专利名称：内切－β－1,4－葡聚糖酶的制作方法纤维素为通过β-1，4-糖苷键连接的葡萄糖多聚体。纤维素链形成众多分子内和分子间氢键，这导致形成不溶性的纤维素微丝。微生物将纤维素水解为葡萄糖涉及以下三类主要的纤维素酶(i)在纤维素分子中随机切割β-1，4-糖苷键的内切-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)，也称作内切-β-1，4-葡聚糖酶；(ii)从非还原末端消化纤维素而释放纤维二糖的纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)；以及(iii)水解纤维二糖和低分子量纤维糊精以释放葡萄糖的β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)。β-1，4-糖苷键也存在于其他天然多聚体内，例如存在于来自如大麦和燕麦等植物的β-葡聚糖中。在一些情况下，内切葡聚糖酶也可以水解此类非-纤维素多聚体。纤维素酶由多种微生物产生且经常以多种形式存在。对酶促降解纤维素的经济学重要性的认识已推动了可工业应用的微生物纤维素酶的广泛研究。结果是，已对大量纤维素酶的酶学特性和一级结构进行了研究。根据对催化结构域氨基酸序列的疏水簇的分析结果，这些纤维素酶已被归入不同的糖基水解酶家族；真菌和细菌糖基水解酶已被划分成35个家族(Henrissat，B.基于氨基酸序列相似性对糖基水解酶的分类，生物化学杂志(Biochem.J.)280(1991)，309-316；Henrissat，B.，和Bairoch，A.基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶分类中的新家族，生物化学杂志(Biochem.J).293(1993)，781-788.)。大多数纤维素酶由纤维素结合结构域(CBD)和催化结构域(CAD)组成，二者由可富含脯氨酸和羟基氨基酸残基的连接物分开。已经基于CBD的类似性建立了纤维素酶的另一分类方法(Gilkes等.(1991))，此方法将糖基水解酶分成5个家族。纤维素酶可以由多种微生物合成，包括真菌、放线菌、粘细菌和真细菌，也可以由植物合成。特别是已鉴定出具有各种专一性的内切-β-1，4-葡聚糖酶。许多细菌内切葡聚糖酶已有描述(Gilbert，H.J.和Hazlewood，G.P.(1993)普通微生物学杂志(J.Gen.Microbiol.)139187-194；Henrissat，B.，和Bairoch，A.基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶分类中的新家族，生物化学杂志(Biochem.J.)293(1993)，781-788.)。纤维素水解酶的一个重要工业应用是用于处理纸浆，如用于改善滤水或用于再生纸的脱墨。纤维素水解酶的另一重要工业应用是用于处理纤维素纺织品或织物，如用作去污剂组合物或织物柔软组合物中的组分，用于新织物的生物抛光(衣件后处理)，以及用于获得含纤维素织物(特别是粗斜纹棉布)的“石洗”外观，且已提出了用于此类处理的几种方法，例如，在GB-A-1 368 599、EP-A-0 307 564、EP-A-0 435 876、WO 91/17243、WO 91/10732、WO 91/17244、WO 95/24471和WO 95/26398中。JP专利申请号13049/1999公开了一种适用于去污剂的来自芽孢杆菌属种KSM-S237(保藏号FERM P-16067)的耐热碱性纤维素酶。但仍持续需要提供新的纤维素酶或者酶制品以用于需要纤维素酶，优选地内切-β-1，4-葡聚糖酶活性(EC 3.2.1.4)的应用中。本发明的目的为提供新的酶和酶组合物，所述酶和酶组合物在微酸到碱性环境中具有实质上的β-1，4-葡聚糖酶活性，并在纸浆加工、织物处理、洗衣过程、提取过程或在动物饲料中具有改进的性能；优选地此新的性能优良的葡聚糖酶通过(或可以通过)应用重组技术以高产量产生。发明概述本发明人发现了具有实质上内切-β-1，4葡聚糖酶活性(根据酶命名法分类为EC 3.2.1.4)的新酶，该酶为芽孢杆菌属种AA349(DSM 12648)菌株的内源酶；此外本发明人已成功克隆和表达了编码该酶的DNA序列。本发明的内切β-1，4-葡聚糖酶所具有的稳定性和活性特征使其特别适用于涉及含表面活性剂和/或漂白剂的碱性水溶液的应用中。该应用条件非常普遍，既存在于家庭和工业去污剂及织物整理中亦存在于纤维素纸浆的生产或再循环中。
由于本发明的β-1，4-葡聚糖酶可以在此相关应用条件下异常高程度地维持其活性，因此认为当例如用于去污剂、用于纸/纸浆加工或用于织物处理时它将较其它已知的酶更为有用。
此外应指出的是，本发明的β-1，4-葡聚糖酶不会被Fe(II)离子显著失活。酶活性对铁离子存在的敏感性可限制酶的应用，所述应用如在金属容器中实施的方法。
因此，本发明的第一方面涉及具有内切-β-1，4-葡聚糖酶活性(EC 3.2.1.4)的酶，所述酶选自以下之一(a)SEQ ID NO1中全部或部分DNA序列编码的多肽；(b)通过培养包含SEQ ID NO1序列的细胞而产生的多肽，所述培养在该DNA序列得以表达的条件下进行；(c)具有如下序列的内切-β-1，4-葡聚糖酶，当通过GCG程序包中提供的GAP测定同一性时(使用的GAP创建罚分(creation penalty)为3.0且GAP延伸罚分(extensionpenalty)为0.1)，该序列与(I)SEQ ID NO2中1-773位或其具有内切-葡聚糖酶活性的片段、(II)SEQ ID NO2中1到约340位氨基酸序列和(III)SEQ ID NO2中从1位到约540和773位之间的氨基酸序列有至少97％、优选地98％、更优选地98.5％、甚至更优选地99％的同一性；和(d)具有内切-β-1，4-葡聚糖酶活性的多肽，其中编码该多肽的多核苷酸可以与SEQ ID NO1第1-2322位中所示核苷酸序列杂交，杂交条件包括45℃时5×SSC，洗涤条件包括60℃时2×SSC。在一优选实施方案中所述片段为由1到663±50位氨基酸、优选地由1到663±25位氨基酸组成的多肽。
本发明的第二方面涉及分离的多核苷酸分子，优选地DNA分子，所述分子编码具有内切-β-1，4-葡聚糖酶活性的酶的催化活性结构域，该分子选自(a)包含SEQ ID NO1第1到2322位核苷酸中所示的核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)(a)的物种同系物；(c)编码如下多肽的多核苷酸分子，所述多肽与SEQ ID NO2第1到773位氨基酸残基的氨基酸序列的同一性为至少97％、优选地为98％、更优选地为98.5％、甚至更优选地为99％；和(d)(a)或(b)的简并核苷酸序列；优选能够与变性双链DNA探针在严紧的介质条件下进行杂交的多核苷酸分子，其中所述探针选自包含SEQ IDNO1中1-2322位所示序列的DNA探针以及包含SEQ ID NO1的1-2322位中长度至少约100个碱基对的亚序列的DNA探针。
本发明的第三、第四和第五方面提供了包含DNA片段(例如，本发明的多核苷酸分子)的表达载体；包含该DNA片段或该表达载体的细胞；以及生产具有内切-葡聚糖酶活性的酶的方法，所述方法包括在允许该酶产生的条件下培养所述细胞并从培养物中回收该酶。
而在本发明的另一方面中提供了具有内切-β-1，4-葡聚糖酶活性的分离的酶，所述酶的特征在于(i)不含同源杂质，以及(ii)该酶由以上描述的方法产生。
在本发明的一优选实施方案中，本发明内切-葡聚糖酶在5-11的pH范围内(优选地具有最适pH6-10.5)，及20℃到60℃温度下显示出活性。
该内切-葡聚糖酶可以包含属于糖基水解酶家族5的催化活性结构域(该结构域与SEQ ID NO2的约1位到约340位对应)以及属于家族17的纤维素酶结合结构域(CBD)(该结构域与SEQ ID NO2的约341位到约540位对应)。SEQ ID NO2的其余部分为功能未知的结构域。
本发明的内切-葡聚糖酶对多种工业应用是有利的，特别是由于其具有改进的抗再沉积作用和去垢效果而可有利地用在去污剂组合物中，并可有利地用在织物处理中。
