一种艾滋病重组表位疫苗及其制备方法

陈应华, 刘祖强, 李华, 董晓楠

2003年4月9日

2001年9月29日

2001年9月29日

清华大学, 江西省龙飞科技开发有限公司, 北京国信伟业高新技术发展有限公司

A61P31/00GK1408433SQ01136060

表位 艾滋病 制备 疫苗 重组

1.一种艾滋病重组表位疫苗，它的活性成分为一条多肽，该多肽含有下述成员中的至少一个1)一个人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位；2)一个人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位的变异表位；3)多个人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位；4)多个人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位的变异表位；5)一个至少一次重复的人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位；6)一个至少一次重复的人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位的变异表位；7)至少一次重复的人免疫缺陷病毒蛋白的多个中和表位或/和CTL表位；8)至少一次重复的人免疫缺陷病毒蛋白多个中和表位或/和CTL表位的变异表位2.根据权利要求1所述的一种艾滋病重组表位疫苗，其特征在于所述中和表位和CTL表位及其变异表位选自ELDKWAELDEWAELDQWAELDSWAELDTWAGPGRAFYGPGQAFYGPGQTFYGPGQAWYGLEGIYYSARVIYQYMDDC3.根据权利要求1或2所述的一种艾滋病重组表位疫苗，其特征在于疫苗中还含有药学上可接受的药用佐剂4.制备艾滋病重组表位疫苗的方法，是用限制性核酸内切酶中的同尾酶或平端酶，借助载体将下述成员中的至少一条多肽对应的核苷酸序列连接成一个人工合成基因，该基因在表达载体系统中表达，经纯化即得到艾滋病重组表位疫苗1)一个人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位；2)一个人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位的变异表位；3)多个人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位；4)多个人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位的变异表位；5)一个至少一次重复的人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位；6)一个至少一次重复的人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位的变异表位；7)至少一次重复的人免疫缺陷病毒蛋白的多个中和表位或/和CTL表位；8)至少一次重复的人免疫缺陷病毒蛋白多个中和表位或/和CTL表位的变异表位5.根据权利要求4所述的制备艾滋病重组表位疫苗的方法，其特征在于所述中和表位和CTL表位及其变异表位选自ELDKWAELDEWAELDQWAELDSWAELDTWAGPGRAFYGPGQAFYGPGQTFYGPGQAWYGLEGIYYSARVIYQYMDDC6.根据权利要求4或5所述的制备艾滋病重组表位疫苗的方法，其特征在于所述每个表位对应的寡核苷酸序列的3’端均加有标签7.根据权利要求6所述的制备艾滋病重组表位疫苗的方法，其特征在于所述标签的5’端设有终止密码子8.根据权利要求6所述的制备艾滋病重组表位疫苗的方法，其特征在于所述标签的寡核苷酸序列的5′和3’端分别具有限制性核酸内切酶的识别位点，该二酶识别位点间的碱基优选为不包括限制性内切酶识别位点的550-650bp9.根据权利要求4或5所述的制备艾滋病重组表位疫苗的方法，其特征在于所述人工合成基因的核苷酸序列中含有限制性核酸内切酶中的同尾酶或平端酶识别位点，该合成基因的模式为 其中，Nn为需要连接的表位对应的核苷酸序列， 和 为一对同尾酶或平端酶X和X′的识别位点10.根据权利要求9所述的制备艾滋病重组表位疫苗的方法，其特征在于所述模式核苷酸序列 可以通过人工合成寡核苷酸单链，再在引物的作用下通过PCR扩增得到

