化DNA的方法，所述方法为(1)在PCR扩增产物中加入无水乙醇使得到的混合液乙醇体积终浓度为35 45%，在-20°C下沉淀后，离心收集上清液 A，丢弃杂质沉淀A ；所述PCR扩增产物中还包含0 0. 3mM焦磷酸(PPi)、0 20. OnM寡核苷酸引物链、0 26. 7 μ M核苷酸(dNTPs)和0 0. IU Taq聚合酶；⑵取所述的上清液A 中加入无水乙醇使得到的上清液A乙醇混合液中乙醇的体积终浓度为60 75%，在-20°C 下再沉淀后，离心，除去上清液B，收集沉淀B ； (3)取沉淀B用体积浓度为75%乙醇水溶液洗涤后，离心，除去上清液C，收集沉淀C ； (4) 50°C烘干沉淀C后，再加入TE溶液(pH = 8. 0 的10mWris-HCl，lmM EDTA)溶解，获得纯化后的DNA。所述步骤(1)在PCR扩增产物中加入无水乙醇使得到的混合液乙醇水溶液的体积终浓度优选为38 42 %，最优为40 %。所述步骤O)中上清液A加入乙醇水溶液使得到的上清液A乙醇混合液中乙醇的体积终浓度优选为63 70 %，最优为65 %。进一步，所述的用乙醇分级沉淀纯化DNA的方法推荐按如下步骤进行(1)在PCR扩增产物中加入无水乙醇使得到的混合液中乙醇体积终浓度为40%，在-20°C下沉淀池后，13000rpm离心IOmin收集上清液A，丢弃杂质沉淀A ；所述PCR扩增产物中还包含0 0. 3mM焦磷酸、0 20. OnM寡核苷酸引物链、0 沈.7 μ M核苷酸和0 0. IU Taq聚合酶； (2)所收集的上清液A中加入无水乙醇使得到的上清液A乙醇混合液中乙醇的体积终浓度为65%，在-20°C下再沉淀浊后，13000rpm离心，除去上清液B，收集沉淀B ； (3)沉淀B 用体积浓度为75%乙醇水溶液洗涤后，13000rpm离心lOmin，除去上清液C，收集沉淀C ； (4) 50°C烘干沉淀C后，再加入TE溶液(pH = 8. O的IOmM Tris-HCl, ImM EDTA)溶解，获得纯化后的DNA。所述PCR扩增产物按如下方法制备1)PCR反应体系人基因组DNA，引物，250 μ M 的 dNTPs，50mM KCl，IOmM Tris-HCl, 1. 5mM MgCl2 禾口 IU 的 Taq 聚合酶；所述 dNTPs 由下列组分构成62. 5 μ M 的 dATP、62. 5 μ M 的 dTTP、62. 5 μ M 的 dCTP 和 62. 5 μ M 的 dGTP ；2)PCR 扩增程序为94°C变性5min，然后是35个循环，每个循环为94°C变性lmin，55°C退火50s， 72°C延伸lmin，循环结束后，72°C再延伸lOmin，获得PCR扩增产物，4°C保存；所述PCR扩增产物中还包含O 0. 3mM焦磷酸、O 20. OnM寡核苷酸引物链、O 沈.7 μ M核苷酸和 O 0. IU Taq聚合酶，扩增结束后，用浓度为1. O%琼脂糖凝胶电泳确证PCR目的产物大小，备用。本发明所用的人基因组DNA浓度为lOng，所述的引物为终浓度IOOnM的上游引物 F2(5，GGGAATGGTGCTCAGTAAAC3，)和 IOOnM 的下游引物 R2(5，GCACTGAAAGTCCAAGGTCC3，)。本发明所述PCR扩增产物为185 2085bp。进一步，所述PCR扩增产物包含SNP位点。更进一步，所述PCR扩增产物大小72:3bps，包含1个SNP位点，所述SNP位点为 5’ _(G/G)T_3，SNP位点的具体位置对本发明没有影响，本发明的本质是一种纯化DNA的方法，SNP分型只是用来评价纯化方法。本发明所述含目的SNP位点的PCR扩增产物纯化后的DNA作为模板用于单标记延伸(OLE)反应。