发明详述芽孢杆菌属种AA349菌株分离自源于希腊的土壤样本，其由本发明人根据国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约于1999年1月25日保藏在德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg lb，D-38124Braunschweig，联邦德国)，保藏号为DSM 12648。
此处应用的术语“功能性酶学特性”意指具有一种或多种催化活性的多肽的物理和化学特性。功能性酶学特性的示例为酶活性、酶比活性、与最大活性的相对酶活性(作为pH或温度的函数测定)、稳定性(随时间的过去酶活性的降低)、DSC熔解温度、N端氨基酸序列、分子量(通常用SDS-PAGE测定)、等电点(pI)。
本文中的术语“表达载体”指线性或环状的DNA分子，所述分子包含编码目的多肽的片段，该片段可操作地与用于其转录的额外片段连接。此额外片段可包括启动子和终止序列，并可任选地包括一个或多个复制起点、一个或多个选择标记、增强子、多聚腺苷酸化信号等。表达载体通常源自质粒或病毒DNA，或也可同时含有二者的元件。本发明的表达载体可以为可方便地进行重组DNA操作的任何表达载体，并且载体的选择常常依赖于载体将要导入的宿主细胞。这样，载体可为自主复制载体，即载体作为染色体外实体存在，载体的复制不依赖于染色体的复制，例如质粒。备选地，载体可以在导入宿主细胞时，与宿主细胞基因组整合并与所整合的染色体一同复制。
此处应用的与多肽或蛋白质表达相关的术语“重组表达的”或“进行重组表达的”根据本领域内的标准定义进行限定。蛋白质的重组表达通常通过应用如以上描述的表达载体进行。
术语“分离的”，当应用于多核苷酸分子时，指该多核苷酸已经从其天然遗传环境中移出并因此不含其他外来或不需要的编码序列，并且该多核苷酸的存在形式适于在遗传工程化蛋白质生产系统中应用。此分离分子为那些从其天然环境中分离的分子并包括cDNA和基因组克隆。本发明的分离的DNA不含通常与之关联的其他基因，但可包含天然存在的5′和3′非翻译区如启动子和终止子。关联区域的鉴定对本领域内的普通技术人员而言是显而易见的(参见例如，Dynan和Tijan，自然(Nature)316774-78，1985)。术语“分离的多核苷酸”或可称为“克隆的多核苷酸”。
当用于蛋白质/多肽时，术语“分离的”表示该蛋白质在非其天然环境的条件下存在。在一优选的形式中，分离的蛋白质基本不含其他蛋白质，特别是基本不含其他同源蛋白质(即″同源杂质″(参见以下))。优选提供纯度大于40％，更优选纯度大于60％的蛋白质。
甚至更为优选的是提供高纯化形式的蛋白质，即，通过SDS-PAGE所测定的纯度大于80％、更优选地纯度大于95％且甚至更优选地大于99％的蛋白质。
术语“分离的蛋白质/多肽”或可称为“纯化的蛋白质/多肽”。
术语“同源杂质”指源自最初获得本发明多肽的同源细胞的任何杂质(例如，非本发明多肽的另一多肽)。
此处应用的与特定微生物来源关联的术语“获得自”，指多核苷酸和/或多肽由此特定来源产生，或由已插入来自该来源的基因的细胞产生。
术语“可操作连接”，当涉及DNA片段时，指排列这些片段以使它们能协同地行使功能以达到它们的预期目的，例如，转录从启动子内开始并经过编码片段达到终止子。
术语“多核苷酸”指从5′向3′末端阅读的单链或双链脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的多聚体。多核苷酸包括RNA和DNA，并可从天然来源分离、在体外合成或通过天然分子和合成分子的组合来制备。
术语“多核苷酸分子的互补物”指具有与参考序列相比而言的互补碱基序列和相反方向的多核苷酸分子。例如，序列5′ATGCACGGG 3′与5′CCCGTGCAT 3′互补。
术语″简并核苷酸序列″指包括一个或多个简并密码子(与编码多肽的参考多核苷酸分子相比而言)的核苷酸序列。简并密码子含有不同的核苷酸三联体，但编码相同的氨基酸残基(即，GAU和GAC三联体均编码Asp)。
术语“启动子”是指这样的基因部分，其包含用于结合RNA聚合酶和起始转录的DNA序列。启动子序列通常，但并非总是，存在于基因的5′非编码区。
术语“分泌信号序列”是指编码多肽(“分泌多肽”)的DNA序列，所述多肽作为一较大多肽的成分可以指导该较大多肽通过合成该多肽的细胞的分泌途径。在通过分泌途径的转运过程中，分泌肽通常从此较大多肽上切除。
多核苷酸在本发明优选的实施方案中，本发明的分离多核苷酸可以与SEQ IDNO1中类似大小的区域或其互补序列杂交，所述杂交在至少中等严紧的条件下进行。
具体地说，本发明的多核苷酸可在至少中等严紧条件下，优选高严紧条件(见下述)下与下述探针杂交，所述探针为包含编码具SEQ IDNO1第1-2322位所示序列的酶的催化结构域的全长序列的变性双链DNA探针或为包含SEQ ID NO1中长至少大约100个碱基对的亚序列的任何探针。用于在中等或高严紧条件下确定核苷酸探针和同源DNA或RNA序列之间杂交的合适实验条件包括将含有需杂交的DNA片段或RNA的滤膜预浸泡于5×SSC(氯化钠/柠檬酸钠，Sambrook等，1989，分子克隆实验室手册(Molecular CloningA Labortory Manual)，ColdSpring Harbor Lab.，Cold Spring Harbor，NY)中10分钟，并于具有5×SSC、5×Denhardt溶液(Sambrook等，1989)、0.5％SDS和100μg/ml变性的超声处理的鲑鱼精子DNA(Sambrook等，1989)的溶液中预杂交该滤膜，然后在含10ng/ml随机引发的(Feinberg，A.P.和Vogelstein，B.(1983)分析生物化学(Anal.Biochem.)1326-13)、32P-dCTP标记的(比活性高于1×109cpm/μg)探针的同样溶液中约45℃杂交12小时。滤膜随后在2×SSC、0.5％SDS中洗两次，30分钟，洗涤温度至少60℃(中等严紧条件)，更优选至少65℃(中等/高严紧条件)，甚至更优选至少70℃(高严紧条件)，甚至更优选至少75℃(极高严紧条件)。
用X-射线胶片检测在这些条件下与寡核苷酸探针杂交上的分子。
如前面所提到的，本发明的分离多核苷酸包括DNA和RNA。分离DNA和RNA的方法在本领域是众所周知的。可用本领域已知的方法从Gene Bank或DNA文库中克隆编码目的基因的DNA和RNA。
随后用例如杂交或PCR方法鉴定和分离编码具有本发明内切葡聚糖酶活性的多肽的多核苷酸。
本发明进一步提供了来自不同细菌菌株的多肽和多核苷酸对应物(直向同系物(ortholog)或共生同系物(paralog))。特别有意义的是来自革兰氏阳性嗜碱菌株，包括芽孢杆菌属种的内切葡聚糖酶多肽。
将本发明提供的信息和组合物与常规克隆技术相结合可克隆具有本发明内切葡聚糖酶活性的多肽的物种同系物。例如，本发明的DNA序列可用来自表达该蛋白质的细胞类型的染色体DNA进行克隆。可用按此处公开的序列设计的探针通过探测Northern印迹鉴定DNA的合适来源。随后从阳性细胞系的染色体DNA制备文库。编码具有内切葡聚糖酶活性的多肽的本发明DNA序列可随后用各种方法分离，诸如用按本说明书和权利要求书中公开的序列设计的探针进行探测，或用基于公开序列的一或多套简并探针进行探测。本发明的DNA序列也可采用聚合酶链式反应或PCR(Mullis，美国专利号4,683,202)，用基于本文公开序列设计的引物进行克隆。在另外的方法中，可用DNA文库转化或转染宿主细胞，并用针对内切葡聚糖酶的抗体(单克隆或多克隆抗体)检测目的DNA的表达，所述酶按材料和方法及实施例1和2中所述方法克隆自芽孢杆菌属种DSM12648、并表达和纯化；或者可利用与具有内切葡聚糖酶活性的多肽有关的活性试验检测目的DNA的表达。
SEQ ID NO1所示DNA序列中编码内切-葡聚糖酶的部分和/或本发明的类似DNA序列可从产生具有内切-葡聚糖酶活性的酶的细菌芽孢杆菌属种的菌株中克隆，优选地从DSM12648菌株中克隆，或从如此处描述的其它或相关生物体中克隆。