本发明涉及用生物工程技术制备的疫苗及其制备方法与应用，特别是涉及一种艾滋病疫苗及其制备方法与应用一种艾滋病重组表位疫苗，它的活性成分为一条多肽，该多肽含有下述成员中的至少一个1)一个人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位； 2)一个人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位的变异表位；3)多个人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位；4)多个人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位的变异表位；5)一个至少一次重复的人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位；6)一个至少一次重复的人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位的变异表位；7)至少一次重复的人免疫缺陷病毒蛋白的多个中和表位或/和CTL表位；8)至少一次重复的人免疫缺陷病毒蛋白多个中和表位或/和CTL表位的变异表位所述中和表位和CTL表位及其变异表位可以选自ELDKWAELDEWAELDQWAELDSWAELDTWAGPGRAFYGPGQAFYGPGQTFYGPGQAWYGLEGIYYSARVIYQYMDDC为了诱导强免疫应答，疫苗中还应该含有药学上可接受的药用佐剂药用佐剂可以是铝佐剂、油佐剂等本发明的另一个目的是提供一种制备艾滋病重组表位疫苗制备艾滋病重组表位疫苗的方法，是用限制性核酸内切酶中的同尾酶或平端酶，借助载体将下述成员中的至少一条多肽对应的核苷酸序列连接成一个人工合成基因，该基因在表达载体系统中表达，经纯化即得到艾滋病重组表位疫苗1)一个人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位；2)一个人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位的变异表位；3)多个人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位；4)多个人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位的变异表位；5)一个至少一次重复的人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位； 6)一个至少一次重复的人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位的变异表位；7)至少一次重复的人免疫缺陷病毒蛋白的多个中和表位或/和CTL表位；8)至少一次重复的人免疫缺陷病毒蛋白多个中和表位或/和CTL表位的变异表位所述中和表位和CTL表位及其变异表位可以选自ELDKWAELDEWAELDQWAELDSWAELDTWAGPGRAFYGPGQAFYGPGQTFYGPGQAWYGLEGIYYSARVIYQYMDDC由于单个表位对应的核苷酸序列较短，不便实现基因转移操作，因此在所述每个表位对应的寡核苷酸序列的3’端均加有标签所述标签的5’端设有终止密码子，使其不影响目的基因翻译从而勿需切掉该片段所述标签的寡核苷酸序列的5′和3’端分别具有限制性核酸内切酶的识别位点，该二酶识别位点间的碱基优选为不包括限制性内切酶识别位点的550-650bp所述人工合成基因的核苷酸序列中含有限制性核酸内切酶中的同尾酶或平端酶识别位点，该合成基因的模式为 其中，Nn为需要连接的表位对应的核苷酸序列， 和 为一对同尾酶或平端酶X和X′的识别位点所述模式核苷酸序列 可以通过人工合成寡核苷酸单链，再在引物的作用下通过PCR扩增得到本发明具有以下优点1、该疫苗是一种能刺激产生多种中和抗体并激活CTL应答的高效多表位-表位疫苗，能有效对付病毒的变异，进而克服己有常规灭活疫苗或减毒疫苗预防效果差甚至无效的缺点；2、该疫苗的有效成分是表位多肽，这种多肽没有HIV-1的遗传物质及活性，不会产生因HIV-1的遗传物质诱发的副作用，也没有灭活疫苗或减毒疫苗可能复性的风险；3、由于表位可以事先选定，从而解决了不能直接诱导/制备预先确定的表位特异性的免疫应答的难题；4、该疫苗的设计灵活，可以综合应用HIV-1中和表位和CTL表位，使疫苗具有同时诱导细胞免疫和体液免疫的能力；5、随着HIV-1的变异，可以将本疫苗进行改进，不需进行长时间的试验，降低生产成本；6、该疫苗的免疫原可以使用大肠杆菌发酵的方式进行批量生产，能够降低成本该技术将对世界预防医学研究产生重大影响，将使疫苗的制备技术产生革命性变化，并且将带来巨大的经济效益和社会效益下面结合具体实施例对本发明作进一步说明2.