专利名称：用于鉴别接种对抗布鲁氏菌的疫苗的动物的方法布鲁氏菌病(Brucellosis)是从动物传染给人的疾病。在动物体内，布鲁氏菌感染引起流产、不育、生产降低以及动物和动物产品贸易的限制，这是具有经济影响的动物卫生问题。此外，该细菌是从感染动物传染给人的，由此导致虚弱以及通常致残的疾病，没有对抗该细菌的疫苗，并且针对频繁复发的延长期它的治疗需要高剂量抗生素。因此，布鲁氏菌是一个重要的公共卫生问题。已经显示的是人布鲁氏菌病的患病 率与动物布鲁氏菌病的患病率直接地相关联。因此，在缺少用于人类的疫苗下，预防该疾病必然需要控制动物体内的感染。在大多数社会经济的背景中，用于控制布鲁氏菌病的唯一可行的办法是通过基于接种农场动物的计划(程序)，通过大规模接种计划(程序)或通过用于接种、诊断和屠宰感染动物的计划(程序)(Blasco 1997. Preventive VeterinaryMedicine 31:275-283)。针对动物布鲁氏菌病的参照疫苗是用于牛的流产布鲁氏菌(B. abortus) S19 (光滑菌株)以及用于绵羊和山羊的马尔他布鲁氏菌(B.meliteniiORevl (光滑菌株)(0ΙΕTerrestrial Manual, 2009-chapters 2. 4. 3. and2. 7. 2.-)。两者都是活的减毒株，无佐剂，具有生产和获得的低成本，以及对抗反刍动物体内野生株(用于人类感染的主要来源)感染的高效性。然而，该技术的缺点是在接种疫苗之后它们产生免疫应答，不能与在被野生株强烈感染之后诱导的情况区别开。为了解决这个问题，已经做出了许多科学努力。一个策略在于发展布鲁氏菌的粗糙菌株(rough strain) (R),由于缺少脂多糖(LPS)的O链(一种已知的布鲁氏菌致病因子以及用于测试感染的血清学诊断的主抗原)，这些菌株导致可用作活疫苗的减毒株，这些菌株未显著地干扰血清学诊断测试。在此背景下，在90年代，开发了(通过传代培养)具有R显型的自发性突变体(称为流产布鲁氏菌RB51) (Schurig etal. , 1991. Veterinary Microbiology, 28:171-188)。菌株 RB51 目前正用于一些国家中对抗牛布鲁氏菌病，存在有争议的结果。由于缺少“O”抗原，RB51和从在不同脂多糖合成途径方面在基因上良好表征的(Gonzalez et al. , 2008. PLoS One, 3 (7) :e2760)布鲁氏菌病马尔他种衍生的R变异体的集合都降低了在病毒干扰的血清学诊断方面的干扰问题。然而，已经显示的是R疫苗没有解决这个问题，因为它们给予的对抗野生型感染的保护比参照疫苗流产布鲁氏菌S19和布鲁氏菌马耳他种Revl低得多(Moriy0n et al. , 2005. VeterinaryResearch, 35:1-38, Barrio et al.，2009. Vaccine, 27:1741-1749)。因此，重要的是具有(获得)基因修饰的衍生疫苗流产布鲁氏菌S19和布鲁氏菌马耳他种Revl以及通过直接和间接诊断法(血清学)使已经免疫接种的动物与患有病毒感染的动物区别开的相关诊断测试。存在广泛多样的荧光蛋白GFP (绿色荧光蛋白)，这些蛋白是依赖于所使用的表达系统以可变的荧光数量和强度产生的。GFP蛋白已经广泛地用于分子和细胞生物学中用于基因标记和检测微生物(包括布鲁氏菌，Celli et al. , 2003. Journal of ExperimentalMedicine, 198(4) :545_556)、细胞、质体、重组蛋白以及用于严格的科学目的的其他部分。还开发了免疫印迹型免疫测试(Rajasekaran et al. , 2008. Applied and EnvironmentalMicrobiology, 74(22) :7051-7055)以及夹心ELISA用于检测和定量在微生物、细胞以及组织中表达的多种 GFP 蛋白(Cell Biolabs, Inc. ;Cell Signaling Technology, Inc.)。还存在用于在细菌(例如大肠杆菌(Clontech Laboratories))或表皮葡萄球菌(Franke etal. , 2007. Journal of Microbiological Methods 71:123-132)中鉴别对 GFP 蛋白进行编码基因的特异性变异体的PCR型分子诊断测定法。Walsh和同事(Walsh et al. , 2000. Journal of General Virology, 81, 709-718)提出了 GFP作为兽医疫苗标志物的可能用途。然而，他们未能将它适当地表达于牛瘟病毒中。