应用本发明的序列获得其他相关序列的方式是可将此处公开的编码本发明内切-β-1，4-葡聚糖酶的多核苷酸序列的有关序列信息作为工具用以鉴定其他同源内切葡聚糖酶。例如，可应用聚合酶链式反应(PCR)来扩增编码各种微生物，特别是不同的芽孢杆菌属种来源的其他同源内切-葡聚糖酶的序列。
多肽SEQ ID NO2第1到773位氨基酸的序列为成熟内切-葡聚糖酶序列，其计算分子量为86kDa。SEQ ID NO2的1到约340位被认为是本发明内切-葡聚糖酶的催化活性结构域。此外，从约340位到约540位被认为是本发明内切-葡聚糖酶的纤维素结合结构域。该序列其余部分(即从约540位到773位)的功能目前仍然未知。
本发明提供包含(i)SEQ ID NO2的1到773位氨基酸序列或其具有内切-葡聚糖酶活性的片段的内切-葡聚糖酶。SEQ ID NO2的1位到773位序列的片段为从该氨基酸序列的氨基和/或羧基端缺失了一个或多个氨基酸的多肽。本发明的一个实施方案提供包含(ii)SEQ ID NO2的1位到约340位氨基酸序列的内切-葡聚糖酶，这是由于预期该单结构域内切-葡聚糖酶也可用于此处描述的工业应用中。本发明的另一实施方案中提供包含(iii)SEQ ID NO2的1位到约540和773间位置的氨基酸序列的内切葡聚糖酶，这是由于预期包含此催化活性结构域和纤维素结合结构域的该内切-葡聚糖酶也可用于此处描述的工业应用中。在一优选实施方案中，该片段为由1位到663±50位氨基酸组成的多肽，优选地为由1到663±25位氨基酸组成的多肽。
本发明也提供了与以上(i)、(ii)或(iii)的多肽和它们的物种同系物(直向同系物或共生同系物)基本同源的内切-葡聚糖酶多肽。此处应用的术语“基本同源”是指这样的多肽，该多肽与SEQ ID NO2第1-773位氨基酸所示序列、或其具有内切-葡聚糖酶活性的片段、或其直向同系物或共生同系物有至少97％，优选地98％，更优选地98.5％，且最优选地99％或更高程序的同一性。序列同一性百分数通过常规方法，利用本领域内公知的计算机程序如GCG程序包中提供的GAP(Program Manual for theWisconsin Package，第8版，1994年8月，Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)，按Needleman，S.B和Wunsch，C.D.((1970)，分子生物学杂志(Journal of Molecular Biology)，48，443-453，在此将所述文献全部引用作为参考)公开的方式确定。GAP用于多肽序列比较时应用以下的设置值GAP创建罚分为3.0且GAP延伸罚分为0.1。
多核苷酸分子的序列同一性的测定通过应用GAP以类似的方法进行，用于DNA序列比较时GAP具有如下设置值GAP创建罚分为5.0且GAP延伸罚分为0.3。
对于基本同源的蛋白质和多肽，其特征在于具有一或多个氨基酸替换、缺失或添加。这些改变优选为性质较小的那种，即保守氨基酸替换(见表2)和其它不会显著影响蛋白质或多肽的折叠或活性的替换；小的缺失，通常是1至约30个氨基酸的小缺失；及小的氨基或羧基末端延伸，诸如氨基末端甲硫氨酸残基、长度不超过约20-25个残基的小连接肽或利于纯化的小延伸(亲和标记物)，如多聚组氨酸序列、蛋白A(Nilsson等，EMBO J，41075，1985；Nilsson等，酶学方法，1983，1991)。通常参阅，Ford等，蛋白质表达和纯化(Protein Expression andPurification)295-107，1991，该文献在此引用作为参考。编码亲和标记物的DNA可从产品供应商(如，Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ；New England Biolabs，Beverly，MA)处购买到。
然而，即便上述的变化优选是性质较小的改变，这些改变也可以是性质较大的改变，如将长达300个氨基酸或更长的较大多肽作为氨基或羧基末端延伸融合到本发明的具有内切葡聚糖酶活性的多肽上。
表1保守氨基酸替换碱性 精氨酸赖氨酸组氨酸酸性 谷氨酸天冬氨酸极性 谷氨酰胺天冬酰胺疏水性亮氨酸异亮氨酸缬氨酸芳香族苯丙氨酸色氨酸酪氨酸小的 甘氨酸丙氨酸丝氨酸苏氨酸甲硫氨酸除了20种标准氨基酸之外，也可用非标准氨基酸(如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)替换本发明多肽的氨基酸残基。也可用有限数量的非保守氨基酸、非遗传密码编码的氨基酸及非天然氨基酸替换氨基酸残基。在蛋白质合成后“非天然氨基酸”已经被修饰，和/或其在它们的侧链上有不同于标准氨基酸侧链的化学结构。非天然氨基酸可以化学合成，或优选地购买得到，包括六氢吡啶羧酸、四氢噻唑羧酸、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸和3，3-二甲基脯氨酸。
本发明的内切葡聚糖酶多肽中的必需氨基酸可按本领域已知方法进行鉴别，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，科学(Science)2441081-1085，1989)。在后一技术中，在分子的每个残基位置处导入单个丙氨酸突变，检测所产生的突变分子的生物学活性(即内切葡聚糖酶活性)以鉴别对分子活性起关键作用的氨基酸残基。也可参阅，Hilton等，生物化学杂志(J.Biol.Chem)2714699-4708，1996。酶或其它生物学相互作用的活性位点也可通过对用诸如核磁共振、结晶学、电子衍射或光亲和标记等技术测定的结构进行物理分析以及对推定的接触位点氨基酸进行突变而确定，参阅，例如，de Vos等，科学255306-312，1992；Smith等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224899-904，1992；Wlodaver等，FEBSLett.30959-64，1992。必需氨基酸的身份也可通过分析与本发明多肽相关的多肽的同源性来推断。
可用已知的突变、重组和/或改组方法及随后的相关筛选方法进行多个氨基酸替换和检测，这些方法例如有Reidhaar-Olson和Saner(科学24153-57，1988)、Bowie和Sauer(美国国家科学院院报862152-2156，1989)、WO95/17413或WO95/22625所公开的技术。简单地说，这些作者公开了使多肽中两个或多个位置同时发生随机化或进行不同突变的重组/改组(WO95/17413，WO95/22625)、随后选择功能多肽、然后将诱变多肽测序以确定每个位置可允许的替换谱的方法。其它可用的方法包括噬菌体展示(如Lowman等，生物化学3010832-10837，1991；Ladner等，美国专利号5,223,409；Huse，WIPO出版物WO 92/06204)和区域定向诱变(Derbyshire等，基因46145，1986；Ner等，DNA 7127，1988)。
上面公开的诱变/改组方法可与高通量、自动化筛选方法结合，以测定宿主细胞中克隆的诱变多肽的活性。编码活性多肽的诱变DNA分子可从宿主细胞中回收，并用现代化设备快速测序。这些方法可快速确定目的多肽中各个氨基酸残基的重要性，并可用于未知结构的多肽。
应用以上讨论的方法，本领域内的普通技术人员可鉴定和/或制备出与以上(I)、(II)或(III)的多肽基本同源并保留野生型蛋白质的内切-葡聚糖酶活性的多种多肽。
