专利名称：纳米脂质体抗牛乳房炎耐药致病菌特异性复合IgY的制备方法及其制剂的制作方法牛乳房炎是奶牛最常见的、也是对奶牛业生产危害最大的一种疾病。这种疾病会造成奶牛乳腺发炎肿胀，使产奶量大幅下降。据世界卫生组织(WHO)统计数字显示，这种疾病使美国制奶业每年损失大约20亿美元，使英国每年损失也达2亿美元以上。由于中国正处于奶牛业高速发展期，相关技术、措施和设施还不配套和完善，因此，乳房炎所造成的损失就更加严重，每年高达上百亿元，沉重打击了中国奶牛业的发展。急性乳房炎会直接造成牛乳的废弃、上乳量减少、牛乳价值降低、兽医诊疗费和药费及劳动量增加等经济损失；隐性乳房炎则因其感染率特别高(一般奶牛场的感染率在30 50%)，所造成的损失也不可轻视，尤其对产乳量会有很大影响，以10头牛规模的小奶牛场计算，每年产乳量就将减少3825kg，同时，还有饲料和人工等的间接损失。而且，乳房炎病牛经治愈后，其产奶量不会很快恢复，吃进的饲料不能转换成奶汁，有的乳头甚至因此变“瞎”，不出乳，带来的经济损失就更大。目前，治疗奶乳房炎普遍采用的是抗生素疗法。由于大剂量地使用青霉素、链霉素、四环素和金霉素等药物，会造成牛乳中抗生素大量残留。一方面由于牛乳中有抗生素残留，接种乳酸菌后不易繁殖，使乳酸生成受阻，极大地影响酸乳制品的生产；另一方面当人们食用这种含大量抗生素的牛乳后，会引起多种过敏反应，甚至发生过敏性休克，如果长期饮用，还会使机体内的细菌产生耐药性，一旦发生感染性疾病，将给医治带来很大困难，甚至无药可救。更为严重的是滥用抗生素的结果，造成目前常用的抗生素对奶牛场广泛传播的致病菌已大部分失效，使隐性乳房炎和慢性乳房炎病例越来越多；特别是大量使用抗生素之后形成的L-型变种耐药致病菌，既使施用再多抗生素，它仍会隐藏在乳房内生存和繁殖，慢性感染乳腺，使乳房炎反复发作。另外，抗生素会杀灭有益菌，从而影响乳房内正常菌群平衡，破坏机体天然免疫屏障，给有害菌大开方便之门。这些都是造成牛乳房炎无法根治，并且不断蔓延的根本原因。为了消除抗生素应用所带来的负面影响，减少和杜绝耐药致病菌株的出现和传播，世界卫生组织呼吁各国采取紧急措施。美国、英国等许多国家都制定了相应的政策严格限制抗生素的使用。根据欧盟第70/524号令的精神，传统抗生素将在很短时间内被逐一取消，并将在2006年后全部禁作饲用。世界其它各国为与国际接轨，也都相应制订了一系列新法规。因此，研发一种安全有效的防治牛乳房炎的新方法，开发并应用既无药残，又无污染，又能提高誊经济效益的治疗牛乳房炎的抗生素替代品，是全球奶牛饲养业发展的大方、向和迫切需求。
针对现有技术中牛乳房炎影响严重、且无法根治的问题，本发明要提供一种抗牛乳房炎耐药致病菌特异性复合Ig及其制剂。本发明首先提供一种纳米脂质体抗牛乳房炎耐药致病菌特异性复合IgY的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(SI)筛选引致牛乳房炎的代表性耐药致病 菌作为病原体，所述耐药致病菌包括无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及白色念珠菌中的至少两种；(S2)将所述耐药致病菌混合、粉碎处理后，加入福氏佐剂，再高速匀化处理形成油包水乳液，即制得耐药致病菌蛋白复合抗原；(S3)采用淘汰法筛选具有高免疫应答能力的选择产蛋禽类，再拣取被选出之产蛋禽类所产的免疫蛋；(S4)对所述免疫蛋进行消毒，取蛋黄，制得抗牛乳房炎耐药致病菌特异性IgY粗品;(S5)将所述IgY粗品进一步纯化处理，制得抗牛乳房炎耐药致病菌特异性IgY纯品干粉；(S6)对所述IgY纯品干粉作纳米化处理，制得纳米化抗牛乳房炎耐药致病菌特异性IgY纯品干粉；(S7)对所述纳米化抗牛乳房炎耐药致病菌特异性IgY纯品干粉作脂质体化处理，制得纳米脂质体抗牛乳房炎耐药致病菌特异性复合IgY。本发明还提供一种纳米脂质体抗牛乳房炎耐药致病菌特异性复合IgY制剂，其中包括前述方法制备的纳米脂质体抗牛乳房炎耐药致病菌特异性复合IgY，还包括针剂或乳膏辅料。