本发明的诸位发明人说明了流产布鲁氏菌S19的衍生菌株(原型疫苗S19-GFPp)如何能够以稳定方式表达GFP，而不改变参照菌株S19的微生物学或生物学特征(减毒作用以及对抗实验动物体内感染的疗效)，以及还有如何能够诱导通过可以区别已经免疫接种的宿主以及用布鲁氏菌强毒株感染的那些宿主的特异性血清学试验可检出的抗-GFP抗体应答。他们还说明了能够特异性鉴别已经用表达GFP蛋白的新疫苗免疫的动物的血清学诊断的间接ELISA法。因此，本发明的第一方面涉及稳定地表达绿色荧光蛋白(GFP)、能够在宿主体内引发可与通过参考疫苗菌株诱导的免疫应答相比较的免疫应答，还产生可通过特异性血清学方法检出的抗-GFP抗体的布鲁氏菌菌株在开发药物中的用途；或可替代地，稳定地表达绿色荧光蛋白(GFP)并且能够在宿主体内诱发可与通过参考疫苗菌株诱导的免疫应答相比较的免疫应答，还产生可通过特异性血清学方法检出的抗-GFP抗体的布鲁氏菌菌株，用于作为药物的用途。在本发明这个方面的一个优选实施方式中，该药物是疫苗。本发明的另一个方面涉及稳定地表达绿色荧光蛋白(GFP)、能够在宿主体内诱发可与通过参考疫苗菌株诱导的情况相比较的免疫应答，并且还产生可通过特异性血清学方法检出的抗-GFP抗体的布鲁氏菌菌株在开发用于在哺乳动物体内预防或治疗布鲁氏菌病药物中的用途；或可替代地，稳定地表达绿色荧光蛋白(GFP)、能够在宿主体内诱发可与通过参考疫苗菌株诱导的情况相比较的免疫应答，并且还产生可通过特异性血清学方法检出的抗-GFP抗体的布鲁氏菌菌株，用于预防或治疗哺乳动物体内布鲁氏菌病。在此，布鲁氏菌是指可以定义为在分类学上属于细菌域(domain)的变形菌门α变形菌纲根瘤菌目布鲁氏菌科布鲁氏菌属的任何细胞生物体。术语“哺乳动物”是指真核生物域(domain)的后生动物界索动物门有头动物亚门颚口动物超纲哺乳动物纲的任何生物。反刍动物是指属于劳亚兽超目反刍亚目的任何哺乳动物。并且牛、绵羊以及山羊是指可以归类为属于牛科的任何哺乳动物。由多管水母(维多利亚多管水母、多管水母、A. forskalea)产生的绿色突光蛋白GFP是在可见光谱的绿色区域中发射生物发光的蛋白。在本发明的上下文中，还通过核苷酸或多核苷酸序列来定义GFP，该序列是编码GFP蛋白的序列，并且该序列可以包括源自以下的数个变异体a)编码包括SEQ ID NO: I的氨基酸序列的多肽的核酸分子，b)其互补链与a)多核苷酸序列杂交的核酸分子，c)由于遗传密码的简并其序列与a)和/或b)不同的核酸分子，d)编码多肽的核酸分子，该多肽包括与SEQ ID NO: I至少80%、90%、95%、98%或99%一致的氨基酸序列，其中由所述核酸编码的多肽具有GFP蛋白的活性以及结构特征。在本发明的另一个优选实施方式中，该布鲁氏菌菌株属于流产布鲁氏菌。在本发明的这个方面的一个甚至更优选的实施方式中，该布鲁氏菌菌株是从参考菌株流产布鲁氏菌 S19 衍生的菌株(0ΙΕ Terrestrial Manual, 2009-Chapter 2.4.3·-)。在另一个优 选实施方式中，该布鲁氏菌菌株属于马尔他布鲁氏菌。在本发明这个方面的一个甚至更优选的实施方式中，该布鲁氏菌菌株是从参考菌株马尔他布鲁氏菌Revl衍生的菌株(0ΙΕTerrestrial Manual, 2009-Chapter 2. 7. 2.-)。“流产布鲁氏菌S19”或“流产布鲁氏菌bv. lstr. S19”是由John Buck博士于1923年发现的自发减毒株，自从二十世纪三十年代早期以来它被世界范围地用作有效疫苗用来预防动物体内的布鲁氏菌病并且是举世公认的用于控制牛布鲁氏菌病的参考疫苗(0ΙΕ Terrestrial Manual, 2009-chapter 2. 4. 3.-)。原种批次可在美国农业部(USDA,国立兽医服务实验室(National Veterinary Services Laboratories) , NVSL-, 1800DaytonRoad, Ames, Iowa 50010,美国)以及在兽医实验室机构的OIE的布鲁氏菌病参考实验室(VLA, ffeybridge, New Haw, Addlestone, Surrey KT15 3NB, United Kingdom)得到。该菌株还称为 NCTC 8038 (http://www. broadinstitute. org/annotation /genome /brucella_group /GenomeDescriptions.html)。