本发明的内切-葡聚糖酶除了具有包含催化活性结构域的酶核心，即SEQ ID NO2的1到约340位外，还可以包含纤维素结合结构域(CBD)，纤维素结合结构域与催化活性结构域可操作地进行连接。纤维素结合结构域(CBD)可以是以上及所附SEQ ID NO2中描述的编码酶的一个组成部分；或可以是来自其他来源的CBD，该CBD导入内切-葡聚糖酶中而生成酶杂合体。在本文中，术语“纤维素结合结构域”应按Peter Tomme等(《不溶性碳水化合物的酶促降解》(Enzymatic Degradation of InsolubleCarbohydrates)一书中，“纤维素结合结构域分类和特性”，John N.Saddler和Michael H.Penner(编)，ACS Symposium Series，No.618，1996)的定义理解。这一定义将120多种纤维素结合结构域归为10个家族(I-X)，并证实在诸如纤维素酶(内切葡聚糖酶)、木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰酯酶和几丁质酶等多种酶中都存在CBD。在藻类如红藻Porphyra purpurea中也已找到以非水解性多糖结合蛋白质形式存在的CBD，参阅Tomme等，出处同前。然而，大部分的CBD来自纤维素酶和木聚糖酶，CBD可存在于蛋白质的N和C末端或在其内部。酶杂合体是本领域已知的，参阅WO90/00609和WO95/16782，通过将如下DNA构建体转化至宿主细胞中，其中所述DNA构建体含有纤维素结合结构域的编码DNA的至少一个片段及与之相连(通过或不通过接头)的内切葡聚糖酶的编码DNA序列，并培养此宿主细胞以表达融合基因，可制备酶杂合体。酶杂合体可用下式描述CBD-MR-X其中CBD是相应于至少纤维素结合结构域的氨基酸序列的N-末端或C-末端区域；MR是中间区域(接头)，可以是键或短的连接基团，优选约2-100个碳原子长，更优选2-40个碳原子长；或者MR优选具有约2-100个氨基酸，更优选2-40个氨基酸；而X是相应于至少本发明DNA序列编码的催化活性结构域的多肽的N-末端或C-末端区域。
类似地，与SEQ ID NO2的约340到约540位对应的纤维素结合结构域亦可用于与非芽孢杆菌属种AA349来源的内切-葡聚糖酶以及与其他蛋白质形成杂合体。可置换SEQ ID NO2第1到约340位的内切-葡聚糖酶的其他来源的内切葡聚糖酶的实例包括来自如下来源的内切-葡聚糖酶(a)Bacillus lautus，例如在WO9110732中公开的Bacillus lautus NCIMB40250，(b)在WO9117243中公开的Humicola insolens DSM1800，(c)在WO9117243中公开的尖镰孢(Fusarium Oxysporium)DSM2672，以及(d)在EP0651785中公开的芽孢杆菌属种AC13 NCIMB 40482。
免疫交叉反应性用于测定免疫交叉反应性的多克隆抗体，特别是单特异性多克隆抗体可以利用纯化的纤维素水解酶制备。更具体地说，可以参照N.Axelsen等，定量免疫电泳指南(A manual of Quantitative Immunoelec trophoresis)，Blackwell科学出版社，1973，第23章；或A.Johnstone和R.Thorpe，实用免疫化学(Immunochemistry in Practice)，Blackwell科学出版社，1982(具体是27-31页)所述的方法，通过免疫兔子(或其它啮齿类动物)，得到针对本发明内切葡聚糖酶的抗血清。纯化的免疫球蛋白可以从抗血清获得，例如通过盐沉((NH4)2SO4)，然后透析并在如DEAE-Sephadex上进行离子交换层析而得到。蛋白质的免疫化学鉴定可以利用Ouchterlony双向扩散分析(O.Ouchterlony，实验免疫学手册(Handbook of ExperimentalImmunology)(D.M.Weir编)，Blackwell科学出版社，1967，655-706页)、火箭免疫电泳或交叉免疫电泳(N.Axelsen等，《定量免疫电泳指南》，Blackwell科学出版社，1973，第2、3和4章)进行。
微生物来源对于本发明，此处应用的与特定的来源相关的术语“获得自”或“可获得自”，意指该酶由或可以由此特定来源或已插入了来自该来源的基因的细胞产生。
目前预期本发明的内切-葡聚糖酶可从属于芽孢杆菌属菌株的革兰氏阳性细菌中获得，所述细菌特别是芽孢杆菌属种AA349的菌株。
在一优选实施方案中，本发明的内切-葡聚糖酶获得自芽孢杆菌属种AA349菌株DSM 12648。目前预期编码与本发明的酶同源的酶的DNA序列可获得自属于芽孢杆菌属的其它菌株。
本发明内切-葡聚糖酶所克隆自的芽孢杆菌属种AA349菌株已进行了保藏，保藏号为DSM 12648。
DNA构建体本发明的一个方面涉及用于将本发明的多核苷酸整合到宿主细胞基因组中的DNA构建体。此构建体必需包含两翼存在两段多核苷酸序列，即第一和第二DNA序列的本发明多核苷酸，其中所述侧翼序列各必须包含至少一段与宿主细胞基因组中的区域充分同源的亚序列以便实现有效重组。
重组表达载体包含编码本发明酶的DNA构建体的重组载体可以是能够方便地进行重组DNA操作的任何载体。载体的选择常取决于它将被导入的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体而存在、复制独立于染色体的复制的载体，如质粒。或者，载体可以是这样一种类型，当它被导入宿主细胞中时，将会部分或全部整合到宿主细胞基因组中并与其所整合的染色体一起复制。
所述载体优选为这样的表达载体，其中编码本发明酶的DNA序列可操作地与该DNA转录所需的其它片段相连接。一般来说，表达载体来自质粒或病毒DNA，或可以含有两者的元件。术语“可操作地连接”指将诸片段以使其能按它们的预期目的协同发挥功能的方式排列，如转录在启动子中引发并持续通过编码该酶的DNA序列。
启动子可以是任何在所选择的宿主细胞内表现出转录活性的DNA序列，并可以来自编码宿主细胞的同源或异源蛋白质的基因。
适用于细菌宿主细胞的启动子的例子包括以下基因的启动子嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)生麦芽糖淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)α-淀粉酶基因、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)碱性蛋白酶基因或短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)木糖苷酶基因或λ噬菌体的PR或PL启动子或大肠杆菌的lac、trp或tac启动子。
如果需要，编码本发明酶的DNA序列还可以可操作地连接到适当的终止子上。
本发明的重组载体还可包含能够使载体在所讨论的宿主细胞中复制的DNA序列。
所述载体还可包含可选择标记，例如其产物可弥补宿主细胞缺陷的基因，或编码如对抗生素像卡那霉素、氯霉素、红霉素、四环素、壮观霉素等的抗性或对重金属或除草剂的抗性的基因。
为了指导本发明的酶进入宿主细胞的分泌途径，可以在重组载体中提供分泌信号序列(也称为前导序列、前原序列或前序列)。可以将分泌信号序列在正确阅读框中连接到编码该酶的DNA序列上。分泌信号序列一般位于编码此酶的DNA序列的5’端。所述分泌信号序列可以是通常与该酶相关的序列或可以来自编码另一种分泌蛋白质的基因。
用于分别连接编码本发明酶的DNA序列、启动子和任选地终止子和/或分泌信号序列，或通过适宜的PCR扩增方案组装这些序列和将它们插入含有复制或整合所需信息的适宜载体中的方法对本领域技术人员来说是众所周知的(参见例如，Sambrook等人，(1989)，分子克隆实验室手册，Cold Spring Harbor Lab.，Cold Spring Harbor，NY)。
宿主细胞导入到宿主细胞中的克隆DNA分子可以与所讨论的宿主同源或异源。如果与所述宿主细胞同源，即由该宿主细胞天然产生，则该DNA序列一般可操作地与非其天然环境中存在的另一启动子序列相连接，或者适当时与另一分泌信号序列和/或终止序列相连接。术语“同源的”旨在包括编码天然存在于所讨论的宿主生物体中的酶的DNA序列。术语“异源的”旨在包括所述宿主细胞天然不表达的DNA序列。因此所述DNA序列可以来源于另一生物体或者可以是合成的序列。
能导入本发明的克隆DNA分子或重组载体的宿主细胞可以是任何能够产生所期望酶的细胞，包括细菌、酵母、真菌和高等真核细胞。
