肌内脂肪沉积lepr基因制作方法_杨明华专利（肌内,lepr,基因）-早鸽网

一种肌内脂肪沉积lepr基因制作方法

专利名称

一种肌内脂肪沉积lepr基因制作方法
发明者

杨明华, 潘洪彬, 王静, 赵素梅, 高士争, 黄英
公开日

2012年7月18日
申请日期

2011年12月15日
优先权日

2011年12月15日
申请人

云南农业大学
文档编号

C12Q1/68GK102586253SQ201110418460
关键字

肌内 lepr 基因沉积脂肪
权利要求

1.一种肌内脂肪沉积LEPR基因，是从版纳微型猪肌肉组织中分离、克隆的与肌内脂肪沉积相关的瘦素受体(L印tin receptor, LEPR)基因，其特征在于基因的⑶S序列全长为 3498bp,其CDS核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1，并且，CDS核苷酸序列编码1165个氨基酸，氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 22.根据权利要求I所述一种肌内脂肪沉积LEPR基因，其特征在于对上述特征的肌内脂肪沉积LEPR基因设计引物，进行PCR扩增，检测LEPR基因在猪心、肝、脾、肺、肾、肌肉和脂肪七个组织的组织表达谱，结果显示LEPR基因在脂肪组织中大量表达，初步表明LEPR基因在脂肪细胞中调控脂肪沉积的功能
技术领域

本发明涉及动物分子育种的基因工程技术，特别是一种与猪肌内脂肪沉积相关的瘦素受体(Leptin receptor, LEPR)基因技术背景技术近年来，由于猪的选育工作中过度追求高瘦肉率，导致猪肉品质的严重下降随着生活水平的不断提高，人们对猪肉颜色、嫩度、风味等肉品质特性的要求也越来越高肌内脂肪(Intramuscular fat, IMF)是影响肉品质的重要因素，目前已得到越来越多的认识和重视肌内脂肪的沉积是一个复杂的生理生化过程，主要涉及肌肉内甘油三酯的代谢，包括甘油三酯的合成、分解及转运等过程一些和脂肪沉积相关的激素也能影响肌内脂肪的沉积Ob基因(Obese)近年来受到广泛的关注，该基因于1950年首次在小鼠上被发现，为常染色体上隐性遗传，该基因正常的表达产物现在称之为瘦素(Leptin)，为脂肪细胞分泌的一种激素最早的研究报道L印tin对动物体能量平衡产生巨大影响，L印tin表达及分泌量的增加会显著降低动物的体重和采食量，显著加强机体能量的分解代谢及产热反应大多数学者认为leptin作用于下丘脑-垂体-性腺轴，它与leptin受体(Leptin receptor, LEPR)结合后，发挥调节机体能量代谢平衡、代谢、饮食摄入、生长、生殖等功能此外，LEPR与瘦素在外周与中枢间的交流中也有重要作用研究发现LEPR基因突变与肥胖、胰岛素抵抗及糖尿病相关有研究资料表明，LEPR的饱和程度与肥胖程度呈正比而肥胖型大鼠中LEPR可能都已饱和，这就解释了为什么有些肥胖鼠血清中虽有较高浓度的 Leptin,但没有减肥效果(刘建忠，1999)此外,还发现Leptin可能必须与LEPR结合才能被运输通过大脑屏障，而在肥胖动物中这种转运效率很低因此，血清中LEPR的状况将影响L印tin的生物活性，这也是导致L印tin具有抗性的主要原因1995年Tartaglia第一个成功地从小鼠脉络丛中克隆出LEPR基因，小鼠LEPR基因定位于4号染色体，人类LEPR基因位于1ρ31，长约5. 1Kb，含20个外显子，19个内含子，编码1165个氨基酸瘦素受体分布广泛，主要存在于中枢神经系统，尤其是大脑脉络丛、下丘脑，但许多外周组织，如肝脏、肾脏、心脏、脾脏、睾丸、骨骼肌、脂肪组织及胰岛细胞表面等也都存在LEPR，提示其有广泛的生物学作用目前对LEPR基因的研究主要集中在人类代谢性疾病如肥胖、胰岛素抵抗及糖尿病，以及对性激素分泌的影响等方面但对leptin与肌内脂肪含量的相关性研究还较少进一步研究ob基因的遗传变异与肉质相关性及对脂肪沉积的影响等有着非常重要的意义发明内容本发明的目的是提供一种肌内脂肪沉积LEPR基因，采用基因芯片技术和生物信息学分析方法，在对猪肌肉组织和肌内脂肪细胞基因表达谱的研究中发现LEPR基因参与肌内脂肪细胞脂类代谢过程，并首次从版纳微型猪肌肉组织中克隆了 LEPR基因—种肌内脂肪沉积LEPR基因，是从版纳微型猪肌肉组织中分离、克隆的与肌内脂肪沉积相关的瘦素受体(LEPR)基因，基因的CDS序列全长为3498bp，其CDS核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I并且，CDS核苷酸序列编码1165个氨基酸，氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2 对上述特征的肌内脂肪沉积LEPR基因设计引物，进行PCR扩增，检测LEPR基因在猪心、肝、脾、肺、肾、肌肉和脂肪七个组织的组织表达谱，结果显示LEPR基因在肝脏和肺中表达量最高，脂肪组织其次，初步表明LEPR基因在脂肪细胞中调控脂肪沉积的功能猪是脂肪沉积型动物，其脂肪沉积能力在不同品种之间变化很大我国一些肉质优良的地方猪种是最宝贵和稀缺的基因资源，这在优质猪肉的培育中有独特的利用价值版纳微型猪是云南省优良的地方猪种，具有耐粗饲、适应性强、肉质优良、肌内脂肪丰富，肌纤维细密，肉质鲜嫩等优良特性然而，目前对版纳微型猪的生长发育及肌内脂肪沉积的分子机制知之甚少近年来，本发明采用基因芯片技术和生物信息学分析方法，在对猪肌肉组织和肌内脂肪细胞基因表达谱的研究中发现LEPR基因参与肌内脂肪细胞的脂类代谢过程，并首次从版纳微型猪肌肉组织中克隆了 LEPR基因因此，研究版纳微型猪LEPR基因的序列与表达模式，分析其核苷酸和氨基酸序列结构，从分子水平了解版纳微型猪肌内脂肪沉积较多的特点，为进一步研究该基因的功能及为改善猪胴体脂肪性状的育种工作提供理论基础LEPR与肌肉组织中肌内脂肪沉积有关本发明克隆得到版纳微型猪LEPR基因CDS 全序列，全长为3498bp，提交到Genbank，登录号为GQ268933与Genbank提供的猪LEPR基因相比较，发现核苷酸序列有7个突变位点，其中5个为有义突变，导致氨基酸发生相应变化LEPR蛋白在物种间的同源性较高，通过进化树可以看出，猪与牛、羊的亲缘性较近，其次是人、大鼠猪LEPR蛋白氨基酸序列与羊、牛、人和大鼠的同源性分别为87%、87%、 84%和73%LEPR蛋白在不同物种间的高度保守性提示它们功能的重要性，这些基因的保守性也是LEPR在各个物种中相应的生理特点保持不变的分子基础另外，LEPR在脂肪组织中的多量表达，也证明了它在肌内脂肪沉积等方面的重要作用四