目的产物的特性描述片段大小72:3bps，含有1个编号为rsl816072的SNP位点， 该SNP位点是个A/G的变化(即有的人可能是一样的等位型AA或GG，有些人可能是不一样的等位型AG)，本发明所选用的样本是一个GG的等位型，紧邻SNP(rsl816072)位点是个碱基T，所以本样本rsl816072处是5’ - (G/G) T-3’。选用常用的4种不同的纯化方法对含目的SNP位点的PCR扩增产物进行纯化。所选用的方法和步骤如下①一步乙醇沉淀法在25 μ 1 PCR扩增产物中加入75 μ 1的无水乙醇至乙醇终体积浓度为75%左右，在-20°C下沉淀池后，13000rpm离心lOmin，除去上清， 沉淀中加入100 μ 1的体积浓度75%乙醇水溶液洗涤后，13000rpm离心lOmin，除去上清， 50°C烘干沉淀后，加入25 μ L的TE (Tris-EDTA)溶液溶解DNA备用。②DNA纯化柱法按产品说明将25 μ 1 PCR扩增产物中加入到DNA纯化柱(VI0GENE，Taiwan)中，放置5min后， 8000rpm离心lmin，除去滤过液，加入100 μ 1的洗涤液，放置Imin后，8000rpm离心lmin，除去滤过液，再13000rpm离心Imin除去余液，加入25 μ L的洗脱液，放置5min后，13000rpm 离心lmin，收集纯化后DNA样品。③酶切法25 μ 1 PCR扩增产物中加入1 μ 1的10Χ虾碱性磷酸酶反应缓冲液、IU的虾碱性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase, SAP) (Roche Molecular Biochemicals，USA)和 2U 的核酸外切酶(E. coli exonuclease I,Exo I) (USB,Cleveland, USA)，在37°C下消化Ih后，95°C下高温处理1. 5h使酶失活，获得纯化后DNA。 ④膜过滤法按产品说明将25 μ 1 PCR扩增产物中加入到过滤膜(Millipore，USA)上，放置5min后，8000rpm离心lmin，除去滤过液，加入100 μ 1的洗涤液，放置Imin后，8000rpm 离心lmin，除去滤过液，加入25 μ L的洗脱液即TE溶液(pH = 8. 0的IOmM Tris-HCl，ImM EDTA)，室温放置30min后，收集洗脱液，即为纯化后DNA样品。用OLE反应检测以上纯化后DNA的质量，以评价不同的纯化方法。进一步，对每种纯化后DNA模板均建立如下的2个OLE反应①反应1即dTTP反应配置20 μ 1的反应体系，内含2μ 1以上不同方法纯化后DNA模板(含约120ng的DNA)， IOOnM OLE 引物 B2TCAF(5，-CTCATTCCAATGGCAACTCTA_3，)(Invitrogen, Carlsbad, USA)(完全互补于紧邻在SNP rsl816072位置之3，端的序列)，15nM的Rl 10-ddATP (PerkinElmer, Boston, USA),4y 1 5X0LE溶液(内含反应缓冲液和高保真的DNA聚合酶I^pohq) (PharmacoGenetics Ltd.，Hong Kong)，50 μ M 的 dTTP ；②反应 2 即 dCTP 反应，与反应 1 即 dTTP反应一样，除了反应1中50 μ M的dTTP用50 μ M的dCTP替代。OLE反应程序为94°C 变性5min，然后是30个循环，每个循环包括94°C变性30s，55 °C退火40s，循环结束后，用 Victor-V型光谱仪(PerkinElmer，Boston，USA)测定反应1和反应2的荧光偏振值(激发波长480nm ；发射波长535nm)的变化情况。Rl 10-ddATP(用荧光染料RllO标记的ddATP) 带有荧光染料Rl 10，当其没有被聚合酶整合到DNA链上时(游离态)，荧光偏振值较低，而当其被聚合酶整合到DNA链上时(结合态)，荧光偏振值会升高，RllO-ddATP为双脱氧的核苷酸(终止型核苷酸)，一旦被整合到核苷酸链上，核苷酸链将不能继续被延伸。