“马尔他布鲁氏菌Revl”，“马尔他布鲁氏菌bv. lstr. Rev. I”是称为NCCBV4a (http ://www.broadinstitute.org/annotation/genome/brucella_group/GenomeDescriptions. html)的菌株，它是自发减毒的并且通过与链霉素依赖性相关联的连续自发突变以及随后反转该依赖性从强毒株马尔他布鲁氏菌6056获得(Herzberg and Elberg 1953.Journal of Bacteriology 66:585-599;Herzberg andElberg 1953. Journal of Bacteriology 66:600-605·)。自从五十年代以来，Revl菌株已经在世界范围内用作唯一有效疫苗用来预防小型反刍动物体内的布鲁氏菌病，并且举世公认为该参考疫苗能够控制牛和山羊的布鲁氏菌病(0ΙΕ TerrestrialManual, 2009-chapter 2. 7. 2. -)。Revl的原种批号可在AFSSA的OIE的布鲁氏菌病参考实验室(94706Maisons_Alfort，France)以及在欧洲药典(European Pharmacopoeia) (BP907, 67029Strasbourg Cedex I,法国(France))得到。在本发明的一个优选实施方式中，该哺乳动物是反刍动物。在本发明的另一个优选实施方式中，该哺乳动物是牛，并且甚至更优选地属于牛或山羊亚科。本发明的另一个方面涉及包括表达GFP蛋白的布鲁氏菌菌株，以及优选地药学上可接受载体的组合物，以下称为“本发明组合物”。在一个优选实施方式中，该布鲁氏菌菌株属于流产布鲁氏菌(物种)。在本发明这个方面的一个甚至更优选的实施方式中，该布鲁氏菌菌株是从流产布鲁氏菌S19衍生的菌株。在另一个优选实施方式中,布鲁氏菌菌株属于马尔他布鲁氏菌。在本发明这个方面的一个更优选的实施方式中，布鲁氏菌菌株是从马尔他布鲁氏菌Revl衍生的菌株。在另一个优选实施方式中，该组合物是疫苗。在另一个更优选的实施方式中，本发明的组合物进一步包括佐剂。在另一个更优选的实施方式中，包括表达GFP蛋白的布鲁氏菌菌株的本发明的组合物进一步包括另一种活性成分。可以配制本发明的组合物用于以现有技术中已知的多种方式施用到动物，并且更优选地哺乳动物体(包括反刍动物)内，用作免疫原。这些免疫原还可以在动物体内，并且更具体地在哺乳动物体内用作疫苗，或用于在其中在抗体生产中产生应答。为了配制这类组合物，使免疫学有效量的布鲁氏菌菌株与适合施用于哺乳动物(包括人类)体内的生理学可接受的载体相混合。因此，本发明的组合物可以在无菌水溶液中或在生物流体例如血清中存在，但不限于此。这些水溶液可以是缓冲的或非缓冲的并且具有另外的活性或非活性组分。另外的组分包括用于调节离子强度的盐类，防腐剂类包括但不限于抗微生物剂类、抗氧化剂类、螯合剂类等，以及营养物类包括但不限于葡萄糖、右旋糖、维生素以及矿物质。可替代地，可以制备以固体形式施用的活性成分。该活性成分可以与多种惰性载体或赋形剂结合，包括但不限于粘合剂类例如微晶纤维素、黄蓍树胶或明胶；赋形剂类例如淀粉或乳糖； 分散剂类例如海藻酸或玉米淀粉；润滑剂类例如硬脂酸镁、助流剂类例如胶体二氧化硅；甜味剂类例如鹿糖或糖精；或调味剂类例如胡椒薄荷或水杨酸甲酯。本发明的组合物能够以多种形式(包括但不限于腹膜内、静脉内、肌内、皮下、结膜、鞘内、心室内、口腔、肠内、肠胃外、鼻内或皮肤给药)施用到动物体内，包括哺乳动物，优选反刍动物，并且甚至更优选属于牛或山羊亚科。得到治疗有效量的剂量取决于动物，优选哺乳动物的多种因素(例如年龄、体重、性别、生理状态-例如怀孕或哺乳状态-免疫系统的耐受情况)。如在此使用的，术语“治疗有效量”是指稳定表达GFP蛋白，产生希望效果的(产生免疫性以及抗GFP抗体)布鲁氏菌的数量。可以用于这类组合物中的“佐剂”和“药学上可接受的载体”是本领域普通技术人员已知的。在此，术语“药物”是指用于在人类和动物体内预防、诊断、缓解、治疗或治愈疾病的任何物质。在本发明的上下文中，它涉及包括稳定表达GFP蛋白的布鲁氏菌菌株的组合物，并且该菌株能够产生对抗布鲁氏菌病的免疫性以及抗GFP的抗体，或涉及包括稳定表达GFP蛋白的布鲁氏菌的组合物以及药学上可接受的载体和/或另外地一种佐剂，该组合物能够产生对抗布鲁氏菌病的免疫性以及抗GFP的抗体。因此术语药物包括疫苗。