专利名称：人乳头瘤病毒(hpv)16,18型多通道荧光pcr检测方法与试剂盒的制作方法宫颈癌是女性常见恶性肿瘤之一，在全球范围内，每年约有20万女性死于宫颈癌其发病率仅次于乳腺癌，居全世界女性恶性肿瘤的第二位。在中国每年新发现病例达13万多，。宫颈癌是目前唯一找出治病原因的癌症。1995年世界卫生组织(WHO)将人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)的感染确定为宫颈癌的治病原因。有研究统计，有99.7%的的宫颈癌患者存在人乳头瘤病毒病毒的感染。人乳头瘤病毒是一种具有种属特异性的嗜上皮病毒，为双链闭环的小DNA病毒，约有8000个碱基对。其中包括8个早期开放读码框架(E1-E8)、2个晚期读码框架和I个非编码长控区。E6和E7基因 对细胞生长刺激最为重要，E6、E7编码的蛋白引起宫颈细胞的永生化。人乳头瘤病毒是一组病毒的总称，其病毒形态类似，但各个型别的DNA限制性内切酶图谱有差异，核壳体蛋白质和抗原性不同。目前确定的HPV型别达100多种，其中根据感染部位不同可分为皮肤型HPV和生殖道上皮HPV，据统计感染妇女生殖道的型别约有35种，其中20种与肿瘤的发生有关。HPV根据与肿瘤的发生的危险性高低可分为高危型和低位型HPV，低位型别HPV包括HPV6、11、42、43、44等型别，能够引起外生殖器湿疣等良性病变，高危型的 HPV 包括 HPV16、18、31、33、39、45、51、52、56、58、59、68 等型别。高危型别的 HPV 能够引起宫颈癌及宫颈上皮瘤变，尤其是HPV16U8。在HPV引起的宫颈癌患者中有2/3患者是由HPV16U8引起的。大多数新发现的HPV感染者可以通过自身免疫作用的清除实现自愈，但是如果是持续感染则可引起一系列的癌前病变，如果仍未接受治疗，可能发展为癌症，尤其是HPV16、18的持续感染。HPV的初期感染没有明显的临床症状，但在短期内可以检出HPV。因此对高危型HPV检测用于宫颈癌的早期筛查具有显著的临床意义，从而浓缩高风险人群，进行有效的监控、早期发现宫颈癌。2005年，国际癌症研究机构和世界卫生组织推荐HPV检测用于宫颈癌筛查。目前，宫颈癌的筛查方法有细胞学方法、肉眼筛查法和HPV DNA检测。各国推荐HPVDNA检测与细胞学检查想结合是宫颈癌的最佳方案。其中HPV DNA检测方法是针对于高危型的HPV，方法有DNA印迹法、原位杂交法、杂交捕获法、基因芯片法和荧光PCR法，其中荧光PCR法相对于其他几种方法具有快速、简便、准确、成本低、适合群体筛查的优点。实时荧光PCR具有上述特点，其关键是需要设计高特异性、高灵敏度的引物和探针以及优化的反应体系与扩增程序，这样才能真正的成为高特异性和高灵敏度的检测方法。另外，针对多亚型的检测若能同时在一个PCR反应管中将不同亚型的准确的区分开对引物和探针的要求则需更高，并且需要更加优化的反应体系和反应条件。高危型HPV16、18自身存在多态性，尤其是HPV16，根据地域的可分为欧洲型(E)、非洲型(Af)、亚洲型(As)、以及亚美型(A-A)，这些变异可导致某些人群罹患宫颈疾病的风险增加。通过测序发现检测病毒基因组变异发现HPV各型的非编码区级E1、E6、E7和LI区均有保守序列。通用引物一般选择在El和LI区，而特异性引物则在E6和E7区。实时荧光PCR反应是在常规PCR的一对引物基础上加入荧光探针或荧光染料，通过荧光PCR仪实时检测PCR反应过程中荧光的变化。目前，临床诊断中荧光PCR反应用到Taqman探针比较多。Taqman探针为一寡核苷酸，探针的5’端标记一个报告突光基团和3’端一个淬灭荧光基团。PCR未扩增是时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’至3’外切酶活性将5’端报告基团从探针上切割下来游离于反应体系中，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光PCR仪的荧光探测系统能够实时检测荧光的变化。即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。因此，通过荧光PCR仪可以定时动态检测没一循环，并绘出扩增曲线。最后通过突光阈值(Threshold)的设定获得CT值(Cycle Threshold),从而对样本进行定性定量检测。多通道荧光PCR检测是基于单通道PCR的基础上建立起来的，其通过在同PCR反应单管中加入一对通用引物或一对以上的特异引物，并加入一对以上不同荧光标记的探针，利用多通道荧光PCR仪分别检测不同的荧光信号，从而做到能够在同一 PCR反应管中监测到不同的PCR产物扩增情况。多通道荧光PCR检测相对于单通道检测有众多优点，如方便、快速、效率高、节约成本。