通过培养能够产生本发明的酶的细菌宿主细胞的实例是革兰氏阳性细菌，如芽孢杆菌菌株，尤其是嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(B.brevis)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、巨大芽孢杆菌(B.megatherium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)，乳杆菌属(lactobacillus)菌株，链球菌属(Streptococcus)菌株，链霉菌(Streptomyces)菌株，尤其是变铅青链霉菌(S.lividans)和鼠灰链霉菌(S.murinus)；或者该宿主细胞可以是革兰氏阴性细菌如大肠杆菌(Echerichia coli)菌株。
细菌的转化可以通过本身已知的方式用原生质体转化、电穿孔、接合或使用感受态细胞进行(参见Sambrook等人，(1989)，分子克隆实验室手册，Cold Spring Harbor Lab.，Cold Spring Harbor，NY)。
当在细菌如大肠杆菌中表达酶时，该酶可以典型地以不溶性颗粒(称作包函体)形式驻留于细胞质中，或可以由细菌分泌序列引导到周质间隙。在前一种情况下，将细胞裂解，回收所述颗粒，变性，其后通过稀释变性剂使酶重新折叠。后一种情况下，该酶可以通过以下操作从周质间隙中回收利用如超声或渗透压休克破坏细胞，使所述的周质间隙的内容物释放，再回收该酶。
当在革兰氏阳性细菌如芽孢杆菌属或链霉菌属菌株中表达该酶时，该酶可以驻留于细胞质中，或由细菌分泌序列引导到胞外培养基中。
通过培养能够产生本发明的酶的真菌宿主细胞的实例是如曲霉属(Aspergillus)或镰孢霉属(Fusarium)菌株，尤其是泡盛曲霉(A.awamori)、构巢曲霉(A.nidulans)、黑曲霉(A.niger)、米曲霉(A.oryzae)和尖镰孢(F.oxysporum)，和木霉菌属(Trichoderm)菌株，优选哈茨木霉(T.harzianum)、里氏木霉(T.reesei)和绿色木霉(T.viride)。
真菌细胞可通过以下过程转化，所述过程涉及以实质上已知的方式进行原生质体形成和原生质体转化以及随后的细胞壁再生。曲霉属菌株作为宿主细胞的用途可见于EP238,023(Novozymes A/S)，其内容在此一并引用作为参考。
通过培养能够产生本发明的酶的酵母来源宿主细胞的实例是如汉逊酵母属菌株(Hansenula sp.)；克鲁维酵母属菌株(Kluyveromyces sp.)，尤其是乳酸克鲁维酵母(K.lactis)和马克斯克鲁维酵母(K.marcianus)；毕赤酵母属菌株(Pichia sp)；酵母属菌株(Saccharomyces)，尤其是卡尔酵母(S.carlsbergensis)、酿酒酵母(S.cerevisae)、克鲁弗酵母(S.kluyveri)和葡萄汁酵母(S.uvarum)；裂殖酵母属菌株(Schizosaccharomyces sp.)，尤其是栗酒裂殖酵母(S.pombe)；和耶氏酵母属菌株(Yarrowia sp.)，尤其是解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)。
通过培养能够产生本发明的酶的植物来源宿主细胞的实例是如来自马铃薯(Solanum tuberosum)或烟草(Nicotiana tabacum)的植物细胞。
生产内切葡聚糖酶的方法本发明提供生产本发明的分离酶的方法，其中在允许该酶产生的条件下，培养已转化了编码该酶的DNA序列的合适宿主细胞，并从培养物中回收得到的酶。
如本文中的定义，分离的多肽(如酶)是基本不含有其它多肽的多肽，如按SDS-PAGE测定，至少约20％纯，优选至少约40％纯，更优选约60％纯，甚至更优选约80％纯，最优选约90％纯，再最优选高于95％的纯度。
术语“分离的多肽”也可称为“纯化的多肽”。
当将含有编码该酶的DNA序列的表达载体转化到异源宿主细胞中时，就有可能异源重组生产本发明的酶。
由此，有可能制备出高纯化的或单组分的内切-β-1，4-葡聚糖酶组合物，其特征在于不含同源杂质。
本文中，同源杂质是指来源于最初获得本发明的酶的同源细胞的任何杂质(例如除本发明的酶之外的其它多肽)。
本发明中，同源宿主细胞可以是芽孢杆菌属种AA349菌株。
用于培养转化的宿主细胞的培养基可以是任何适合于所讨论的宿主细胞生长的常规培养基。所表达的纤维素水解酶可方便地分泌到培养基中，然后可以通过众所周知的方法回收，所述方法包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞，再利用盐如硫酸铵沉淀培养基中的蛋白质成分，接下来进行层析，如离子交换层析、亲和层析等。
酶组合物在再一方面，本发明涉及包含如上所述的具有内切葡聚糖酶活性的酶的酶组合物。
本发明的酶组合物除了包含本发明的内切葡聚糖酶之外，还可以包含一或多种其它类型的酶，例如半纤维素酶如木聚糖酶和甘露聚糖酶、其它纤维素酶或内切-β-1，4-葡聚糖酶成分、几丁质酶、脂肪酶、酯酶、果胶酶、角质酶、肌醇六磷酸酶、氧化还原酶(过氧化物酶、卤素过氧化物酶(haloperoxidase)、氧化酶、漆酶)、蛋白酶、淀粉酶、还原酶、酚氧化酶、木质素酶、支链淀粉酶、果胶酸裂解酶、木葡聚糖酶、果胶乙酰酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸聚糖酶、果胶裂解酶、果胶甲酯酶、纤维二糖水解酶、转谷氨酰胺酶；或它们的混合物。
酶组合物可以依照本领域已知的方法制备，可以是液态或干燥组合物。例如，该酶组合物可以是粒状或微粒状。包含在组合物中的酶可以用本领域已知的方法来稳定化。
内切葡聚糖酶在许多的工业和应用领域具有潜在的用途。如下给出的例子是本发明的酶组合物的优选用途。基于本领域的已知技术，本发明的酶组合物的用量和使用该组合物的其它条件可以被确定。
应用生物质降解根据本发明的酶或酶组合物可有利地用于例如以下的多种用途-用于去皮，即，在用机械鼓去皮前用可部分降解富含果胶的形成层的水解酶前处理，以利于能量节约。
-用于脱纤维(精练或开棉)，即在精练或开棉前用水解酶处理含纤维素纤维的材料，这样会由于此酶在纤维表面的水解效应而导致能量消耗减少。
-用于修饰纤维，即在需要跨纤维壁部分水解(这要求更深层渗入的酶)的情况下改进纤维的特性(例如以便使粗糙纤维更具柔性)。
-用于滤水造纸纸浆的滤水能力可通过用水解酶处理纸浆而得到提高。应用本发明酶或酶组合物可能更为有效，例如可导致更高程度地松散细小部分中的强水合微纤维束——正是此微纤维束可通过在纤维间以及在造纸机器的丝网中阻塞空洞而限制滤水速度。
木质纤维纸浆的处理可根据例如在WO 93/08275、WO 91/02839和WO 92/03608中所描述的进行。
洗衣本发明的酶或酶组合物可用于进行纺织品和衣物的家庭或工业洗涤的去污剂组合物中，以及用于机洗织物的过程中，所述过程包括在机洗过程的一个或多个洗涤循环中用含有本发明的酶或酶组合物的洗涤溶液处理织物。
通常，用于洗涤过程的去污剂组合物包含常规成分，例如表面活性剂(阴离子、非离子、两性离子、两性的)、助洗剂、漂白剂(过硼酸盐、过碳酸盐或过氧化氢)以及其他成分，例如在WO 97/01629中所描述的，该文献在此全部引用作为参考。
本发明的内切-β-1，4-葡聚糖酶具有多种优点，如改进的污物清除以及减少的污垢再沉积。某些污物，例如某些食品污物含有β-葡聚糖，这使得完全去除污物非常困难。此外，织物的纤维素纤维也可能具有(特别是在“非结晶”和表面区域)能被该酶降解的β-葡聚糖多聚体。对此β-葡聚糖的水解，无论是在污物中还是在织物上，均可以在洗涤过程中减少污垢与织物的结合。
家庭洗衣过程可在一系列条件下进行。通常，洗涤时间从5分钟到60分钟且洗涤温度为15-60℃之间，最通常地在20-40℃之间。洗涤溶液通常为中性或碱性，最常用的pH为7-10.5。通常应用漂白剂，特别是对于白色织物的洗涤。这些漂白剂一般为过氧化物漂白剂，例如过硼酸钠、过碳酸钠或过氧化氢。