专利详情
全文pdf
权力要求
说明书
法律状态

专利名称：一种肌内脂肪沉积lepr基因的制作方法图I是本发明的PCR扩增LEPR基因图示图2是本发明的LEPR在不同组织中的表达水平柱3是本发明的进化树分析4是本发明的LEPR蛋白二级结构预测图(I)图5是本发明的LEPR蛋白二级结构预测图(2)图6是本发明的LEPR蛋白磷酸化位点预测7是本发明的LEPR蛋白糖基化位点预测8是本发明的LEPR蛋白疏水性分析9是本发明的LEPR蛋白的信号肽预测10是本发明的LEPR蛋白质跨膜区预测11是本发明的LEPR蛋白质跨膜螺旋预测图五一种肌内脂肪沉积LEPR基因，是从版纳微型猪肌肉组织中分离、克隆的与肌内脂肪沉积相关的瘦素受体O^ptin receptor, LEPR)基因，其特征在于基因的⑶S序列全长为43498bp,其CDS核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I。并且，CDS核苷酸序列编码1165个氨基酸，氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2。对上述特征的肌内脂肪沉积LEPR基因设计引物，进行PCR扩增，检测LEPR基因在猪心、肝、脾、肺、肾、肌肉和脂肪七个组织的组织表达谱，结果显示LEPR基因在脂肪组织中有大量表达，初步表明LEPR基因在脂肪细胞中调控脂肪沉积的功能。I、肌肉组织中总RNA的提取采取50kg成年版纳微型猪肌肉组织立即放入液氮中保存备用。利用RNA提取试剂提取版纳微型猪肌肉组织总RNA，具体操作参照试剂盒说明进行。将提取的RNA反转录成 cDNA，_20°C保存，待用。2、PCR引物设计及PCR反应条件根据GenBank中猪LEPR序列信息(GenBank登录号ΝΜ_001024587),利用Primer Premier 5. O设计引物，并合成。为了得到较佳的扩增效果，采用分四段扩增的方法，最后将四段序列拼接在一起。用于克隆的LEPR基因的引物序列为第一段，产物长度为642bp
F :5，- TCTGAAGTAAGATGACG -3，
R :5’ - TAAGAAGGGTGTAGTTG -3’
第二段，产物长度为997bp
F :5，- GCCAAACTCAACTACACCC -3，
R :5，- CCACGGAATCAGGAATG -3，
第三段，产物长度为834bp
F :5，- GCCTCTACTGTTCTGACG -3，
R :5，- GATAAGCACTGAGCGACT -3，
第四段，产物长度为1279bp
F :5’ - CAGTCGCTCAGTGCTTATC -3’
R :5，- AACTTAGACGGTTAGGTCATAC -3，
用于荧光定量的LEPR基因的引物序列为
F :5’ - GTGATAACTGCATTTGACTTGGC -3’
R:5’ - CTGCAATGTTGTCTGCATGTACAG -3’
内参18S rRNA的引物序列为
F :5’ -CTGCCTTCCTTGGATGTG -3’
R:5’ -GCGGCTTTGGTGACTCTA -3’
LEPR基因克隆的PCR反应条件为第一段94°C预变性4min ;94°C变性lmin，50°C复性lmin，72°C延伸lmin，共35个循环;72°C延伸7min ;第二段:94°C预变性4min ;94°C变性 30s，45°C复性50s，72°C延伸lmin30s，共40个循环；72°C延伸7min ;第三段94°C预变性 4min ;94°C变性 30s，45°C复性 50s，72°C延伸 lmin30s，共 40 个循环；72°C延伸 7min ;第四段94°C预变性4min ;94°C变性30s，45°C复性lmin，72°C延伸2min，共35个循环;72°C延伸7min。PCR扩增产物经I. 5%琼脂糖凝胶电泳检测后，确认扩增的产物的长度大小同于目的片段大小。