利用合成的上下游通用引物采取常规PCR条件通过PCR扩增上述寡核苷酸链从而在所得到的寡核苷酸链的5’到3’依次具有BamHI、BamHI的同尾酶BglII以及另一个内切酶XhoI的酶切位点利用T-A克隆方法将PCR产物直接导入载体pGEM-T easy(Promega公司产品)，将所筛选到的阳性克隆，命名为pGEM-Al，用BglII和XhoI消化该阳性克隆，并导入一个经过同样处理的标签片段(该片段可来自含有猪瘟病毒石门株包膜蛋白E2基因的质粒pCDNA-E2，利用载体上的XhoI识别位点和基因中的BglII识别位点采用XhoI和BglII消化该质粒得到大约600bp的小片段，且其中间不含有BamHI、BglII以及XhoI的切割位点该片段插入后由于移码得到两个终止密码子而不影响目的基因的表达，故勿需切除该片段)，得到的阳性克隆命名为pGEM-A1-tag3.用BamHI和XhoI、BglII和XhoI两组酶消化pGEM-A1-tag系列，回收BamHI和XhoI消化后得到的含有目的表位核苷酸序列和标记片段的小片段以及BglII和XhoI消化后得到的含有目的表位核苷酸序列和载体部分的大片段，将上述两个片段连接，得到的阳性克隆为pGEM-A2-tag系列4.用步骤3所述操作处理pGEM-A2-tag系列，并结合步骤3中所得到的BamHI和XhoI消化后回收的含有目的表位核苷酸序列的小片段，可以得到pGEM-A3-tag或pGEM-A4-tag系列5.反复利用步骤3或4所述操作处理所得阳性质粒，可得到含有满足表位重复要求的免疫原基因的pGEM-An-tag6.将BamHI和XhoI消化pGEM-An-tag得到的含有An片段的小片段插入经过同样处理的原核表达载体pET-28(Novagen公司产品)中，得到的重组质粒命名为pET-28-An-tag，并将重组质粒转入大肠杆菌进行诱导表达7.表达的重组蛋白纯化后与医用佐剂制备成艾滋病重组表位疫苗实施例2、制备以HIV-1 gp41上ELDKWA中和表位为基础的抗变异艾滋病重组表位疫苗1.人工合成含有ELDKWA表位及其4个变异表位(ELDEWA、ELDQWA、ELDSWA、ELDTWA)各自对应的核苷酸序列，并添加包含同尾酶BamHI和BglII识别位点的连接头(下划线表示)的寡核苷酸链，其中包含大肠杆菌偏爱密码子A5’gcgcggatccgaattagataaatgggcaaeatcttgataac3’B5’gcgcggatccgaacttgatgagtgggccagatcttgataac3’C5’gcgcggatccgaacttgatcagtgggccagatcttgataac3’D5’gcgcggatccgaacttgattcctgggcgagatcttgataac3’E5’gcgcggatccgaacttgatacgtgggccaggatcttgataac3’同时合成一对对应的引物，其中下游引物导入非平端酶XhoI的切割位点上游引物5’gtg cgc gga tcc3’下游引物5’ctc gag tta tca aga 3’；2.利用合成的上下游通用引物通过PCR扩增上述寡核苷酸链，从而在所得到的每一条寡核苷酸链的5’到3’依次具有BamHI、BamHI的同尾酶BglII以及另一个内切酶XhoI的酶切位点利用T-A克隆方法将PCR产物直接导入载体pGEM-T easy(Promega公司产品)，然后将所筛选到的阳性克隆(命名为pGEM-N1系列，其中N为A、B、C、D、E)用BglII和XhoI消化，并导入一个经过同样处理的标签片段(该片段可来自含有猪瘟病毒石门株包膜蛋白E2基因的质粒pCDNA-E2，利用载体上的XhoI识别位点和基因中的BglII识别位点采用XhoI和BglII消化该质粒，得到大约600bp的小片段，且其中间不含有BamHI、BglII以及XhoI的切割位点该片段插入后由于移码得到两个终止密码子而不影响目的基因的表达，故勿需切除该片段)，得到的阳性克隆命名为pGEM-N1-tag系列(其中N为A、B、C、D、E)3.用BamHI和XhoI、BglII和XhoI两组酶消化pGEM-N1-tag系列，回收BamHI和XhoI消化后得到的5个小片段以及BglII和XhoI消化后得到的5个大片段，将上述5个大小片段任意组合连接，得到的阳性克隆为pGEM-N2-tag系列(其中N分别为A、B、C、D、E中二者的任意组合)4.用步骤3所述操作处理pGEM-N2-tag系列，并结合步骤3中所得到的BamHI和XhoI消化后回收的5个小片段，可以得到pGEM-N3-tag或pGEM-N4-tag系列5.反复利用步骤3或4所述操作处理所得阳性系列，可将上述5条寡核苷酸链反复连接，直到得到含有满足需要表位的种类和数量的免疫原基因的pGEM-Nn-tag系列6.将BamHI和XhoI消化pGEM-Nn-tag得到的含有Nn片段的小片段插入经过同样处理的原核表达载体pET-28中，得到的重组质粒命名为pET-28-Nn-tag，并将重组质粒转入大肠杆菌进行诱导表达7.表达的重组蛋白纯化后与医用佐剂制备成多重复抗变异重组HIV疫苗实施例3、制备以HIV-1 gp41上ELDKWA中和表位和gp120上GPGRAFY中和表位为基础的重组多表位-表位疫苗1.人工合成含有ELDKWA表位和GPGRAFY表位各自对应的核苷酸序列，并添加包含同尾酶BamHI和BglII识别位点的连接头(下划线表示)的寡核苷酸链，包含大肠杆菌偏爱密码子A5’gcgcggatccgaattagataaatgggcaagatcttgataac3’B5’gcgcggatccggccctgggcgtgccttttacagatcttgataac3’同时合成一对对应的引物，其中下游引物导入非平端酶XhoI的切割位点，；上游引物5’gtg cgc gga tcc3’；下游引物5’ctc gag tta tca aga 3’2.