纺织应用在另一实施方案中，本发明涉及本发明的内切-葡聚糖酶在织物整理工序中的应用，所述整理如生物抛光。生物抛光为纱线表面的特殊处理，该处理改进织物的手感和外观而不损失织物的可湿性。生物抛光的最重要效果可描述为减少起毛和起球、增加光泽/光亮、改进织物手感、增加耐久柔软度以及改变吸水性。生物抛光通常在针织和机织织物生产过程的湿处理中进行。湿处理包括步骤，如退浆、煮炼、漂白、洗涤、染色/印花和整理。在这些步骤的每一步中，织物或多或少要受到机械作用。通常，在纺织原料进行针织或机织过后，织物进入任选的退浆阶段，之后进入煮炼阶段，等。退浆为将浆料从织物上移除的作用。在机械织机上织造之前，经纱常用淀粉或淀粉衍生物组成的浆料包被，以增加其抗张强度。织造后，在织物进一步处理前必须除去浆料包衣以确保得到均一性和耐洗性。在煮炼过程中杂质从织物中去除。本发明的内切-葡聚糖酶可有利地用于纤维素和棉纺织品以及韧皮纤维的煮炼，并可提高杂质去除的效率。
对纤维素纺织品进行耐久压烫的最常采用的方法之一是应用纤维素交联化学进行整理。交联使纤维素在分子水平上固定并实质上降低纤维素衣物的收缩和起皱。用本发明的内切-葡聚糖酶对经耐久压烫处理的纤维素织物进行处理可导致受压区域的选择性松弛以最大限度降低边缘磨损。此外，本发明的内切-葡聚糖酶可用于有效地将多余的印花过程中应用的基于羧甲基纤维素的印花浆从织物和设备上除去。
已知为达到生物抛光的效果，需联合纤维素水解作用和机械作用。此外，还已知当将纤维素酶处理和常规柔软剂处理联合应用时可取得“超柔软”的效果。预期将本发明的内切-葡聚糖酶和该酶与其他酶的联合用于纤维素制品(天然及加工的纤维素制品、织物、衣服、纱线和纤维)的生物抛光是有利的，例如可取得更彻底的抛光效果。据认为，通过应用例如在WO 93/20278中描述的方法可实现生物抛光。可进一步考虑将本发明的内切葡聚糖酶应用到同时或顺序的织物湿处理(包括退浆、煮炼、漂白、生物抛光、染色和整理的不同组合)中。
石洗已知在染色的织物(特别是粗斜纹棉布或劳动布)上的“石洗”外观(颜色的区域性磨损)，可通过在浮石存在的条件下洗涤由此织物制成的粗斜纹棉布或劳动布以获得所需的织物颜色的区域性减轻来实现，或可通过用酶处理织物，特别是用纤维素水解酶处理织物来实现。用本发明的内切-葡聚糖酶处理，不论单独地或是联合其他酶，均可单独实施(如在US 4,832,864中所公开的)，或与较传统方法中所需量少的浮石联合实施，或与在WO95/09225中所公开的珍珠岩联合实施。用本发明的内切-葡聚糖酶处理粗斜纹棉布织物与传统方法相比可减少返沾色(back-staining)。
材料和方法菌株和供体生物上述芽孢杆菌属种DSM 12648包含SEQ ID NO1所示编码内切-β-1，4-葡聚糖酶的DNA序列。
枯草芽孢杆菌PL2306该菌株是具有被破坏的apr和npr基因的枯草芽孢杆菌DN 1885(Diderichsen，B.，Wedsted，U.，Hedegaard，L.，Jensen，B.R.，Sjφholm，C.(1990)，编码来自于短芽孢杆菌的胞外酶α-乙酰乳酸脱羧酶的aldB的克隆，细菌杂志(J.Bacteriol.)，172，4315-4321)，这种破坏发生于已知枯草芽孢杆菌纤维素酶基因的转录单元内，导致产生纤维素酶阴性细胞。基本上如Eds.A.L.Sonenshein，J.A.Hoch和Richard Losick((1993)枯草芽孢杆菌和其它革兰氏阳性细菌(Bacillus substillis and otherGram-Positive Bacteria)，美国微生物学会，p.618)所述进行这种基因破坏。
按Yasbin，R.E.，Wilson，G.A.和Young，F.E.((1975)枯草芽孢杆菌溶原性菌株的转化和转染选择性诱导感受态细胞中的原噬菌体的证据，细菌学杂志，(J.Bacteriol.)121296-304)所述的方法制备和转化感受态细胞。
常规分子生物学方法除非另作说明，所有的DNA操作和转化都采用标准的分子生物学方法(Sambrook等.(1989)分子克隆实验指南，(Molecular cloningAlaboratory manual)冷泉港实验室，冷泉港，NY；Ausubel，F.M.等.(编)“最新分子生物学手册”(Current Botocots in Molecular Biology).John Wileyand Sons，1995；Harwood，C.R.，和Cutting，S.M.(编)“芽孢杆菌分子生物学方法”(Molecular Biological Methods for Bacillus).John Wiley和Sons，1990)。
用于DNA操作的酶按制造商说明书使用(如可从New EnglandBiolabs，Inc获得限制性内切酶、连接酶等)。
质粒pMOL944该质粒是pUB110的衍生物，基本上包含使该质粒能在枯草芽孢杆菌内增殖的元件和卡那霉素抗性基因，并具有克隆自地衣芽孢杆菌ATCC14580的amyL基因的强启动子和信号肽。该信号肽包含一个SacII位点，这使得可以方便地对编码蛋白质成熟部分的DNA进行克隆使其与信号肽融合。这就导致前蛋白的表达，该蛋白质将被引导到细胞外部。
该质粒用普通的基因工程方法构建而成，简述如下。
pMOL944的构建用单限制性内切酶NciI消化pUB110质粒(McKenzie，T等，1986，质粒(Plasmid)1593-103)。将扩增自质粒pDN1981(P.L.Jorgensen等.，1990，基因，96，p37-41.)上之amyL启动子的PCR片段用NciI消化，并插入NciI消化的pUB110中，产生质粒pSJ2624。
所用的两个PCR引物具有如下序列#LWN5494(SEQ ID NO3)5′-GTCGCCGGGGCGGCCGCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC-3′#LWN5495(SEQ ID NO4)5′-GTCGCCCGGGAGCTCTGATCAGGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAATGAGGCAGCAAGAAGAT-3′引物#LWN5494向质粒中插入一个NotI位点。
质粒pSJ2624随后用SacI和NotI消化，且用SacI和NotI消化扩增自pDN1981上的amyL启动子的新PCR片段，将该DNA片段插入SacI-NotI消化的pSJ2624，从而产生质粒pSJ2670。
该克隆将第一次克隆的amyL启动子替换为方向相反的同一启动子。用于PCR扩增的两个引物具有如下序列#LWN5938(SEQ ID NO5)5′-GTCGGCGGCCGCTGATCACGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAATGAGGCAGCAAGAAGAT-3′#LWN5939(SEQ ID NO6)5′-GTCGGAGCTCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC-3′质粒pSJ2670用限制性内切酶PstI和BclI消化，将扩增自编码碱性淀粉酶SP772(专利#WO9526397-A1)的克隆DNA序列的PCR片段用PstI和BclI消化后插入上述质粒，从而产生质粒pMOL944。用于PCR扩增的两个引物具有如下序列#LWN7864(SEQ ID NO7)5′-AACAGCTGATCACGACTGATCTTTTAGCTTGGCAC-3′#LWN7901(SEQ ID NO8)5′-AACTGCAGCCGCGGCACATCATAATGGGACAAATGGG-3′
引物#LWN7901向质粒中插入一个SacII位点。
基因组DNA制备菌株DSM12648在含1％羧甲基纤维素+(0.1M Na2CO3+0.1MNaHCO3，分别高压灭菌并在冷却到室温后在无菌条件下加入)的2xTY液体培养基中增殖。30℃以300rpm孵育16小时后，收获细胞，按Pitcher等[Pitcher，D.G.，Saunders，N.A.，Owen，R.J；用硫氰酸胍快速抽提细菌基因组DNA；应用微生物学通讯(Lett Appl Microbiol)1989，8151-156]的方法分离基因组DNA。
培养基TY(如Ausubel，F.M.等.(编.)″最新分子生物学手册″(CurrentProtocols in Molecular Biology).John Wiley和Sons，1995中所述)。