本发明的纳米脂质体抗牛乳房炎耐药致病菌特异性复合IgY及其制剂，能定向杀灭引起牛乳房炎的无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及白色念珠菌；特别是还能有效杀灭抗生素对其无能为力的抗药性耐药无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌。可有效地抑灭乳池内表面粘膜附着的致病菌,提升治疗指数。这是常规方法制备的抗牛乳房炎致病菌IgY所做不到的。本发明无附图。I.筛选引致牛乳房炎有代表性的病原体根据流行病学调查，乳房炎的病原体有80 130多种，其中主要的病原体为无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及白色念珠菌等。长期以来，世界各地包括欧美发达国家都还是采用抗生素治疗牛乳房炎，由于抗生素治疗牛乳房炎复发率高，只好反复使用并不断增加剂量，结 果造成耐药致病菌泛滥。事实证明，由耐药致病菌引发的牛乳房炎采用抗生素治疗根本是无效的，往往久治不愈而转变成慢性或隠性牛乳房炎，最终只好将奶牛报废，损失惨重。鉴于这一现状，本发明别具一格地选择耐药变种的无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及白色念珠菌作为有代表性的病原体，来制作免疫抗原。2.制备免疫用抗原2. I制备耐药致病菌蛋白混合物在隐性牛乳房炎发生率较多的内蒙呼和浩特市效区奶牛场现场采集耐药变种的无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及白色念珠菌菌株，按照无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及白色念珠菌的培养特性和最适培养条件，分别选择适宜的培养基，分别进行耐药变种的无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及白色念珠菌等菌株大量繁殖，收集培养物，提纯、菌株计数，稀释分装；然后，将这五种耐药致病菌按重量比I 10 : I 10 : I 10 : I 10 : I 10的比例混合，也可将两种以上牛乳房炎耐药致病菌按比例混合。最后，再采用超声粉碎机将混合的耐药致病菌粉碎，获得含全菌和菌体成份的多种耐药致病菌蛋白混合物。2. 2制备耐药致病菌蛋白复合抗原将所制得含全菌和菌体成份的耐药致病菌蛋白混合物的浆液以I 10 : I 10的比例(通常为I : I)加入福氏佐剂，置入高速匀浆器以30，OOOrpm高速匀化，形成油包水乳液，即制得牛乳房炎耐药致病菌蛋白复合抗原。3.制备含高活性抗体的免疫蛋本发明可选用任何产蛋禽类免疫制备免疫蛋，限于篇幅仅以母鸡为例说明，其它禽类完全可依下文所述方法同样进行。首先采用淘汰法选择产蛋禽类(鸡、鸭、鹅、火鸡、鸵鸟等)，再用所选择的禽类，获得免疫蛋。现以产蛋母鸡为代表说明如下。3. I采用淘汰法选择具有高免疫应答能力的产蛋母鸡3. I. I选择正在产蛋的健康无特定病原体携带的(SPF)健康产蛋鸡200只并一一用数字进行编号标记。然后用上述制得的无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及白色念珠菌耐药致病菌蛋白复合抗原对这些产蛋鸡进行注射免疫。在第一次注射后间隔7天，再以同样剂量、方法注射第二次，第二次注射后再间隔7天以相同剂量注射第3次，第一次注射后从第20天开始拣取高免疫蛋。对所检取的免疫蛋按每只鸡的编号不同进行编码标记。3. 1.2当每种编码的免疫蛋数量达到10只左右时，将检取的每批免疫蛋分别用