在本发明的上下文中，术语“疫苗”是指用于建立免疫系统对疾病应答的抗原性组合物或制剂。它是指一旦进入体内就通过产生抗体引起免疫系统应答的抗原制剂，并且生成免疫记忆,产生永久性或暂时性免疫性。在本说明书中，术语“佐剂”是指虽然本身不具有抗原性作用单抗原刺激免疫系统增加其对疫苗应答的试剂。虽然不限于下面各项，铝盐“磷酸铝”和“氢氧化铝”是在疫苗中两种最常用的佐剂。还抗原使用其他物质(例如鲨烯)作为佐剂。如在此使用的，术语“活性要素”、“活性物质”、“药学上活性物质”、“活性成分”或“药学上活性成分”是指在诊断、治愈、缓解、治疗、或预防疾病方面提供潜在药理学活性或另一种不同作用的任何组分，或它影响了人体或其他动物的结构或功能。该术语包括在制备药物中促进化学改变并且以预见改变的形式存在于其中的那些组分，该改变的形式提供特异性活性或效果。本发明的另一个方面涉及用于鉴别用本发明菌株或组合物接种的哺乳动物的方法，以下称为“本发明方法”，包括a)从哺乳动物体内获得分离的生物样品，b)在分离的哺乳动物生物样品中检测编码GFP蛋白的gfp基因，或它们的表达产物的存在。在本发明这个方面的一个优选实施方式中，该哺乳动物是反刍动物。在本发明的另一个优选实施方式中，该哺乳动物是牛、绵羊或山羊，并且甚至更优选地属于牛和山羊亚科。“分离的生物样品”包括但不限于通过本领域普通技术人员已知的任何方法获得 的哺乳动物的细胞、组织和/或生物流体。在一个优选实施方式中，该分离的生物样品是生物流体，例如但不限于奶、精液、精液流体、阴道排出物、结膜排出物、血液、血浆或血清。更优选地，该生物流体是血清。在另一个优选实施方式中，该分离的生物样品是在哺乳动物的血液、乳汁、精液、阴道排出物或结膜分泌物中找到的细胞。在另一个优选实施方式中，它包括细胞或组织。用于在分离的生物样品中检测gfp基因或其表达产物存在的多种方法是现有技术中已知的。在此“gfp基因的表达产物”包括但不限于GFP蛋白例如对抗所述蛋白或抗原由哺乳动物的免疫系统产生的两种抗-GFP抗体。因此，在本发明这个方面的另一个优选实施方式中，在分类的哺乳动物生物样品中检测gfp基因或其表达产物的存在是通过检测抗GFP蛋白的抗体(抗GFP抗体)来实现的。检测抗GFP抗体可以通过现有技术中已知的任何方法来实现例如但不限于通过免疫测定法或免疫组织化学。在一个更优选的实施方式中，该免疫测定法是酶联免疫吸附测定法或ELISA。抗原或免疫原是能够通过活化淋巴细胞产生适当免疫应答的物质。抗原通常地是蛋白或多糖。只有当与蛋白或多糖结合时，脂类和核酸才是抗原性的。如在此使用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含与GFP蛋白(抗原)特异性结合(免疫反应)的抗原结合位点的分子。存在免疫球蛋白的五个主要同型或类别IgM、IgD、IgG、IgA 以及 IgE。术语“抗-GFP抗体”是指能够与GFP蛋白反应，与GFP蛋白变异体或其片段反应的抗体，其条件是所述变异体或片段是功能上等效的。优选地，术语抗GFP抗体是指免疫球蛋白 G (IgG)ο如在本说明书中使用的术语“免疫测定”是指基于抗体与抗原偶联反应的任何分析技术。现有技术中已知的免疫测定法的实例是但不限于免疫印迹、酶联免疫测定(ELISA)、线性免疫测定(LIA)、放射性免疫测定(RIA)、免疫荧光、x_谱图或蛋白或脂多糖芯片(LPS)。如所述，在本发明这个方面的一个优选实施方式中，该免疫测定法是酶联免疫吸附测定法或 ELISA (Enzyme-Linked TmmunoSorbent Assay)。ELISA 是基于这种假设即抗原将免疫试剂(抗原或抗体)固定在固体支持物上，然后使该系统与包含可以结合到标志物化合物上的互补试剂的流体相接触。存在不同类型的ELISA :直接ELISA，间接ELISA以及夹心ELISA。本发明的诸位发明人说明了能够鉴别已经用新疫苗原型S19-GFPp接种的动物并且将它们与用布鲁氏菌强毒株感染的那些动物区分开的血清学诊断的方法。在一个更优选的实施方式中，该ELISA是间接ELISA，并且甚至更优选地它包括下面步骤(a)用至少该GFP蛋白、所述蛋白的变异体、或其片段包被(涂覆,coating)固体支持物；(b)在允许至少抗该GFP抗原的抗体与其变异体或片段形成免疫复合物的条件下 用从哺乳动物体内得到的生物学样品孵化来自前面步骤的浸溃的支持物；以及(c)与二抗一起孵化，该二抗识别偶联或结合到标志物分子上的抗GFP抗原的抗体。