2xTY(如Ausubel，F.M.等.(编.)″最新分子生物学手册″.JohnWiley和Sons，1995中所述)。
LB琼脂(如Ausubel，F.M.等.(编.)″最新分子生物学手册″.JohnWiley和Sons，1995中所述)。
LBPG是补充有0.5％葡萄糖和0.05M磷酸钾，pH7.0的LB琼脂。
AZCL-HE-纤维素被加入LBPG-琼脂中至0.5％AZCL-HE-纤维素，其来自Megazyme(澳大利亚)。
BPX培养基描述于EP 0 506 780(WO 91/09129)中。
Cal18-2培养基在专利申请WO 00/75344A1中描述。内切-β-1，4-葡聚糖酶活性的测定ECU方法ECU方法中测定酶样本减小羧甲基纤维素(CMC)溶液粘度的能力，且结果以ECU给出。粘度的减小与内切-纤维素酶活性成正比。条件7LFD型CMC来自Hercules，于0.1M磷酸盐缓冲液中，pH7.5；CMC浓度为每升反应物31.1g；在40℃反应30分钟。用振动粘度计测定粘度，所述粘度计如MIVI 3000，Sofraser，法国。
Cellazyme C方法Cellazyme C为内切-葡聚糖酶试验底物，以片剂形式由MegazymeInternational Ireland Ltd提供。参见Megazyme小册子CZC 7/99，其中描述有“此底物通过染色和交联HE-纤维素以产生可在水中水合但不溶于水的材料来制备。由内切-β-1，4-葡聚糖酶水解可产生水溶性染色片段，并且其释放速率(在590nm处的吸光度增加)可与酶活性直接相关。”。
酶样本加入到试管中的6ml适宜的缓冲液中，加入一片Cellazyme C并通过振荡试管分散药片，然后试管置40℃水浴中。在约15、30、45和60分钟后短暂振荡以混匀内容物。60分钟后，溶液用9cm直径的WhatmanGF/C滤纸过滤。测定滤过液在590nm处的吸光度。
以下的实施例对本发明进行举例说明。
实施例1克隆和表达芽孢杆菌属种的内切-β-1，4-葡聚糖酶基因在枯草芽孢杆菌中亚克隆和表达成熟内切葡聚糖酶用以下两个寡核苷酸组成的PCR引物组对本发明的编码内切葡聚糖酶的DNA序列做PCR扩增#168684(SEQ ID NO9)5′-CAT TCT GCA GCC GCG GCA GC A GAA GGA AAC ACT CGT GAA GAC-3′#168685(SEQ ID NO10)5′-GCG TTG AGA C GCGCG GCC GCT TAC TCT TCT TTC TCT TCT TTC TC-3′限制性位点SacII和NotI加有下划线。
上述寡核苷酸用于PCR反应，该反应于补充有dNTP各200μM、2.6单位的H iFidelityTMExpand酶混合物及引物各200pmol的H iFidelityTMPCR缓冲液(Boehringer Mannheim，德国)中进行。将上述分离自芽孢杆菌种DSM 12648的染色体DNA作为模板。
用DNA热循环仪(Landgraf，德国)进行PCR反应。94℃温育1分钟进行1个循环；然后进行10个循环，每个循环为94℃变性15秒，60℃退火60秒，72℃延伸120秒；然后进行20个循环，每个循环为94℃变性15秒，60℃退火60秒及72℃延伸120秒(在此延伸步骤，每个循环增加20秒)。在0.7％琼脂糖凝胶(Nusieve，FMC)上电泳分析5μl扩增产物试样。大小为2.4kb的DNA片段的出现表明基因片段得到正确扩增。
亚克隆PCR片段用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，USA)按制造商说明书纯化上述产生的PCR产物的45μl等分试样。纯化的DNA洗脱于50μl、pH8.5的10mM Tris-HCl中。用SacII和NotI消化5μg pMOL944和25μl纯化的PCR片段，在0.7％琼脂糖凝胶(Nusieve，FMC)上电泳，将相关片段从胶上切下，按制造商说明书用QIAquick凝胶抽提试剂盒(Qiagen，USA)进行纯化。随后将分离的PCR DNA片段连接到经SacII-NotI消化并纯化的pMOL944上。用每种DNA片段各0.5μg、1U T4 DNA连接酶和T4连接酶缓冲液(Boehringer Mannheim，德国)16℃过夜完成连接。
连接混合物被用于转化感受态枯草芽孢杆菌PL2306。将转化细胞铺于含10μg/ml卡那霉素的LBPG琼脂平板上。37℃温育18小时后，菌落出现于平板上。通过从过夜肉汤培养液分离质粒DNA，分析几个克隆。
一个这样的阳性克隆重划线几次于如上所用的琼脂平板上；该克隆被称为MB1181-7。将MB1181-7克隆在含10μg/ml卡那霉素的TY中37℃培养过夜，第二天用Qiaprep Spin质粒小量制备试剂盒#27106，按制造商为枯草芽孢杆菌质粒制备推荐的方法，从1ml细胞中分离质粒。质粒DNA进行测序并揭示和SEQ ID NO1的1-2322bp中编码成熟内切葡聚糖酶的内切葡聚糖酶基因相同的DNA序列。衍生的蛋白质序列显示在SEQ IDNO2中。
实施例2表达和回收芽孢杆菌属种DSM 12648的内切-葡聚糖酶将按实施例1所述获得的MB1181-7培养在含10μg/ml卡那霉素的15×200ml Cal-18-2培养基中，所述培养在500ml带双档板的摇瓶中进行，37℃300rpm培养4天后，获得约2500ml的培养物。通过加入50％的CaCl2(每升培养液加入10ml)以及11％的铝酸钠(每升培养液加入10ml)，并加入20％的甲酸将pH维持在7.0和7.5之间，使培养液絮凝。在搅拌的过程中加入阳离子试剂Superfloc C521(每升培养液加入25ml的10％v/v稀释液)和阴离子试剂Superfloc A130(每升培养液加入75ml的在水中的0.1％w/v稀释液)，以完成絮凝。应用Sorval RC 3B离心机在6℃于10000rpm离心30分钟分离絮凝物。得到的上清中含有内切-葡聚糖酶活性。
应用Whatman玻璃滤纸GF/D和C使上清澄清。然后超滤以浓缩并减小溶液的离子强度。超滤膜为具有10kDa截断值的Filtron UF。超滤后溶液的电导率＜3mS/cm。将pH值调整到8.0。
然后用Q-Sepharose阴离子交换层析进行进一步的纯化。将来自超滤的溶液加载到含Q-Sepharose(Pharmacia)的300ml柱子上，所述Q-Sepharose柱已用25mmol的Tris(pH8.0)进行过平衡。内切-葡聚糖酶与Q-Sepharose结合，然后用0.5M的NaCl梯度洗脱。合并具有高内切-葡聚糖酶活性的级分。最终的合并内切-葡聚糖酶溶液的内切-葡聚糖酶活性为大约每毫升1000ECU。
实施例3本发明内切-葡聚糖酶的表征将来自实施例2的内切-葡聚糖酶样本加载到大小层析柱上，所述层析柱为以0.1M乙酸钠缓冲液(pH6.0)平衡的100ml的Superdex 200柱。内切-葡聚糖酶洗脱为单峰。该纯化的酶溶液用于进一步的表征，见如下。
从大小层析纯化中获得的酶在SDS-PAGE中在对应于约70到80kDa分子量的位置处给出单一条带，估计为73kDa。纯化的内切-葡聚糖酶的等电点为约4.2。
测定了N端的序列。结果如下XEGNTRE(SEQ ID NO11)X是注射物(injection)，并可能如基于DNA序列的序列中存在的为A。这样该N端序列确与SEQ ID NO2的N端序列一致。
用摩尔消光系数145800(基于从序列推导的氨基酸组成)测定了蛋白质浓度。
应用常规技术产生针对此纯化酶的兔多克隆单特异血清。血清在琼脂糖凝胶中与本发明的内切-葡聚糖酶形成单一沉淀物。
实施例440℃条件下在含去污剂和漂白剂的溶液中的稳定性在以下的条件下评估了来自实施例2的内切-葡聚糖酶的稳定性。
制备了带有漂白剂的粉末去污剂的溶液。此粉末去污剂为IEC-A去污剂，由wfk Testgewebe GmbH，D-41379(德国)提供。该去污剂为IEC 60456洗衣机参考基础去污剂，类型A。漂白剂为IEC 60456四水合过硼酸钠，类型SPB，也由wfk Testgewebe提供。