由于本发明所选用的样本在SNP位点处是5’ _(G/G)T_3’，所以，如图1所示，理论上讲，对于反应 1即dTTP反应，不会有OLE引物B2TCAF的延伸，RllO-ddATP为游离态，荧光偏振值会比较低，而对于反应2即dCTP反应，会有OLE引物B2TCAF的两个碱基的延伸，RllO-ddATP为结合态，荧光偏振值会比较高。对4种不同的纯化方法所获得的DNA模板，分别进行两个OLE 反应，检测荧光偏振值。如图2所示，纯化柱法纯化效果较好，所得的DNA模板经OLE反应后，显示dCTP反应和dTTP反应的荧光偏振值的差异最明显，区分度最大；其次是酶切法； 再接下去是膜过滤法；而一步乙醇沉淀法效果最差，其纯化获得的DNA模板，经OLE反应显示，dTTP反应和dCTP反应的荧光偏振值都是高的，由此体现出样品SNP分型是AG型，与实际不符(经DNA测序证实本样品实际的SNP分型是GG型)。综上可见，以上所测试的纯化方法种，纯化柱法效果最好，最能适宜于SNP分型，但是，纯化柱比较昂贵。为建立乙醇分级沉淀DNA来纯化PCR扩增产物用于SNP分型的方法，采取以下策略25 μ 1的PCR扩增产物中加入低浓度的乙醇，在-20 °C下沉淀池后，13000rpm离心lOmin，收集上清(丢弃杂质沉淀)，并加入高浓度的乙醇后，在_20°C下再沉淀池后， 13000rpm离心lOmin，除去上清，DNA沉淀中加入100 μ 1的体积浓度75%乙醇溶液洗涤后， 13000rpm离心lOmin，除去上清，50°C烘干沉淀后，加入25 μ L的TE溶液溶解DNA备用。然后对每种纯化后DNA模板均建立如上所述的2个OLE反应(dTTP反应和dCTP反应)以评估纯化效果。结果如图3所示先采用终体积浓度为40%的乙醇沉淀去除杂质，再用终体积浓度为65%的乙醇沉淀DNA效果最好，纯化所得的DNA模板经OLE反应后，显示dCTP反应和 dTTP反应的荧光偏振值的差异最明显，区分度最大，其结果可与纯化柱法的结果相媲美，而成本却比纯化柱法远远要低；先采用终体积浓度为35%的乙醇沉淀去除杂质，再用终体积浓度为65%的乙醇沉淀DNA的效果次之；其他的分级沉淀纯化方法效果都不好。综上可见， 从OLE分型检测的效果来看，采用先40%乙醇沉淀去杂再用65%的乙醇沉淀DNA的方法完全可以取代昂贵的纯化柱法。为考察乙醇分级沉淀法去除核苷酸(dNIPs)的效果，建立以下反应体系用以上阐述的常规PCR条件，PCR扩增含目的SNP位点的F2-R2片段，PCR产物先用纯化柱法进行纯化(根据以上的试验结果可知，纯化后的DNA片段质量较好)，然后，配置4种DNA模板①纯化后的DNA中不额外加入dNIPs ；②纯化后的DNA中额外加入终浓度为0. 267 μ M 的dNIPs ；③纯化后的DNA中额外加入终浓度为2. 67 μ M的dNIPs ；④纯化后的DNA中额外加入终浓度为26. 7 μ M的dNIPs。对以上4种DNA模板分别进行2个OLE反应(dTTP反应和dCTP反应)，评估dNIPs杂质对OLE反应的影响。如图4中的A所示，不额外加入杂质 dNTPs的模板，dCTP反应和dTTP反应的荧光偏振值的差异较明显，区分度较大，SNP分型较好；少量dNIPs杂质(0. 267 μ Μ)对SNP分型影响不大；而当杂质dNIPs增加到2. 67 μ M时， dCTP反应和dTTP反应的荧光偏振值的差异明显缩小，区分度不明显，SNP分型不理想；当杂质dNIPs浓度进一步增加到26. 7 μ M，对SNP分型的影响加剧。综上可见，DNA模板中的高浓度杂质dNIPs会干扰OLE反应中的dTTP和dCTP的特异性识别区分SNP位点的碱基，从而影响SNP分型。进一步，按以上方法制备含杂质dNIPs浓度为沈.7 μ M的DNA模板，然后分别用不同的方法纯化此DNA模板①不进一步纯化(对照)；②纯化柱法进行纯化(另一对照)； ③酶切法纯化；④乙醇分级沉淀法即先40 %乙醇沉淀去杂再用65 %的乙醇沉淀DNA的方法纯化。