专利名称：：毕赤酵母制备刀额新对虾精氨酸激酶的方法：刀额新对虾(Metapenaeusensis)又称为基围虾、麻虾、虎虾、沙虾、红尾虾，以前为海洋野生，广泛分布于我国山东半岛以南沿岸水域，现主要为人工养殖的品种，是我国水产食品市场上最常见的一种甲壳类水产食品，也是引起食源性过敏反应疾病的常见食品之ο精氨酸激酶(argininekinase，AK)是磷酸激酶家族中的重要一员，广泛存在于无脊椎动物如昆虫、虾、蟹及软体动物中。精氨酸激酶催化磷酸精氨酸与ADP及ATP之间高能磷酸键的转移，在无脊椎动物体内ATP产生较多时催化形成磷酸精氨酸贮存能量，在肌肉收缩和细胞活动爆发需要能量的过程中则催化磷酸精氨酸的高能磷酸键转移至ADP而产生ATP，是无脊椎动物体内调节能量代谢最重要的酶。在引起食物过敏反应的虾类组织成分中，已证实虾肌肉组织中的原肌球蛋白(tropomyosin)是主要过敏原之一(HoffmanDR,DayJR,MillerJS.(1981)Themajorheatstableallergenofshrimp.AnnAllergy,47:17-22),这种过敏原被定名为Penal。研究发现，虾类组织中除Penal这种主要过敏原以外，还存在至少13种引起过敏反应的蛋白质成分，这些过敏原蛋白的分子量范围在16166kDa之间(LinRY,ShenHD,HanSH.(1993)Identificationandcharacterizationofa30kDamajorallergenfromParapenaeusfissures.JAllergyClinImmunol，92:837-845)。近年来在各禾中虫下类的组织中发现了一些新的过敏原成分，如斑节对虾(Penaeusmonodon)的肌浆钙结合蛋白、凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)以及斑节对虾(Penaeusmonodon)的精氨酸激酶，都胃3白勺虫下(Garcia-OrozcoKD,Aispuro-HernandezΕ,Yepiz-PlascenciaG,etal.(2007)Molecularcharacterizationofargininekinase,anallergenfromtheshrimpLitopenaeusvannamei.IntArchAllergyImmunol,144(1):23)。凡纳滨对虫下禾口斑节对虾的精氨酸激酶分别命名为Litv2和Penm2，两者具有96%的同源性，而且来源于不同甲壳类动物的精氨酸激酶的同源性在88.4%98.3%之间。精氨酸激酶在虾类的肌肉细胞、心脏、神经、血细胞和胃组织中具有高的表达量，而且不同甲壳类动物来源的精氨酸激酶具有较高的同源性，提示精氨酸激酶也是引起虾类食物过敏反应的主要过敏原之一。因此，刀额新对虾精氨酸激酶及其相关生物工程制品有可能开发制备用于食品安全监测中检测甲壳类食品过敏原的试剂，以及开发制备用于诊断和治疗相关食源性过敏反应性疾病的检测试剂及脱敏制剂，由此显现出刀额新对虾精氨酸激酶潜在的应用前景
本发明的目的是提供一种利用酵母表达重组刀额新对虾精氨酸激酶的制备方法及其酵母工程菌。本发明提供的技术方案如下(1)本发明的第一方面，提供一种刀额新对虾精氨酸激酶的重组真核表达载体，该载体是将pPIC9K(Invitr0gen公司)与本发明所述的刀额新对虾精氨酸激酶编码基因(SEQIDNo1)经过重组而获得，该重组真核表达载体为pPIC9K-AK，如图1所示。(2)本发明的第二方面，提供一种表达刀额新对虾精氨酸激酶的重组酵母工程菌GSl15/AK，该工程菌是毕赤酵母GSl15anvitrogen公司)被本发明所述的重组真核表达载体PPIC9K-AK转化而获得，而且pPIC9K中的信号肽基因序列与刀额新对虾精氨酸激酶的编码基因均已整合到该工程菌的基因组中，因此该工程菌可分泌性表达刀额新对虾精氨酸激酶至培养液中。