O.5%新洁而灭溶液或O. I % KMn04溶液或其它同类消毒液将免疫蛋浸泡15 30分钟消毒，无菌蒸馏水冲洗、晾干，置于打蛋机中将蛋壳打碎，用蛋黄筛滤除蛋清留下蛋黄加入4 8倍蒸馏水稀释搅拌均匀，用lmol/1 NaOH液或者lmol/1 HCL液调节PH值至5. 5 6. O，4 6°C下静置过夜，稀释液8，OOO 12，000r/min高速离心20分钟，取上清液用超滤机超滤浓缩，得到200批抗牛乳房炎病原体特异性IgY浓缩液体。3. I. 3分别以耐药无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及白色念珠菌作为抗原，采用酶联免疫法(ELISA)检测所制得的200批抗牛乳房炎病原体特异性IgY浓缩液体中每批对耐药无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及白色念珠菌的抗体结合效价。3. I. 4将凡是对耐药无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及白色念珠菌的抗体结合效价达到I : 102,400以上的该批抗牛乳房炎病原体特异性IgY浓缩液体单独挑选出来；找出其对应的产蛋母鸡的编号，把这些产蛋母鸡作为选择的“具有高免疫应答能力的产蛋母鸡”，其它不符合高免疫应答能力的母鸡则淘汰不用。4.制备抗牛乳房炎耐药致病菌特异性IgY粗品 检取选择的高免疫应答能力的产蛋母鸡所产的免疫蛋，将所获得的高免疫蛋分别用O. 5%新洁而灭溶液或O. I % KMn04溶液或其它同类消毒液将免疫蛋浸泡15 30分钟消毒，无菌蒸馏水冲洗、晾干，置于打蛋机中将蛋壳打碎，用蛋黄筛滤除蛋清留下蛋黄加入4 8倍蒸馏水稀释搅拌均匀，用lmol/1 NaOH液或者lmol/1 HCL液调节PH值至5. 5 6. 0，4 6°C下静置过夜，稀释液8，000 12，000r/min高速离心20分钟，取上清液用超滤机超滤浓缩。然后，采用美国Pall Ultrafine Filtration Company制造的除病毒过滤系统的细菌病毒滤除装置，彻底滤除各种细菌病毒，确保所制备的IgY绝不含任何病毒和细菌。第一道细菌滤除装置是用0. 22 μ m膜除菌过滤器除去沙门菌(Salmonella)等细菌；第二道支原体滤除装置是用0. I μ m膜除支原体过滤器除去支原体；第三道病毒滤除装置是用Ultipor VFTM DV50除病毒过滤器除去包括禽流感病毒、肠病毒在内的多种病毒。最后，将所得浓缩液用冷冻干燥机干燥，即制得抗牛乳房炎耐药致病菌特异性IgY粗品。5.制备抗牛乳房炎耐药致病菌特异性IgY纯品将所制得的抗牛乳房炎耐药致病菌特异性IgY粗品分别过离子交换柱和凝胶交换柱再经过亲和层析柱进行纯化，即制得高活性的抗牛乳房炎耐药致病菌特异性IgY。采用常规“水稀释法”或“聚乙二醇法”等普通方法，而未经过亲和层析柱层析纯化的，所得到的只是初级的IgY粗制品，并不是纯化的IgY，其生物活性达不到医疗要求。将所制得的抗牛乳房炎耐药致病菌特异性IgY纯品应用冷冻干燥机干燥，即制得抗牛乳房炎耐药致病菌特异性IgY纯品干粉。应用SDS-PAGE电泳测定法，对按以上工艺所制取的抗牛乳房炎耐药致病菌特异性IgY纯品进行检测，测得其中IgY含量都在98%以上。6.制备纳米化抗牛乳房炎耐药致病菌特异性IgY纯品干粉取所制得的抗牛乳房炎耐药致病菌特异性IgY纯品干粉，加入超微粉碎机中碾磨粉碎，加工成大小在I IOOnm之间、粒度超过> 15000目的超微粒子，制得相应的纳米化抗牛乳房炎耐药致病菌特异性IgY纯品干粉。7.制备纳米脂质体抗牛乳房炎耐药致病菌特异性复合IgY将以上所制得的纳米化抗牛乳房炎耐药致病菌特异性IgY纯品作脂质体化处理，具体实施方法如下把卵磷脂和胆固醇溶于乙醚中，再将纳米化抗牛乳房炎耐药致病菌特异性IgY纯品加入4mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)配成IgY溶液；然后将含卵磷脂和胆固醇的混悬液与IgY溶液混合，超声处理2min(每处理O. 5min,间歇.O. 5min),立即在水浴中减压旋转蒸发至呈凝胶状，漩涡振荡使凝胶转相，再继续蒸发除尽乙醚，进而超速离心(35000r/min，30min)分离除去未包入的IgY,沉淀用水洗二次 ,离心,得沉淀,用10mmol/L PBS稀释，即制得纳米脂质体抗牛乳房炎耐药致病菌特异性复合IgY。