然后，对以上4种DNA模板分别进行2个OLE反应(dTTP反应和dCTP反应)，评估不同纯化方法去除杂质dNIPs的效果。结果如图4中的B所示，不进一步纯化的DNA模板， dCTP反应和dTTP反应的荧光偏振值的差异很小，区分不明显，SNP分型不好；而经所选的3 种不同纯化方法的纯化，SNP分型均比较理想。综上可见，①纯化柱法、酶切法和乙醇分级沉淀法均能较好的去除dNIPs ；②3种方法的纯化效果差不多；③乙醇分级沉淀法完全可以替代昂贵的纯化柱法和酶切法来去除dNIPs。为考察乙醇分级沉淀法去除焦磷酸(PPi)的效果，建立以下反应体系用以上阐述的常规PCR条件，PCR扩增含目的SNP位点的F2-R2片段，PCR产物先用纯化柱法进行纯化(根据以上的试验结果可知，纯化后的DNA片段质量较好)，然后，配置4种DNA模板① 纯化后的DNA中不额外加入PPi ；②纯化后的DNA中额外加入终浓度为0. 003mM的PPi ；③ 纯化后的DNA中额外加入终浓度为0. 03mM的PPi ；④纯化后的DNA中额外加入终浓度为 0. 3mM的PPi ；⑤纯化后的DNA中额外加入终浓度为3mM的PPi。对以上5种DNA模板分别进行2个OLE反应(dTTP反应和dCTP反应)，评估PPi杂质对OLE反应的影响。如图5A所示，不额外加入杂质PPi的模板，dCTP反应和dTTP反应的荧光偏振值的差异较明显，区分度较大，SNP分型较好；少量PPi杂质(0. 003mM)对SNP分型基本没有影响；进一步增加PPi 的浓度(0. 03mM)，dCTP反应和dTTP反应的荧光偏振值的差异缩小，区分度变小，对SNP分型的有影响；而当杂质PPi增加到0. 3mM或进一步增加到3mM时，dCTP反应和dTTP反应的荧光偏振值均很低(高浓度PPi会抑制OLE反应中的引物延伸)，导致不能SNP分型。综上可见，DNA模板中的高浓度杂质PPi会抑制OLE反应中的OLE引物链延伸的正向反应，从而影响SNP分型。进一步，按以上方法制备含杂质PPi浓度为0. 3mM的DNA模板，然后分别用不同的方法纯化此DNA模板①不进一步纯化(对照)；②纯化柱法进行纯化(另一对照)；③酶切法纯化；④乙醇分级沉淀法即先40%乙醇沉淀去杂再用65%的乙醇沉淀DNA的方法纯化。 然后，对以上4种DNA模板分别进行2个OLE反应(dTTP反应和dCTP反应)，评估不同纯化方法去除杂质PPi的效果。结果如图5中的B所示，不进一步纯化的DNA模板，dCTP反应和dTTP反应的荧光偏振值均很低，不能SNP分型；而酶切法也不能去除杂质PPi，dCTP反应和dTTP反应的荧光偏振值也均很低，也不能SNP分型；而纯化柱法和乙醇分级沉淀法均能较好的去除杂质PPi，SNP分型均比较理想。综上可见，①纯化柱法和乙醇分级沉淀法均能较好的去除PPi ；②2种方法的纯化效果差不多；③乙醇分级沉淀法完全可以替代昂贵的纯化柱法去除PPi。为考察乙醇分级沉淀法去除Taq DNA聚合酶(Taq)的效果，建立以下反应体系 用以上阐述的常规PCR条件，PCR扩增含目的SNP位点的F2-R2片段，PCR产物先用纯化柱法进行纯化(根据以上的试验结果可知，纯化后的DNA片段质量较好)，然后，配置4种DNA 模板①纯化后的DNA中不额外加入Taq ；②纯化后的DNA中额外加入终浓度为0. 0001U的 Taq ；③纯化后的DNA中额外加入终浓度为0. OOlU的Taq ；④纯化后的DNA中额外加入终浓度为0. OlU的I1aq ；⑤纯化后的DNA中额外加入终浓度为0. IU的hq。对以上5种DNA模板分别进行2个OLE反应(dTTP反应和dCTP反应)，评估Taq杂质对OLE反应的影响。如图 6A所示，不额外加入杂质Taq的模板，dCTP反应和dTTP反应的荧光偏振值的差异较明显， 区分度较大，SNP分型较好；少量Taq杂质(0. 