以下重复实施例2中的2-6步3.将BamHI和XhoI消化pGEM-Nn-tag得到的含有Nn片段的小片段插入经过同样处理的原核表达载体pET-28a中，得到的重组质粒命名为pET-28a-Nn-tag，并将重组质粒转入大肠杆菌进行诱导表达4.表达的重组蛋白纯化后与医用佐剂制备成艾滋病重组多表位-表位疫苗实施例4、制备以HIV-1 gp41上ELDKWA中和表位和gp120上GPGRAFY中和表位及其变异表位为基础的艾滋病多表位-抗变异-重组表位疫苗1.人工合成含有HIV gp41上ELDKWA中和表位及其4个变异表位(ELDEWA、ELDQWA、ELDSWA、ELDTWA)和gp120上GPGRAFY中和表位及其变异表位(GPGQAFY、GPGQTFY和GPGQAWY)各自对应的核苷酸序列，并添加包含同尾酶BamHI和BglII识别位点的连接头(下划线标识)的寡核苷酸链(包含大肠杆菌偏爱密码子) A5’gcgcggatccgaattagataaatgggcaagatcttgataac3’B5’gcgcggatccgaacttgatgagtgggccagatcttgataac3’C5’gcgcggatccgaacttgatcagtgggccagatcttgataac3’D5’gcgcggatccgaacttgattcctgggcgagatcttgataac3’E5’gcgcggatccgaacttgatacgtgggccagatcttgataac3’F5’gcgcggatccggccctgggcgtgccttttacagatcttgataac3’G5’gcgcggatccggccctgggcaggccttttacagatcttgataac3’H5’gcgcggatccggccctgggcagaccttttacagatcttgataac3’I5’gcgcggatccggccctgggcaggcctggtacagatcttgataac3’同时合成一对对应的引物，其中下游引物导入非平端酶XhoI的切割位点上游引物5’gtg cgc gga tcc3’；下游引物5’ctc gag tta tca aga 3’2.以下重复实施例2中的2-6步3.将BamHI和XhoI消化pGEM-Nn-tag得到的含有Nn片段的小片段插入经过同样处理的原核表达载体pET-28a中，得到的重组质粒命名为pET-28a-Nn-tag，并将重组质粒转入大肠杆菌进行诱导表达4.表达的重组蛋白纯化后与医用佐剂制备成艾滋病多表位-抗变异-重组表位疫苗实施例5、制备以HIV-1 gp41上ELDKWA中和表位和gp120上GPGRAFY中和表位以及HIV-1 CTL表位(GLEGIYYSAR)和(VIYQYMDDC)为基础的艾滋病多表位-抗变异重组表位疫苗1.人工合成含有HIV gp41上ELDKWA中和表位及其4个变异表位(ELDEWA、ELDQWA、ELDSWA、ELDTWA)和gp120上GPGRAFY中和表位及其变异表位(GPGQAFY、GPGQTFY和GPGQAWY)以及HIV-1 CTL表位(GLEGIYYSAR)和(VIYQYMDDC)各自对应的核苷酸序列，并添加包含同尾酶BamHI和BglII识别位点的连接头(下划线标识)的寡核苷酸链(包含大肠杆菌偏爱密码子)A5’gcgcggatccgaattagataaatgggcaagatcttgataac3’B5’gcgcggatccgaacttgatgagtgggccagatcttgataac3 ’C5’gcgcggatccgaacttgatcagtgggccagatcttgataac3’D5’gcgcggatccgaacttgattcctgggcgagatcttgataac3’E5’gcgcggatccgaacttgatacgtgggccagatcttgataac3’F5’gcgcggatccggccctgggcgtgccttttacagatcttgataac3’ G5’gcgcggatccggccctgggcaggccttttacagatcttgataac3’H5’gcgcggatccggccctgggcagaccttttacagatcttgataac3’I5’gcgcggatccggccctgggcaggcctggtacagatcttgataac3’J5’gcgcggatcccgcatcttagcggtggaacgctatttaaaagacagatcttgataac3 ’K5’gcgcggatccgtcatctatcagtacatggacgactgtagatcttgataac3’同时合成一对对应的引物，其中下游引物导入非平端酶XhoI的切割位点上游引物5’gtg cgc gga tcc3’；下游引物5’ctc gag tta tca aga 3’；2.以下操作重复实施例2中的2-6步3.利用BamHI和XhoI分别消化pGEM-Nn-tag和原核表达载体pET-28a并通过连接筛选得到含有Nn片段的重组质粒pET-28a-Nn-tag，再将重组质粒转入大肠杆菌进行诱导表达4.表达的重组蛋白纯化后与医用佐剂制备成同时具有细胞免疫和体液免疫的艾滋病多表位-抗变异-重组表位疫苗