(3)本发明的第三方面，提供一种制备重组刀额新对虾精氨酸激酶的方法，该方法包括以下步骤a)培养上述重组酵母工程菌，于培养液中添加0.5(ν/ν)的甲醇为诱导剂，诱导重组酵母工程菌表达重组刀额新对虾精氨酸激酶；b)离心培养液去除菌体和不溶物，收集培养液上清经过超滤浓缩和透析除盐处理；c)除盐后的培养上清用弱阴离子交换层析柱分离纯化培养液中的重组刀额新对虾精氨酸激酶，收集含有重组刀额新对虾精氨酸激酶的洗脱液；d)将含有重组刀额新对虾精氨酸激酶的洗脱液用分子筛层析方法进一步纯化；e)用SDS-PAGE和Wfesternblotting方法分析鉴定纯化的重组刀额新对虾精氨酸激酶。图1为重组真核表达质粒PPIC9K-AK的构建图谱图2为刀额新对虾精氨酸激酶编码基因的PCR扩增结果图3为重组真核表达质粒PPIC9K-AK的双酶切鉴定结果具体实施例方式以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法，这些实施例仅用于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。下述实施例中，所有PCR引物的合成和DNA序列的测定均由上海生工生物工程技术服务有限公司完成；所用的培养基如无特别说明均按毕赤酵母表达手册anvitrogen公司)的配方进行配制。实施例一、刀额新对虾精氨酸激酶编码基因的克隆2.设计和合成PCR引物根据GenBank中的刀额新对虾精氨酸激酶基因序列和pPIC9K载体的多克隆位点序列，用Oligo7软件设计一对特异性引物如下上游引物5，-AAAGAATTCATGGCTGACGCTGCTGTTATTG-3，下游引物5，-AAGCGGCCGCAATCATCTCCTTCTC-3，；在上游引物中加入了限制性内切酶EcoRI识别位点(GAATTC)，下游引物中加入7NotI位点(GCGGCCGC)，扩增产物的大小约1070bp。2.刀额新对虾精氨酸激酶编码基因的克隆从水产品市场采集鲜活的刀额新对虾50克，去除甲壳和筋膜，挑取纯净肌肉组织勻浆；用RNA提取试剂Trizol(BBI公司)按说明书操作，从刀额新对虾肌肉组织勻浆提取细胞总RNA；取提取的总RNAIyL作为模板，用反转录试剂盒(TaKaKa公司)按说明书操作，经反转录扩增得到精氨酸激酶前体的cDNA；反转录结束后，取反应液5μL作为模板，用上述特异性引物进行PCR扩增精氨酸激酶的编码基因，反应条件如下94°C2min,94°C30s—50°C30s—72°C55s，30个循环，最后72°C延伸lOmin。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图2所示；用EZ-10柱式DNA回收试剂(BBI公司)回收纯化约1070bp的目的基因片段；将纯化的目的基因片段于克隆载体PUCm-T(BBI公司)相连，构建为重组质粒并命名为pUCm-ΑΚ；将重组质粒pUCm-AK转化感受态大肠杆菌JM109，接种于含IPTG和X-gaL的氨苄青霉素LB培养板，37°C培养16h，挑取阳性菌落接种液体LB培养基扩增，提取重组质粒进行测序，测序结果如SEQIDNo1所示。实施例二、构建表达刀额新对虾精氨酸激酶的重组真核表达载体取质粒pUCm-AK和载体pPIC9K(Invitrogen公司)分别用限制性内切酶EcoRI和NotI进行双酶切，回收约1070bp的目的基因片段和载体PPIC9K的大片段，用T4DNA连接酶(BBI公司)于16°C水浴连接16h，将连接产物转化感受态大肠杆菌JM109，接种于含卡那霉素的LB培养板，37°C培养过夜，挑取阳性菌落接种液体LB培养基扩增，提取重组真核表达质粒并命名为PPIC9K-AK；用EcoRI和NotI对重组真核表达质粒pPIC9K_AK进行双酶切鉴定，同时进行测序鉴定，双酶切鉴定结果如图3所示，酶切出的大片段和小片段分别与载体pPIC9K和目的基因的大小相符合，测序结果证实PPIC9K-AK中的刀额新对虾精氨酸激酶编码基因序列与pUCm-AK中的完全一致。实施例三、重组真核表达质粒转化酵母GS115及其高拷贝重组工程菌的筛选提取经测序鉴定的PPIC9K-AK，用限制性内切酶MlI酶切后，用0.7%的琼脂糖凝胶电泳分离并回收线性化的PPIC9K-AK；将线性化的pPIC9K-AK与酵母GS115感受态细胞混合后，按照毕赤酵母表达手册anvitrogen公司)的方法进行电转化。