如在此使用的术语“标志物化合物”是指能够产生允许检测抗GFP抗体的生色、生荧光、放射性和/或化学发光信号的化合物。该标志物化合物是选自下列，包括放射性同位素类、酶类、荧光团类或能够与另一种分子结合或检测和/或直接定量的任何分子。该标志物化合物可以通过另一种化合物直接地或间接地结合到抗体上。直接结合的标志物化合物的实例是，但不限于，酶类例如碱性磷酸酶或过氧化物酶，放射性同位素类例如32P或35s，荧光团类例如荧光素、若丹明或它们的衍生物类，或金属颗粒类，用于对应地通过比色法、放射性自显影、荧光测定法、或金相学直接检测。在另一个优选实施方式中，在分离的哺乳动物生物样品中检测gfp基因或其表达产物的存在是通过紫外照射所述样品来实现的。在另一个更优选的实施方式中，在分离的哺乳动物生物样品中检测gfp基因或其表达产物的存在是通过荧光显微术来实现的。在另一个优选实施方式中，在分离的哺乳动物生物样品中检测gfp基因或其表达产物的存在是通过聚合酶链式反应(PCR)来实现的。本发明的另一个方面涉及用于鉴别用本发明菌株或组合物免疫的哺乳动物的“试剂盒”，包括用于实现本发明方法的适当装置。所述试剂盒可以包含使用上文中所述方法中任何一种对于分析在分离的哺乳动物生物样品中存在gfp基因或其表达产物所必要的所有那些试剂，例如但不限于GFP蛋白的特异性抗体，或二抗或阳性和/或阴性对照。该试剂盒还可以包括但不限于缓冲剂类、蛋白提取溶液类、用于防止污染的试剂类、蛋白降解抑制剂类等。在通过涉及聚合酶链式反应(PCR)技术进行检测的情况中，它可以包含，但不限于，引物、探针以及对于确定gfp基因或其表达产物的存在所必要的所有试剂。该试剂盒还可以包括但不限于使用缓冲剂、聚合酶、用来获得其最佳活性的辅因子、用于防止污染的试剂等。另一方面，该试剂盒可以包括所有支持物装置以及用于将它投入实践以及优化所需要的容器。优选地，该试剂盒进一步包括用于实现本发明方法的说明书。术语“多核苷酸”和“核酸”在此可互换地使用，是指任何长度核苷酸的聚合物形式，核糖核苷酸(RNA)和脱氧核糖核苷酸(DNA)两者。术语“氨基酸序列”、“肽”、“寡肽”、“多肽”以及“蛋白”在此可互换地使用，并且是指化学或生物化学修饰的任何长度氨基酸的聚合物形式。贯穿本说明书以及权力要求书，词语“包括”以及它的变化不旨在排除其他技术特征、添加剂、组分或步骤。对于本领域普通技术人员而言，部分地从本说明书以及部分地从本发明的实践本发明的其他目标、优点以及特征将变得清楚。下面实例和附图是作为举例说明来提供的并且不旨在限制本发明的范围。图I.在胰蛋白酶解酪蛋白大豆琼脂平板中新疫苗-GFPp S19以及亲本疫苗S19的生长，在Bio-Rad生产的“Gel Doc”设备中在用紫外光照射，并且用适当的滤光片(520DF30nm, Bio Rad) (A)或在荧光显微镜中(B)进行显影。图2.与强毒株流产布鲁氏菌2308相比较在新疫苗S19_GFPp中ery区域(低分子量)的PCR扩增。图3.在感染之后I小时，在用新疫苗S19-GFPp或用亲本菌株S19感染的HeLa细胞中的细胞内和细胞外细菌比率。这些HeLa以200CFU/细胞来感染并且I小时之 后，按照前面说明的实验方案(Chaves-Olarte et al. , 2002. Cellular Microbiology4(10) :663-675)用若丹明和FITC通过双重免疫荧光进行固定和标记。图4.在感染后48小时在HeLa细胞以及RAW 264. 7巨噬细胞中新疫苗S19-GFPp以及亲本菌株S19的复制。以200CFU/细胞来感染细胞并且按照前面说明的实验方案来确定CFU/mL的数量(Chaves-Olarte et al. , 2002. CellularMicrobiology 4 (10):663-675;CelIi et al.,2003.Journal of ExperimentalMedicine, 198(4):545-556)。图5.在鼠类模型中新疫苗S19-GFPp以及亲本菌株S19的脾动力学。用IxlO5CFU的新疫苗S19-GFPp或亲本菌株S19来腹膜内地接种30只小鼠的组。在感染后第7、14、25、40以及60天，按照前面说明的实验方案(Sangari et al.，1998.Vaccine, 16 (17) : 1640-1645)将来自每组的6只小鼠处死用来确定每个疫苗菌株CFU/脾的数量并且构建脾繁殖的相应曲线。图6.在用新疫苗S19-GFPp免疫的BALB/c小鼠体内的保护测定。用IxIO5CFU新疫苗S19-GFPp或亲本菌株S19皮下地免疫6只小鼠的组。