0001U和0. 001U)对SNP分型基本没有影响； 进一步增加Taq的浓度至0. 01U, dCTP反应和dTTP反应的荧光偏振值的差异有所缩小，区分度变小，对SNP分型的有点影响；而当杂质Taq增加到0. IU，dCTP反应和dTTP反应的荧光偏振值差异进一步缩小，对SNP分型影响加剧。综上可见，由于普通PCR所用的常规Taq 聚合酶不是严格保真的聚合酶，DNA模板中高浓度杂质Taq的存在会导致OLE反应中的非特异性扩增，从而引起dTTP反应(理论上的阴性反应)的荧光偏振值错误的增加，影响SNP 分型。进一步，按以上方法制备含杂质Taq浓度为0. IU的DNA模板，然后分别用不同的方法纯化此DNA模板①不进一步纯化(对照)；②纯化柱法进行纯化(另一对照)；③酶切法纯化；④乙醇分级沉淀法即先40%乙醇沉淀去杂再用65%的乙醇沉淀DNA的方法纯化。 然后，对以上4种DNA模板分别进行2个OLE反应(dTTP反应和dCTP反应)，评估不同纯化方法去除杂质Taq的效果。结果如图6中的B所示，不进一步纯化的DNA模板，dCTP反应和dTTP反应的荧光偏振值差异很小，不能SNP分型；而酶切法不能去除杂质Taq，dCTP反应和dTTP反应的荧光偏振值差异也很小，也不能SNP分型；而纯化柱法和乙醇分级沉淀法均能较好的去除杂质Taq，SNP分型均比较理想。综上可见，①纯化柱法和乙醇分级沉淀法均能较好的去除Taq ；②2种方法的纯化效果差不多；③乙醇分级沉淀法完全可以替代昂贵的纯化柱法去除Taq。为考察乙醇分级沉淀法去除PCR引物的效果，建立以下反应体系用以上阐述的常规PCR条件，PCR扩增含目的SNP位点的F2-R2片段，PCR产物先用纯化柱法进行纯化(根据以上的试验结果可知，纯化后的DNA片段质量较好)，然后，配置4种DNA模板①纯化后的DNA中不额外加入PCR引物；②纯化后的DNA中额外加入终浓度为0. 200nM的PCR引物(0. IOOnM的上游引物F2和0. IOOnM的下游引物R2)；③纯化后的DNA中额外加入终浓度为 2. OOnM的PCR引物(1. OOnM的上游引物F2和1. OOnM的下游引物R2)；④纯化后的DNA中额外加入终浓度为20. OnM的PCR引物(10. OnM的上游引物F2和10. OnM的下游引物R2)。 对以上4种DNA模板分别进行2个OLE反应(dTTP反应和dCTP反应)，评估PCR引物杂质对OLE反应的影响。如图7中的A所示，不额外加入杂质PCR引物的模板，dCTP反应和dTTP 反应的荧光偏振值的差异较明显，区分度较大，SNP分型较好；少量PCR引物杂质(0. 200nM) 对SNP分型没有影响；而当杂质PCR引物增加到2. OOnM时，dCTP反应和dTTP反应的荧光偏振值的差异有所缩小，区分度有所减小，SNP分型仍然可以；当杂质PCR引物进一步增加到20. OnM，对SNP分型的影响有所加剧。综上可见，由于DNA模板中的高浓度的PCR引物杂质会与OLE反应中的OLE引物形成竞争而影响OLE引物与模板DNA的杂合，从而影响SNP 分型。进一步，按以上方法制备含PCR引物杂质浓度为20. OnM的DNA模板，然后分别用不同的方法纯化此DNA模板①不进一步纯化(对照)；②纯化柱法进行纯化(另一对照)； ③酶切法纯化；④乙醇分级沉淀法即先40 %乙醇沉淀去杂再用65 %的乙醇沉淀DNA的方法纯化。然后，对以上4种DNA模板分别进行2个OLE反应(dTTP反应和dCTP反应)，评估不同纯化方法去除PCR引物杂质的效果。结果如图7中的B所示，不进一步纯化的DNA模板，dCTP反应和dTTP反应的荧光偏振值的差异最小，区分度一般，SNP分型效果一般；而经所选的3种不同纯化方法的纯化，SNP分型均比较理想。