分别以耐药无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及白色念珠菌作为抗原，采用酶联免疫法(ELISA)检测以上所制得的纳米脂质体抗牛乳房炎耐药致病菌特异性复合IgY对耐药无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及白色念珠菌的抗体结合效价都高达I : 102，400以上。可见，本发明的制备过程中，依次有代表性耐药致病菌作为病原体、耐药致病菌蛋白复合抗原、免疫蛋、抗牛乳房炎耐药致病菌特异性IgY粗品、抗牛乳房炎耐药致病菌特异性IgY纯品、纳米化抗牛乳房炎耐药致病菌特异性IgY纯品，并最后得到纳米脂质体抗牛乳房炎耐药致病菌特异性复合IgY。二·实际应用实际应用时，可基于上述所制得的纳米脂质体抗牛乳房炎耐药致病菌特异性复合IgY，加入各种辅料制成针剂和乳膏，供应给全球各地的奶牛场，用于对牛乳房炎的预防和治疗。大量试验已证明，这种高活性特异性复合IgY能定向杀灭引起牛乳房炎的无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及白色念珠菌；特别是还能有效杀灭抗生素对其无能为力的抗药性耐药无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌。而且，由于这种特异性IgY只杀灭病原体，对牛乳房内的乳酸杆菌等有益菌郝秋毫无犯；因此，不会象抗生素那样杀灭乳房内乳酸杆菌等有益菌，破坏乳房内正常的酸性环境和菌群平衡，造成二次感染或反复复发。更重要的是，使用这种特异性IgY还会恢复有益菌良好的生长微环境，构建有益菌群，从而形成无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及真菌无法再生存的新的菌群生态平衡，达到牛乳房炎不再复发的长效抑菌效果。另外，由于本发明的纳米脂质体抗牛乳房炎耐药致病菌特异性复合IgY具有很强的靶向性、延效性和表皮渗透性，可以更有效地渗透深入奶牛乳池内表面粘膜层；从而更有效地抑灭乳池内表面粘膜附着的致病菌，提升治疗指数。这是常规方法制备的抗牛乳房炎致病菌IgY所做不到的。除此以外，这种高活性免疫球蛋白IgY是一种天然安全的物质，美国食品医药管理局(FDA)已将其列入「一般公认安全物质(Generally Regarded asSafe, GRAS)」范畴，是人类和奶牛可天天食用的蛋制品成份的提取物，没有任何毒副作用，既使长期给奶牛使用也不会产生残留；因此，不必像施用抗生素药物治疗牛乳房炎那样需要很长的停挤乳或弃乳期，这一点也具有十分明显的优势。因为停挤奶或弃乳造成的损失十分可观，一般施用抗生素或化学药后起码需要停止挤奶五天以上；因此，乳农每施一次药，每头牛至少损失125 210公斤牛乳，按一个牧场有100多头乳牛计算，一个牧场每次施药就要损失10吨牛乳以上。而采用本发明的“纳米脂质体抗牛乳房炎耐药致病菌特异性复合IgY”的针剂或膏剂等防治牛乳房炎，由于它是无毒、无副作用、无残留的天然成份；因此，也就不存在停挤奶期和弃乳的问题，从而可大幅度减少奶牛场的损失，提高经济效益。另外，随着国民生活水平的提高，人们对食品安全的要求越来越高，而奶源污染问题已经成为牛奶质量的关键；欧美发达国家已制订了严格限定乳制品中抗生素残留的标准。中国也在最近通过了生鲜牛乳收购标准(GB6914-86);新的标准强制规定把“抗生素残留”列入国家必检项目。而本发明的纳米脂质体抗牛乳房炎耐药致病菌特异性复合IgY及其制剂为生产出真正意义上的“无抗奶”创造了条件。实验例I