作为对照，用无菌PBS来接种一组小鼠。在60天之后，用5x104CFU参考强毒株流产布鲁氏菌对2308所有小鼠进行实验地腹膜内感染并且2周后，处死用来对每个脾2308的CFU数量进行计数。用S19-GFPp接种的动物显示与通过参考疫苗S 19所显示相类似水平的保护。图7.在用新疫苗S19-GFPp以及亲本菌株S19免疫的小鼠体内对抗布鲁氏菌LPS的抗体应答。在未免疫的小鼠(对照)体内以及在免疫之后第7、14、25以及60天在用IxIO5CFU新疫苗S 19_GFPp或亲本菌株S19腹膜内免疫的小鼠体内得到血清样品。将这些血清1/200稀释于PBS中并且在405nm下以通常地用于诊断动物布鲁氏菌病的抗LPS的间接ELISA来测量它们的光密度(0D)。图上每个点表示基于来自不同小鼠5个血清的平均值。所有动物都产生抗布鲁氏菌LPS的抗体。图8在获得重组蛋白GST-GFP的鼠体内确定纯度和免疫原性。A)通过亲和性纯化的重组蛋白GST-GST在SDS-PAGE中显示单一条带。B)在小鼠体内用作免疫原的GST-GFP蛋白诱导了抗GFP抗体。用对抗10yg/30yLGFP(孔G)的单特异性血清的连续稀释液(孔2至32)进行免疫扩散反应，并且作为对照，仅使用PBS (孔_)。沉淀条带显示在小鼠体内得到的抗-GFP免疫血清显示1/16的滴度。图9.使用来自先前用重组蛋白GST-GFP免疫的小鼠(a)或绵羊(b)的血清发展的ELISA-GFP中标准曲线。图10.在来自用新S19-GFPp疫苗或参考疫苗S19接种的小鼠的血清中抗GFP的抗体应答强度。根据相对于对照样品阳性率百分比(阳性血清的OD/血清样品的ODX 100)计算出每个个别血清的反应强度。每个点表示基于来自不同小鼠10个血清的平均值。


通过用编码GFP的质粒进行电穿孔对参照疫苗流产布鲁氏菌S19 (从法国AFSSA的OIE布鲁氏菌病参考实验室得到)进行基因修饰。所使用的质粒是从质粒pBBRMCS-2衍生的pBBR-2-gfp,它包含卡那霉素耐受性插入片段(Kovach et al. , 1995. Gene. Vol166:175-176)以及具有处于Iac启动子控制下的编码GFP基因的插入片段。已知的是这种质粒构成型地(constitutively)生产GFP,而不整合到布鲁氏菌染色体中(Celli etal. , 2003. Journal of Experimental Medicine, 198(4):545-556)。2. _S19_GFPp的遗传以及微生物学表征2. I.已经发现的是细菌S19-GFPp发出可通过用紫外光直接照射培养物并且随后用适当的滤光片对其进行显影(图1A)或通过在荧光显微镜下观察感染的组织或渗出物(图1B)而检测的荧光。因此，质粒pBBR-2-gfp允许以适当比例在布鲁氏菌中表达GFP使得在分离之后可能视觉地鉴别新疫苗S19-GFPp。2.2.已经发现的是GFP蛋白在布鲁氏菌中的表达未改变细菌培养物中S19的克隆大小以及阶段、或它的典型细菌学特征。为此，通过在氟化3天之后在琼脂平板上获得的克隆测量直径来确定克隆大小。平行地，通过在斜光照明的透镜中并且用结晶紫-草酸盐溶液使用泛滥技术染色来观察细菌生长从而确定克隆阶段(Alton et al. 1988. Techniquesfor the brucellosis laboratories. In. INRA(Ed.)，Paris, France, 1988，190pp)。另外，使用用于鉴别以及分型布鲁氏菌的标准技术对得到的新菌株进行微生物学分析。简言之，通过测试过氧化氢酶、氧化酶、脲酶以及吖啶黄素凝集来进行属水平的鉴定。对于种水平的鉴定，使用对细菌噬菌体Tb、Wb、Iz以及R/C灵敏度的测试。最后，对于生物变种水平的分型使用凝集测试，其中在琼脂平板上进行单特异性血清抗-A和抗-M以及生长测试并且琼脂补充有10%无菌牛血清(琼脂-s; Seromed, Biochrom)包含标准浓度的染料(20 μ g/mL硫堇、20 μ g/mL品红以及100 μ g/mL番红；Panreac)、抗生素(5UI/mL青霉素；Sigma)以及赤藓醇(lmg/mL ；Merck)。在37° C下在需氧气氛中，并且平行地在具有10%C02的气氛中将包含具有或不具有不同浓度的所有这些产品的琼脂以及琼脂-S (对照平板)的平板孵育 2-4 天(Alton et al. 1988. Techniques for the brucellosis laboratories. In. INRA (Ed.), Paris, France, 1988, 190pp)。