综上可见，①纯化柱法、酶切法和乙醇分级沉淀法均能较好的去除PCR引物；②3种方法的纯化效果差不多；③乙醇分级沉淀法完全可以替代昂贵的纯化柱法和酶切法来去除PCR引物。与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在提供了一种乙醇分级沉淀纯化 PCR扩增产物的方法，该方法能有效去除PCR反应后的主要杂质焦磷酸(PPi)、多余的PCR 引物、多余的核苷酸(dNTPs)和DNA聚合酶，所述的乙醇分级沉淀方法所纯化的DNA模板适用于基于OLE方法的SNP分型检测的应用。该纯化方法具有成本低，操作简单方便，适用性广，所纯化制备的DNA纯度高，环境友好等特点，在生物技术和生物工程领域的高纯度DNA 制备方面具有广阔的应用前景。图10LE反应的流程示意图； 图2基于OLE反应评价的常见纯化方法纯化PCR产物的效果；图3基于OLE反应评价的乙醇分级沉淀法纯化PCR产物的效果；图4基于OLE反应评价的乙醇分级沉淀法去除dNIPs的效果，其中A为不同量的 dNTPs杂质对OLE反应的影响；图5基于OLE反应评价的乙醇分级沉淀法去除PPi的效果，其中A为不同量的PPi 杂质对OLE反应的影响，B为乙醇分级沉淀法去除DNA模板中PPi杂质的性能；图6基于OLE反应评价的乙醇分级沉淀法去除Taq聚合酶的效果，其中A为不同量的Taq酶杂质对OLE反应的影响，B为乙醇分级沉淀法去除DNA模板中Taq酶杂质的性能；图7基于OLE反应评价的乙醇分级沉淀法去除PCR引物的效果，其中A为不同量的引物杂质对OLE反应的影响，B为乙醇分级沉淀法去除DNA模板中引物杂质的性能；图8基于OLE反应评价的乙醇分级沉淀法纯化不同长度的PCR产物的效果。集纯化后DNA样品。③酶切法25μ 1实施例1方法制备的PCR扩增产物中加入1μ 1的10Χ虾碱性磷酸酶反应缓冲液、IU的虾碱性磷酸酶(shrimp alkalinephosphatase, SAP) (Roche Molecular Biochemicals，USA)和 2U 的核酸外切酶(Ε· coli exonuclease I,Exo I) (USB, Cleveland, USA)，在37°C下消化Ih后，95°C下高温处理1. 5h使酶失活后即获得纯化DNA。④膜过滤法按产品说明将实施例1方法制备的25 μ 1 PCR扩增产物加入到过滤膜(Millipore, USA)上，放置5min后，8000rpm离心lmin，除去过滤液，加入100 μ 1的洗涤液(Millipore, USA)，放置Imin后，8000rpm离心Imin,除去过滤液，加入25 μ L的洗脱液即TE溶液(pH = 8. 0的IOmM Tris-HCl, ImM EDTA)，室温放置30min后，收集洗脱液，即为纯化后DNA样品。实施例3 纯化DNA用于SNP分型的OLE反应对每种纯化方法制备的DNA模板均建立如下的2个OLE反应①反应1即dTTP反应配置20 μ 1的反应体系，内含2μ 1纯化制备的DNA 模板(含约 120ng 的 DNA)，IOOnM OLE 引物 B2TCAF(5，-CTCATTCCAATGGCAACTCTA-3，) (Invitrogen, Carlsbad, USA)(完全互补于紧邻在SNP rsl816072位置之3，端的序列)，15nM 的 Rl 10-ddATP(PerkinElmer，Boston, USA),4 μ 1 5XOLE 溶液(内含反应缓冲液禾口高保真的 DNA 聚合醇 TopoTaq) (PharmacoGenetics Ltd. , Hong Kong)，50 μ M 的 dTTP (Invitrogen, Carlsbad, USA)；②反应2即dCTP反应，与反应1即dTTP反应一样，除了反应1中50 μ M的dTTP 用 50 μ M 的 dCTP (Invitrogen, Carlsbad, USA)替代。