本发明是基于Taqman探针技术和多重PCR技术建立了一套人乳头瘤病毒(HPV) 16、18多通道荧光PCR检测方法与试剂盒。本发明实现了快速、简便、高效的检测并区分HPV 16、18高危型别。为达到上述目 的，本发明的采用的技术方案是:1.针对HPV 16型，在其E6区域设计了一对特异性的扩增引物和特异性探针，扩增片段长度为94bp。引物探针序列如下: HPV16F: 5 ’ AGAGGAGGAGGATGAAATAGATGGT3，HPV16R: 5 ’ AGAGTCACACTTGCAACAAAAGGT3，HPV16P: 5 ’ ACAAGCAGAACCGGACAGAGCCCAT3 ’2.针对HPV18，在其El区域设计了一对特异性的扩增引物和特异性探针，扩增片段长度为171bp。引物和探针如下:HPV18F: 5 ’ ATTTTGTGAACAGGCAGAGCTAGA3 ’HPV18R:5’ AACCGTGGACTTAACTCTGTATCCA3’HPV18P:5’ ACAGCACAGGCATTGTTCCATGCG3’3.本试剂盒使用了管家基因三磷酸甘油醒脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase, GAPDH)作为内参对照，设计了一对特异性引物和特异性探针，单独放在一PCR单管中扩展，扩增片段长度为。设置内参对照可以检测每个样本的取样和提取前的效果，从而有效的降低了假阴性的出现，使实验结果更加可信。GAPDH的扩增出来的片段长度为108bp，特异性引物和探针序列如下:GAPDHF:5’ TGTGGCTCCCTTGGGTATATG3’GAPDHR:5，CATCGCCCCACTTGATTTTG3’GAPDHP:5，CCCCCACCCCCATAGGCGAGAT3’4.试剂盒中设置了阳性校准品和阴性对照。阴性对照为超纯水。阳性校准品的制备是根据HPV16引物(HPV16 F、HPV16 R)、HPV18引物(HPV18 F、HPV18 R)和内参对照GAPDH引物(GAPDH F、GAPDH R)扩增的3段序列而合成的3条核苷酸片段。核苷酸片段序列如下:HPV16 E7 Seq:AGAGGAGGAGGATGAAATAGATGGTCCAGCTGGACAAGCAGAACCGGACAGAGCCCAT TACAATATTGTAACCTTTTGTTGCAAGTGTGACTCT HPV18 El Seq:ATTTTGTGAACAGGCAGAGCTAGAGACAGCACAGGCATTGTTCCATGCGCAGGAGGTCCACAATGATGCACAAGTGTTGCATGTTTTAAAACGAAAGTTTGCAGGAGGCAGCACAGAAAACAGTCCATTAGGGGAGCGGCTGGAGGTGGATACAGAGTTAAGTCCACGGTTGAPDH Seq:TGTGGCTCCCTTGGGTATATGGTAACCTTGTGTCCCTCAATATGGTCCTGTCCCCATCTCCCCCCCACCCCCATAGGCGAGATCCCTCCAAAATCAAGTGGGGCGATG5.根据不同的荧光定量PCR仪器，从以下荧光基团中选择分布于不同的仪器检测通道的荧光进行组合。荧光的发光基团为FAM、TET、JOE、CY3、CY5、CY5.5、Fluorescein、Rhodamine、Rhodamine 6G、Orengon Greeen 488、Orengon Greeen 500、Orengon Greeen514、Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine Orange、ROX 中的任意一种，突光粹灭基团为DABCYL、DABSYL, TAMRA, BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3的任意一种或一种以上组合。6.本试剂盒每个样品分2管检测。其中一管为双通道检测，检测HPV 16,18型；另一管为单通道检测，检测内参基因GAPDH。因此，试剂盒在选择优化的探针组合:HPV16 P用 FAM-TMARA 标记、HPV18 P 用 J0E-TMARA 标记、GAPDHP 用 FAM-TMARA 标记。7.本试剂盒的组分包括PCR反应液1、PCR反应液2、HPV16U8型探针、内参荧光探针、Mgcl2、Taq酶、DNA提取液、阳性校准品、临界阳性校准品、阴性对照。8.本试剂盒PCR缓冲液I和PCR缓冲液2中均包含Tris-HCL缓冲液(PH8.3)、KCL、d(AGC) TP、dUTP 和引物。其中 PCR 缓冲液 I 中包含引物 HPV16 F、HPV16 R、HPV18 F、HPV18 R, PCR 反应液 2 包含 GAPDH F、GAPDH R。9.本试剂盒中Taq酶中加入了 UNG酶，用dUTP代替了 dTTP其目的在于防止扩增前污染。在50°C情况下UNG酶可以水解扩增反应前反应体系中包含有dUTP的DNA模板，从而有效的防止了扩增前的污染。10.该设计盒的扩增程序根据不同的荧光PCR仪不同略有不同。如针对ABI7500荧光检测系统程序优化如下:程序段一:50°C 2min，程序段二:94°C 5min，程序段三:94°C 15s, 60°C 45s, 40个循环，每个循环在60°C荧光检测。若为空气加热的仪器，程序段三60°C延伸的时间可以缩短到30s。

本发明提供了一种人乳头瘤病毒(HPV)16，18型多通道荧光PCR检测方法与试剂盒。本检测方法针对HPV 16，18的DNA序列分别设计了2对特异性引物和2条Taqman引物探针，利用不同的荧光基团组合进行标记探针，从而在同一扩增管中准确的检测并区分出HPV16，18感染。同时，该方法利用人的管家基因三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参基因，设计了一对了特异性引物与探针。内参对照可以有效监测HPV检测过程中扩增前样本取样和处理效果，从而有效的降低了假阴性的出现。本发明的试剂盒性能稳定、检测快速、操作简便、结果准确，能有效的检测出区分出HPV16，18高危型别，可作为宫颈癌筛查的有效方案。