抗牛乳房炎耐药致病菌特异性IgY中的IgY含量检测应用SDS-PAGE (十二烷基硫酸钠一聚丙烯凝胶)电泳测定法，对按以上方法第4点所制取的抗牛乳房炎耐药致病菌特异性IgY粗品进行检测，结果含IgY 45 52%。将这种IgY粗品经二次过柱纯化后，得到纯IgY。经SDS-PAGE分析，纯度达到PAGE纯，如下表所示
IgY纯品纯IgY含量
抗牛乳房炎耐药致病菌特异性IgY纯品99. 99%实验例2检测纳米脂质体抗牛乳房炎耐药致病菌特异性复合IgY对有代表性的五种抗原的抗体结合效价。具体是，分别采用耐药无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及白色念珠菌作为检测抗原，用“ELISA”方法检测所制得的纳米脂质体抗牛乳房炎耐药致病菌特异性复合IgY的抗体效价。结果如下表
_IgY__抗原__抗体结合效价_
耐药无乳链球菌1:204,800
耐药停乳链球菌1:204,800
纳Χ 炎耐药耐药金黄色葡萄球菌1:204,800
致病菌特异性复合IgY -；----
耐药大肠杆菌I: 204，800
耐药白色念珠菌I: 204，800从以上检测结果可看出，所制备的纳米脂质体抗牛乳房炎耐药致病菌特异性复合IgY对作为抗原免疫的五种耐药致病菌都有很高的抗体结合效价。试验结果证明，本发明所采用的免疫鸡筛选和菌体粉碎等免疫激活方法对提高所制备的IgY的抗体效价产生了理想的效果。实验例3检测纳米脂质体抗牛乳房炎耐药致病菌特异性复合IgY注射剂对有代表性的五种牛乳房炎耐药致病菌的抑菌和杀菌效果。(一)试验材料、设备(I)抑菌、杀菌实验材料纳米脂质体抗牛乳房炎耐药致病菌特异性复合IgY注射齐 ，耐药无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及白色念珠菌，营养琼脂，营养肉汤，5%羊血营养肉汤。(2)实验仪器、设备培养箱，721分光光度计，生理盐水，吸管，天平等。( 二)试验方法(I)抑菌(MIC)实验方法取9支无菌试管,每支试管中加入Iml营养肉汤或Iml5%牛血清营养肉汤和Iml已调整好浓度的细菌液(耐药大肠杆菌0D600 = O. 3 ;耐药金黄色葡萄球菌0D600 = O. 2 ;耐药无乳链球菌0D600 = O. 2 ;耐药停乳链球菌0D600 = O. 2 ;耐药白色念珠菌0D600 = O. 2)。然后第一支试管加入ImL纳米脂质体抗牛乳房炎耐药致病菌特异性复合IgY注射剂悬浮液，待充分混匀后吸出Iml液体加入第二管，充分混匀后吸出Iml液体加入第三管……，依次倍比稀释，稀释比为I : 2，1 : 4，1 : 8，1 : 16，1 : 32……。第十管不加本悬浮液，作为阳性对照。将试管放置培养箱，35°C培养过夜。第二天观察试管培养液澄清度，最高稀释度的澄清管为抑菌管，计算抑菌浓度(MIC)。(2)杀菌(MBC)实验方法将上述培养过夜的试管中液体摇匀，从试管中取一接种环液体接种于血营养琼脂平板上作次代培养。将血营养琼脂平板放置培养箱，35°C培养过夜，第二天观察结果，杀菌(MBC)的培养皿无菌落生长。(三)结果(I)抑菌(MIC)观察培养24小时后最高稀释度的澄清管为抑菌管，此管的稀释度为抑菌的稀释比。(2)杀菌(MBC)观察血营养琼脂平板培养24小时后观察菌落，最高稀释度的无细菌生长的培养皿为杀菌稀释比。抑菌(MIC)表



本发明涉及一种纳米脂质体抗牛乳房炎耐药致病菌特异性复合IgY的制备方法，针对现有技术中牛乳房炎影响严重、且无法根治的问题，本发明中选取代表性耐药致病菌，包括无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及白色念珠菌中的至少两种作为病原体，依次制备出耐药致病菌蛋白复合抗原、免疫蛋、抗牛乳房炎耐药致病菌特异性IgY粗品、抗牛乳房炎耐药致病菌特异性IgY纯品，并将这种抗牛乳房炎耐药致病菌特异性IgY纯品纳米脂质体化；最后得到纳米脂质体抗牛乳房炎耐药致病菌特异性复合IgY。再加入适当的辅料，制成针剂或乳膏。所述制剂对牛乳房炎有明显疗效。