2. 3.已经发现的是在菌株S19-GFPp中携带gfp基因质粒的结合以及活性两者在它体外以及体内活化之后是稳定的。在这个方面，实现在琼脂平板上将菌株S19-GFPp连续传代，并且在数个连续传代之后，在琼脂平板以及补充有卡那霉素的琼脂(用作质粒标志物的抗生素)中进行细菌计数。其结果是，观察到在两种培养基中CFU的数量是类似的并且观察到所有S19-GFPp CFU保持荧光，表明在体外十二次传代之后在流产布鲁氏菌S19中GFP质粒的结合以及活性是稳定的。在从细胞培养物中四个连续传代以及在前面用S19-GFPp接种的小鼠组织中三个连续传代(参见下面显示的生物学表征研究)中分离细菌之后进行同样试验，表明甚至在体内、在细胞培养物以及实验动物体(小鼠)内细菌活化之后在流产布鲁氏菌S19中GFP质粒的结合和活性是稳定的。在-80° C或-20° C下在50%甘油中冷冻之后在流广布鲁氏囷S19中编码GFP蛋白的质粒保持稳定，表明所有恢复的克隆在融化之后放射荧光。2. 4.已经发现的是菌株S19-GFPp保持流产布鲁氏菌S19的典型基因型，保留在基因ery中702个bp (碱基对)的特征性缺失(低分子量条带，图2)并且有可能从流产布鲁氏菌的强毒株中区别疫苗菌株S19 (高分子量条带，图2)。
3.-在广泛用于实验性布鲁氏菌病的细胞以及动物模型(小鼠)体内S19-GFPp的生物学表征。3. I.在细胞模型发现的是3.1.1.-新疫苗S19-GFPp具有附着以及内化到人上皮HeLa细胞中的能力，这些细胞实质上与参考疫苗相同(图3)。3.1.2.-新疫苗S19-GFPp在HeLa细胞中以及在巨噬细胞中的复制能力实质上与亲代菌株S19相同(图4)。3.2.在动物模型中发现的是3.2.1.-新疫苗S19-GFPp在小鼠体内具有减毒作用，它实质上与典型疫苗S19相同(图5)，表明所使用的gfp基因表达未改变典型亲本疫苗的脾动力学(繁殖以及持久性能力)。3. 2. 2.-新疫苗S19-GFPp提供了保护作用，这实质上与在小鼠模型中典型亲本疫苗所提供的相同(图6)，表明GFP表达未消除典型亲本疫苗S19的有效性。3.2.3.-通过对抗 LPS 的常规的间接 ELISA (Marin et al. , 1999.Clinical&Diagnostic Laboratory Immunology 6(2):269-272)测量的，由新疫苗S19-GFPp诱导的，对抗流产布鲁氏菌LPS抗原的抗体应答，与通过典型疫苗S19产生的相类似(图7)。这表明新疫苗S19-GFPp保持其免疫原性特性的完整性。3. 2. 4.-在布鲁氏菌S19-GFPp疫苗菌株中表达的GFP在动物体内是高免疫原性的。在免疫接种之后用S19-GFPp免疫的所有小鼠都产生了对GFP的特异性抗体持续至少90天，其中在于此说明的ELISA-GFP原型中阳性率约40% (在统计上大于阳性对照所显示的)。4.-用于检测在免疫小鼠体内由S19-GFPp产生的抗体的间接ELISA的设计和标准化(ELISA-GFP)。4.1.首先，根据前面所述的实验方案对重组GFP蛋白(GST-GFP)进行表达以及纯化(Harlow and Lane 1988. Antibodies: a laboratory manual. 1st. Ed. Cold SpringHarbor Laboratory, NY p. 179-179)。简言之，在具有质粒pGEX-GFP的大肠杆菌XLl-蓝色系统中表达融合蛋白GST-GFP，通过亲和层析法对它进行纯化并且通过丙烯酰胺凝胶电泳对它的纯度进行确定(图8A)。4.2.随后，按照常规的免疫实验方案在小鼠体内得到抗GFP的对照血清。为此，施用具有弗氏完全佐剂的100 μ g GST-GFP蛋白的注射剂，紧接着以一周的间隔用具有弗氏非完全佐剂的GST-GFP蛋白进行2次连续的免疫。进行免疫持续数周直至证实用GST-GFP免疫的动物血清在对抗纯GFP蛋白的凝胶免疫扩散中显示沉淀条带(图SB)。这些对照抗体显示与任何布鲁氏菌抗原无交联反应(结果未显示)。另外，按照常规免疫实验方案在绵羊体内得到抗GFP的对照血清。为此，注射具有弗氏完全佐剂的IOOyg GST-GFP蛋白，紧接着以两周间隔用具有弗氏非完全佐剂的GST-GFP蛋白进行5次连续免疫。进行免疫持续2个月直至证实用GST-GFP免疫的动物血清在对抗纯GFP蛋白的凝胶免疫扩散中显示沉淀条带(结果未显示)。这些对照抗体显示与任何布鲁氏菌抗体无交联反应(结果未显示)。4. 3.为了对能够在绵羊血清中以及接种有新疫苗S19-GFPp的小鼠血清中特异性检测对抗GFP蛋白的抗体的间接ELISA进行标准化(ELISA-GFP)，步骤如下