OLE反应程序为94°C变性5min，然后是30个循环，每个循环包括94°C变性30s， 55°C退火40s，循环结束后，用Victor-V型光谱仪(PerkinElmer，Boston, USA)测定反应1 和反应2的荧光偏振值(激发光波长480nm ；发射光波长535nm)的变化情况。实施例4乙醇分级沉淀法对含目的SNP位点的PCR扩增产物的纯化程序取实施例1方法制备的25 μ 1的PCR扩增产物分成6组，每组分别加入无水乙醇使乙醇终体积浓度为0、0、25%、35%、40%、50% (如图3所示)，分别在_20°C下沉淀浊后， 13000rpm离心lOmin，收集上清(丢弃杂质沉淀)，并分别加入无水乙醇使乙醇终体积浓度分别为75%、65%、65%、65%、65%、65% (如图3所示)后，分别在_20°C下再沉淀2h后， 13000rpm离心lOmin，除去上清，DNA沉淀中加入100 μ 1的质量浓度75%乙醇水溶液洗涤后，13000rpm离心lOmin，除去上清，50°C烘干沉淀后，加入25 μ L的TE溶液(pH = 8. 0的 IOmM Tris-HCiamM EDTA)溶解DNA，获得6组纯化后的DNA，分别按照实施例3所述的方法进行OLE反应，荧光偏振值见图3所示。实施例5 DNA模板中不同的杂质对基于OLE反应的SNP分型的影响用于OLE反应的DNA模板的制备按实施例1的方法进行PCR扩增，再按实施例2 中纯化柱法进行纯化，纯化后的DNA模板分成18组(组1 组18)，组1 组4分别加入不同浓度的dNTPs (0,0. 267 μ Μ、2. 67 μ M和26. 7 μ Μ)、组5 组9分别加入不同浓度的PPi (0、 0. 003mM、0. 03mM、0. 3mM和3mM)、组10 组14分别加入不同量的Taq聚合酶(0、0. 0001U、 0. 001U、0. OlU和0. 1U)和组15 组18分别加入不同浓度的PCR引物(0,0. 200nM(0. IOOnM 的 F2 和 0. IOOnM 的 R2)、2. OOnM (1. OOnM 的 F2 和 1. OOnM 的 R2)和 20. OnM (10. OnM 的 F2 和 10. OnM 的 R2))。上述18组模板，按实施例3的方法分别进行OLE反应，观察SNP分型情况以评估不同量的杂质对OLE反应的影响。结果如图4中A、图5中A、图6中A和图7中A所示，低浓度的杂质，如 0. 267μΜ 的 dNTPs、0. 003mM 的 PPi、0. 0001U 和 0. 001U 的 Taq 或 0. 200nM 的PCR引物，对OLE反应没有影响，SNP分型比较清晰准确；当杂质浓度增加，如2. 67 μ M的 dNTPs,0. 03mM 的 PPi、0. OlU 的 Taq、或 2. OOnM 和 2. OOnM 的 PCR 引物，对 OLE 反应产生影响，从而导致SNP分型区分度下降；而当杂质浓度进一步增加，如沈.7 μ M的dNTPs、0. 3mM和3mM的PPi或0. IU的hq，对OLE反应产生非常明显的影响，甚至会产生错误的SNP分型 (与理论不符)。实施例6乙醇分级沉淀法去除DNA模板中杂质的性能按实施例1的方法进行PCR扩增，再按实施例2中纯化柱法进行纯化，纯化后的 DNA模板分成4组(组a 组d)，组a中加入终浓度为沈.7 μ M的dNTPs、组b中加入终浓度为0. 3mM的PPiJi c中加入终浓度为0. IU的Taq聚合酶、组d中加入终浓度为20. OnM 的PCR引物(10. OnM的上游引物F2和10. OnM的下游引物R2)，对以上制备的4组含杂质的DNA分别进行乙醇分级沉淀法进行纯化，即25 μ 1上述DNA溶液(组a 组d)中分别加入乙醇，使混合液汇总乙醇体积终浓度为40%，分别在-20°C下沉淀池后，13000rpm离心 IOmin,收集上清(丢弃杂质沉淀)，并加入乙醇使混合液中乙醇体积终浓度为65%，再分别在-20°C下再沉淀2h后，13000rpm离心lOmin，除去上清，DNA沉淀中分别加入100 μ 1的体积浓度75%乙醇水溶液洗涤后，13000rpm离心lOmin，除去上清，50°C烘干沉淀后，加入 25 μ L 的 TE 溶液(pH = 8. 