将转化产物涂布于不含His的MD培养板，30°C培养23天，挑选MD平板上生长旺盛的优势菌落接种于含0.5mg/mLG418的YPD平板，30°C培养23天，挑选生长旺盛的优势菌落接种于含lmg/mLG418的YPD平板，30°C培养23天，如此重复培养并依次增加G418浓度至％ig/mL，从含％ig/mLG418的YPD平板筛选得到高拷贝整合的毕赤酵母重组工程菌GS115/AK。实施例四、重组刀额新对虾精氨酸激酶的诱导表达、纯化及分析将重组工程菌GS115/AK接种BMGY培养基，于30°C、250rpm/min条件下振荡培养至菌液0D600为13时，转换为BMMY培养基继续培养，每隔24h加入终浓度为1%的甲醇诱导表达，连续培养96h，离心收集培养上清，先用SDS-PAGE检测培养上清中重组刀额新对虾精氨酸激酶的表达情况，然后用虾过敏症患者血清(从江南大学校医院门诊收集)进行Westernblotting鉴定表达的重组刀额新对虾精氨酸激酶。将培养上清先用截流分子量为IOkDa的超滤膜浓缩，再用DEAE-kpharoseFastFlow离子交换层析和kphadexG-100凝胶过滤层析纯化，纯化产物经SDS-PAGE检测和Wfesternblotting鉴定，SDS-PAGE结果显示纯化的重组刀额新对虾精氨酸激酶为单一蛋白条带，其分子量为41kDa，ffesternblotting结果显示单一反应条带。权利要求1.一种刀额新对虾精氨酸激酶的重组真核表达载体，其特征在于，所述的重组真核表达载体中插入了刀额新对虾精氨酸激酶的编码基因。2.如权利要求1所述的重组真核表达载体中的刀额新对虾精氨酸激酶的编码基因，其DNA的核苷酸序列对应于序列表中的SEQIDN0:1。3.如权利要求1所述的重组真核表达载体中的刀额新对虾精氨酸激酶的编码基因，其编码产物的氨基酸序列对应于序列表中的SEQIDNO:2。4.一种重组毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述的重组毕赤酵母的染色体中整合有权利要求1所述的刀额新对虾精氨酸激酶的编码基因，并且分泌表达重组刀额新对虾精氨酸激酶至培养液中。5.一种制备重组刀额新对虾精氨酸激酶的方法，其特征在于，包括步骤(1)用适当的培养液，培养权利要求4所述的重组毕赤酵母工程菌；(2)在培养液中添加适当的诱导剂，诱导重组毕赤酵母工程菌分泌表达重组刀额新对虾精氨酸激酶；(3)从培养液中分离纯化出重组毕赤酵母分泌表达的重组刀额新对虾精氨酸激酶。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)所用的培养液为BMGY培养液和BMMY培养液；步骤(2)所用的诱导剂为甲醇，添加甲醇的终浓度为培养液体积的0.51%;步骤C3)所用的分离纯化重组刀额新对虾精氨酸激酶的方法为先用弱阴离子型离子交换层析分离培养液中的重组刀额新对虾精氨酸激酶，再用凝胶过滤层析得到纯化的重组刀额新对虾精氨酸激酶。全文摘要本发明提供了一种重组刀额新对虾精氨酸激酶的制备方法及表达重组刀额新对虾精氨酸激酶的毕赤酵母工程菌。本发明的具体制备方法包括以下步骤1)人工合成引物；2)从刀额新对虾肌肉匀浆经反转录PCR得到精氨酸激酶的编码基因；3)构建含有刀额新对虾精氨酸激酶编码基因的重组真核表达载体，融合于毕赤酵母表达调控元件获得重组毕赤酵母工程菌；4)培养重组毕赤酵母工程菌，于培养液添加甲醇诱导毕赤酵母工程菌表达刀额新对虾精氨酸激酶；5)采用离子交换层析和分子筛层析从培养液上清纯化重组刀额新对虾精氨酸激酶。本发明构建的重组毕赤酵母工程菌可进行高密度培养并且分泌型表达重组刀额新对虾精氨酸激酶，适用于工业化制备重组刀额新对虾精氨酸激酶。文档编号C12N9/12GK102392042SQ20111041316公开日2012年3月28日申请日期2011年12月13日优先权日2011年12月13日发明者刘群英,吴静,尤春霞,李静,邬敏辰,郑海军,陈伟申请人:江南大学