4. 3. I.用包含在一个体积100 μ L/孔处于PBS (PBST，Sigma)中的O. 01%吐温20缓冲液中的I μ gGST-GFP/孔包被96孔板Immunolon II (Nunc Co.)的多个板。用粘性塑料(Sigma)覆盖这些孔板并且在37° C下孵育2小时同时搅拌，紧接着在4° C下不搅拌另外孵育15小时。最后，将30%甘油添加到各孔中，用粘性塑料覆盖这些孔板并且在-20° C下冷冻直至使用。4. 3. 2.为了用小鼠血清建立校准曲线，在部分4. 3. I中所述的孔板允许在室温下融化并且用包含处于PBS(PBST-BSA)中O. 01%吐温以及O. 1%脱脂牛白蛋白的溶液洗涤4次。然后，一式三份地添加处于1/300至1/60000间来自在部分4. 2.中所述小鼠的抗-GFP免疫血清的lOOyL/孔稀释剂。作为阴性对照，使用来自无布鲁氏菌小鼠的常规血清，并且使用PBS作为空白。在25° C下将这些孔板孵育I小时同时搅拌，用PBST-BSA洗涤4次，添加对抗小鼠IgG(H+L)偶联到过氧化物酶(HRP)上的偶联物(从兔体内得到的);如前面所述第二次将它们孵育(在25° C下I小时，同时搅拌)并且洗涤(4次)，并且最后添加ABTS过氧化物酶底物(Sigma)。在ELISA酶标仪中在405nm波长下完成在每孔中产生的OD读数并且如图9. a.中所示建立标准曲线。4. 3. 3.为了用绵羊血清建立校准曲线，在部分4. 3. I中所述的孔板允许在室温下融化并且用包含处于PBS(PBST-BSA)中O. 01%吐温以及O. 1%脱脂牛白蛋白的溶液洗涤4次。然后，一式三份地添加处于1/59至1/128000之间的在点4. X中所述来自绵羊的抗-GFP免疫血清的100 μ L/孔稀释液。关于阴性对照，使用来自无布鲁氏菌免疫的常规血清，并且将PBS用作空白。在37° C下将这些孔板孵育I小时同时搅拌，用PBST洗涤4次；将蛋白G-过氧化物酶(Sigma)添加到处于pH 7. 2PBS中1:2000的稀释液中；如前所述第二次将它们孵育(在25。C，I小时，同时搅拌)并且洗涤(4次)，并且最后添加ABTS过氧化物酶底物(Sigma)。在ELISA酶标仪中在405nm波长下完成在每个孔中产生的CD的读数并且如图9. b.中所示建立标准曲线。4.3.4.为了确定在用新疫苗接种的小鼠体内诱导的抗GFP抗体应答的强度，使用来自用新疫苗S19-GFPp或来自未标记的亲本菌株S19的疫苗接种(IxIO5CFU/小鼠，腹膜内地)的小鼠体内的“问题”血清，并且在免疫之后3至14周之间对动物周期性地取血(图10)。关于阳性对照，使用如在部分4. 2.中说明的血清，并且关于阴性对照，使用在部分4. 3. 2中说明的那些。所有这些血清以1/200的比例稀释于PBST中并且如下完成ELISA-GFP :如在部分4. 3. 2中所述对在部分4. 3. I中所述的孔板进行洗涤；然后添加100 μ I/孔的上述血清(1/200稀释)或100μ I/孔的PBS (作为反应的空白)，并且最后，如4. 3. 2中所述对这些孔板进行处理。相对于阳性对照血清(100%阳性)和空白样(0%阳性)的光密度(OD4tl5=O. 9)计算出每个单独血清的阳性率百分比。用S19-GFPp接种的所有动物显示抗GFP的强烈血清学反应(约40%阳性；图10)而用菌株S19接种的动物行为类似于无布鲁氏菌的那些(阴性对照)，无对抗GFP蛋白的反应(图10)。总之，这项工作显示可以在布鲁氏菌疫苗菌株中表达GFP蛋白而不改变亲本菌株的生物学特性，同时在动物体内诱导可与由其他布鲁氏菌菌株诱导的清楚地区别开的血清学应答。可以通过对抗在该亲本体内发展的GFP的间接ELISA来鉴别对抗GFP蛋白产生的抗体。此外，该gfp基因结合到布鲁氏菌体内提供了视觉鉴定(通过紫外光或荧光显微镜) 以及分子鉴定(通过PCR扩增该gfp基因；PCR-GFP)两者从细菌培养物以及组织样品、渗出物或动物流体发展的布鲁氏菌疫苗菌株。


本发明涉及表达绿色荧光蛋白(GFP)的布鲁氏菌菌株在制备用于预防哺乳动物体内布鲁氏菌病的药物中的用途，涉及对抗布鲁氏菌病的疫苗，以及涉及用于鉴别已经施用所述疫苗的哺乳动物的方法。优选地，本发明方法是免疫测定法，并且更优选地它是酶联免疫吸附测定法(ELISA)。