浓度粉末去污剂，IEC-A每升4.0g四水合过硼酸钠每升1.0g重碳酸钠每升0.5g水硬度15°dH(通过加入氯化钙和氯化镁溶液)溶液pH10.0将5ml此去污剂溶液的等分试样转移到试管中，且在40℃水浴中预热10分钟。
用水稀释来自实施例2的样本，制备活性为2.4ECU/ml的酶溶液。
将100μl的酶稀释液加入到每一预热试管中并混匀。溶液在40℃保持规定的时间，然后在冰水中快速冷却，然后冷冻保存。
室温下将0、50、100、150μl的相同酶溶液加入到5ml的去污剂溶液样本中，然后冷却并冷冻以制备参考样本。
然后测定热处理样本及参考样本中的活性。融解溶液，然后加入1mlpH9.5的缓冲液(参见以下)，使总体积达到6ml。用Cellazyme C片剂方法测定活性，所述测定按以上材料和方法部分中所描述的进行。
通过将a)和b)混合以达到pH9.5来制备pH9.5的缓冲液a)0.25M的磷酸盐缓冲液pH7.0(用NaH2PO4.H2O和NaOH制备)，含5.0g/l的Berol 537(来自Akzo Nobel的非离子表面活性剂)b)0.25M的碳酸钠，含5.0g/l的Berol 537(来自Akzo Nobel的非离子表面活性剂)热处理样本中的活性表示为在非热处理的标准品中存在的活性的百分比。结果如下40℃的时间，分钟 ％活性09915 9630 9245 9160 90在此含漂白剂的去污剂溶液中40℃条件下一小时后仅损失约10％的活性。
实施例550℃条件下在含漂白剂的碱性溶液中的稳定性在以下条件下评估了实施例2中获得的内切-葡聚糖酶的稳定性。
制备过硼酸钠漂白剂(过硼酸钠四水合物，类型SPB，来自wfkTestgewebe)的溶液。浓度为过硼酸钠四水合物每升1.25g甘氨酸缓冲液，pH90.1M
将5ml该溶液试样转移到试管中，并将其在水浴中50℃预热10分钟。
通过用水稀释来自实施例2的样本，制备活性为2.5ECU/ml的酶溶液。
将100μl的酶稀释液加入到每一预热的试管中，并混匀溶液。溶液在50℃保持规定的时间，然后在冰水中冷却，并冷冻保存。
室温条件下将0、50、100、150μl的相同酶溶液加入到5ml的漂白溶液样本中，然后冷却并冷冻以制备参考样本。
测定热处理样本和参考样本的活性，所述测定按照实施例4中的相同方法进行。
热处理样本中的活性表示为在非热处理的标准品中存在的活性的百分比。结果如下50℃的时间，分钟 ％活性0 1011576306945536044在此碱性漂白剂溶液中50℃条件下30分钟后损失不到50％的活性。
实施例6铁(II)离子抑制作用的试验用如下方法评估铁(II)离子对来自实施例2的内切-葡聚糖酶的失活作用。
A在0.1M的甘氨酸缓冲液(pH9)中溶解FeSO4.7H2O(Merck，p.a.)制备1mM的硫酸铁(II)溶液。
用a)0.1M的甘氨酸缓冲液，和b)含1mM Fe(II)的0.1M甘氨酸缓冲液稀释来自实施例2的样本制备两种其计算活性为2.6ECU/ml的酶溶液。
然后将0、50、100、150μl的来自这两种溶液的样本在6ml的缓冲液(5ml水加1ml实施例4中描述的pH9.5的缓冲液)中稀释，并用Cellazyme C片剂方法测定活性。
在甘氨酸缓冲液中制备的样本和在加有FeSO4.7H2O的甘氨酸缓冲液中制备的相应样本之间没有显著的活性差异。
用1mM的铁(II)离子处理不能灭活酶。
实施例7洗涤性能试验该试验证明在实施例2中获得的内切葡聚糖酶的去污和抗再沉积效果。此外，该试验证明当包括过硼酸钠漂白剂时，酶的性能基本不发生改变。
棉布样本用β-葡聚糖(来自大麦)和炭黑染污。污染的样本和清洁样本一同洗涤。洗涤后样本漂洗并干燥。污染样本上的污物去除和清洁样本上的污物再沉积通过反射率测量进行测定。比较洗涤后加入和不加入内切-葡聚糖酶的情况下的污物去除和污物再沉积。
样本剪自型号#2003的100％棉织品(Tanigashira，Osaka，日本)，在40℃预洗涤以预防性去除任何水溶性污染物，大小5×5cm，重约0.3g。
洗涤设备搅拌的烧杯，烧杯体积250ml，用水浴加热控制温度。此设备为多烧杯微型带搅拌器的洗衣机。
去污剂溶液通过将以下试剂加入到去离子水中制备碳酸钠，每升0.5g重碳酸钠，每升0.7gCa2+/Mg2+，使水的硬度达到12°dH阳离子表面活性剂，Surfac SDBS80(烷基苯磺酸钠)，每升0.5g非离子表面活性剂Berol 537(Akzo Nobel)，每升1.0g过硼酸钠，型号SPB，来自wfk Testgewebe，每升0或1.0g溶液的pH为约9.5。
洗涤方法每一烧杯中加入100ml去污剂溶液。水浴温度为40℃。机械搅拌器以约125rpm运转。去污剂溶液预热10分钟，然后加入内切-葡聚糖酶和样本。在每一情况下，三块污染样本(如以下描述制备)和三块清洁样本加入到每一烧杯中。洗涤30分钟后，从去污剂溶液中取出样本，在自来水的流水下漂洗5分钟，展平放在吸水纸上并晾干。
反射率测定应用Macbeth 7000 Color Eye反射分光光度计进行测定。对于污染样本，每一样本在污染区域的中央进行一次测定，然后计算平均值。对于清洁样本，每一样本在每一面进行一次测定，然后计算平均值。反射率测定均在500nm处进行。
污染样本用β-葡聚糖(来自大麦)和炭黑(“用于去污试验的炭”，由Sentaku Kagaku Kyokai，Tokyo，日本提供)制备污染样本。通过搅拌和加热至＞50℃在100ml的自来水中溶解约0.67g的β-葡聚糖。用UltraTurraxT25搅拌器以4000rpm速度搅拌2分钟。将250μl的β-葡聚糖/炭加到每一样本的中央。室温过夜干燥。
用于该实施例的样本在污染前的平均反射值为93.5，而污染后为17.5。
内切-葡聚糖酶的加入加入来自实施例2的内切-葡聚糖酶，以使每升去污剂溶液中的活性浓度为0、20或100ECU。
结果无漂白剂的去污剂(洗涤后反射率测量的平均值)加入的内切-葡聚糖酶污染样本 清洁样本025.1 33.5每升20ECU35.7 46.7每升100ECU 40.2 59.1结果带漂白剂的去污剂(洗涤后反射率测量的平均值)加入的内切-葡聚糖酶污染样本 清洁样本024.6 27.7每升20ECU36.8 52.6每升100ECU 39.3 63.2
与不用内切-葡聚糖酶洗涤的结果相比，内切-葡聚糖酶洗涤后污染样本的反射值增加，这说明内切-葡聚糖酶增加了污物从织物上的去除。此外，内切-葡聚糖酶可降低污物的再沉积，这可由内切-葡聚糖酶洗涤后清洁样本的反射值增加所证实。内切-葡聚糖酶对污物去除和抗再沉积作用的改进在加入漂白剂后基本未发生变化。
实施例8洗涤性能试验在家用去污剂的溶液中将清洁棉织物与污染的棉织物一同洗涤。洗涤在Terg-O-Tometer中进行。在洗涤过程中，污物从污染织物上释放到去污剂液体中。该污物可再沉积到清洁棉布上。洗涤后，漂洗并晾干这些棉织物，然后用反射分光光度计测量以检测污物再沉积的程度。
去污剂家用粉末去污剂，亚洲。
去污剂浓度0.67g/l的水溶液，硬度4°dH。
每个T-O-T烧杯中有1000ml的去污剂溶液。
棉织物每个T-O-T烧杯中共33g织物，包含适宜大小的白色机织棉布，#2003(Tanigashira，Osaka，日本)，总重量为11g白色棉毛布，总重量为13g污染的棉织物，型号EMPA101(EMPA，瑞士)，总重量为9g。
洗涤温度25℃，洗涤时间40分钟，转速125rpm。洗涤后，#2003棉布在自来水下流水漂洗10分钟，然后晾干。
反射率测定。用Macbeth 7000反射分光光度计在500nm处测定#2003机织棉布的每一面。计算来自每一个T-O-M烧杯的测量值的平均结果。
酶的加入在此试验中将如实施例2中描述所制备的内切-葡聚糖酶在洗涤步骤开始前加入到去污剂液体中。
结果
加入的内切-葡聚糖酶 #2003的反射值每升的ECU 在500nm处0 76.670 76.051 81.865 84.3020 84.8550 85.99从结果中可得出结论，本发明内切-葡聚糖酶的加入可减少污物的再沉积。
实施例9内切-葡聚糖酶活性的pH和温度函数应用40℃的反应温度在一系列pH值范围内测定了来自实施例2的内切-葡聚糖酶