0 的 IOmM Tris-HCl, ImM EDTA)溶解 DNA，获得 4 组纯化后的 DNA 模板(组a 组d)，备用。将上述纯化后的DNA模板(组a 组d)按实施例3的方法分别进行OLE反应，同样条件下按照实施例2中的方法②和③及不纯化的模板作为对照，观察SNP分型情况以评估乙醇分级沉淀法去除DNA模板中杂质的性能。结果如图4中B、图5中B、图6中B和图 7中B所示，含有杂质的DNA模板若不进行纯化，OLE反应后的SNP分型不好，甚至会产生错误的分型结果；含杂质的DNA模板经乙醇分级沉淀法纯化后，OLE反应后的SNP分型比较清晰、理想，均与事实相符，而且，乙醇分级沉淀法纯化的DNA模板的分型效果与商业化的纯化柱法纯化的相当。实施例7乙醇分级沉淀法纯化不同长度DNA模板的效果分别采用不同的配对引物，按实施例1的方法PCR扩增不同长度的目的DNA 上游引物 F2D(5，-TCAGGATGCGTTATTGGATAGT-3，) (Invitrogen, Carlsbad, USA)和下游引物R2配对用于扩增185bps的目的DNA，上游引物F2C(5，-ACCAAGGTTTTATGGGCGTGC T-3，) (Invitrogen, Carlsbad, USA)和下游引物R2配对用于扩增359bps的目的DNA, 上游引物 F2B(5，-TACGTATGATACAGGATCATCC-3，) (Invitrogen, Carlsbad, USA)和下游引物R2配对用于扩增4^bps的目的DNA，上游引物F2和下游引物R2配对用于扩增 723bps 的目的 DNA，上游引物 F2 和下游引物 R2N(5，-CCTAATGGGGGAGTTTGAAC-3，) (Invitrogen, Carlsbad, USA)配对用于扩增1078bps的目的DNA，上游引物F2D和下游引物 R4N(5，-CTTAATAGCTGGAAAGGTGAT-3，)(Invitrogen, Carlsbad,USA)配对用于扩增 1534bps 的目的DNA，上游引物F2和下游引物R4N配对用于扩增208^ps的目的DNA，所扩增的目的 DNA均含有同一 SNP位点rsl816072。对上述含有不同长度目的DNA片段的PCR扩增产物按实施例6中的乙醇分级沉淀方法进行纯化，然后，对纯化后不同长度的DNA模板按实施例3的方法进行OLE反应，评估乙醇分级沉淀方法纯化不同长度DNA的效果。结果如图8所示，不同长度的DNA模板，经 OLE反应，显现出一致的SNP分型结果，每种模板的2个OLE反应间的区分度基本一致，可见，先40%的乙醇沉淀去杂再65%的乙醇沉淀DNA的分级沉淀方法适用于纯化不同长度的 PCR扩增产物，所纯化的DNA能被较好地用于基于OLE反应的SNP分型。
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本发明公开了一种用乙醇分级沉淀纯化DNA的方法(1)在PCR扩增产物中加入无水乙醇使得到的混合液乙醇体积终浓度为35～45％，在-20℃下沉淀后，离心收集上清液A，丢弃杂质沉淀A；(2)取所述的上清液A中加入无水乙醇使得到的上清液A乙醇混合液中乙醇的体积终浓度为60～75％，在-20℃下再沉淀后，离心，除去上清液B，收集沉淀B；(3)取沉淀B用体积浓度为75％乙醇水溶液洗涤后，离心，除去上清液C，收集沉淀C；(4)50℃烘干沉淀C后，再加入TE溶液溶解，获得纯化后的DNA；本发明纯化方法成本低，操作简单方便，适用性广，所纯化制备的DNA纯度高，环境友好等，具有广阔的应用前景。