荧光定量PCR的反应条件为94°C预变性3min;94 °C变性30 s，62°C退火30s， 39个循环；72°C后延伸7min进行扩增。数据处理的方法为，检测心、肝、脾、肺、肾、肌肉、脂肪七个组织中LEPR基因的相对表达量，实验数据以18S rRNA作为内参，采用双标准曲线法处理。结果显示，LEPR在被检测的7个组织中都有表达，在肝脏、肺中高量表达，在脂肪中大量表达，在肾、脾、心中少量表达，在肌肉中微量表达。3、LEPR基因的克隆及序列分析
按照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒书说明书回收特异性条带，产物连接于pMD-18T载体，转化至ToplO感受态细胞，氨苄筛选挑取阳性克隆，分别接种于IOmL LB液体培养基中， 37°C振荡过夜，提取质粒经Ecor I和Hind III双酶切鉴定为阳性，进行测序。4、测序结果
所得到的版纳微型猪LEPR编码区(CDS)全长3498bp，核苷酸序列如说明书核苷酸和氨基酸序列表SEQ. ID. NO. I所示，并提交到Genbank数据库，登录号为GQ268933。CDS序列编码1165个氨基酸，其氨基酸序列如说明书核苷酸和氨基酸序列表SEQ. ID. NO. 2所示。5、测序结果与Genbank中提供的序列比对
登录http://www. ebi. ac. uk/Tools/clustalw2/,以版纳微型猪的核苷酸序列同 GeneBank中猪LEPR基因(登录号为ΝΜ_001024587)的⑶S序列进行序列比对。结果发现有 7个突变位点，即第401位由A变为G，658位由G变为A，1153位由G变为A，1674位由G变为C，1910位由A变为G，2507位由G变为C，2841位由C变为T。其中5个为有义突变，导致第134位赖氨酸K变为精氨酸R，220位丙氨酸A变为苏氨酸T，385位甘氨酸G变为丝氨酸S，558位色氨酸W变为半胱氨酸C，637位赖氨酸K变为精氨酸R。如说明书核苷酸和氨基酸序列表。6、LEPR基因核苷酸与氨基酸序列同源性分析
登录http://www. ebi. ac. uk/Tools/clustalw2/,以版纳微型猪LEPR基因测序结果与牛(登录号为NM_001012285)、人(登录号为BC160009)、羊(登录号为ΝΜ_001009763)和大鼠 (登录号为NM_012596) LEPR基因的核苷酸和氨基酸序列比对分析，结果显示版纳微型猪与牛、羊、人和大鼠的LEPR基因的⑶S序列同源性分别为90%、90%、89%和80% ；CDS序列所编码氨基酸的同源性分别为87%、87%、84%和73%。如说明书核苷酸和氨基酸序列表。 7、LEPR基因的进化树分析
利用Meg4软件的邻近(Neighbor-joining)方法构建版纳微型猪(Genbank登录号(GQ268933)、牛(登录号为NM_001012285)、人(登录号为BC160009)、羊(登录号为 NM_001009763)和大鼠(登录号为NM_012596) LEPR蛋白的系统进化树，结果显示版纳微型猪与山羊的亲缘性较近，其次是牛、人、大鼠。8、LEPR蛋白分子量、等电点预测分析
使用ExPASy的在线软件Compute pi/MW分析版纳微型猪LEPR蛋白的等电点(pi)为 6. 08、理论分子量(pW)为 132582. 49 Da。9、LEPR蛋白质二级结构预测分析
登陆http://bioinf. cs. ucl. ac. uk/psipred/,对版纳微型猪LEPR蛋白质二级结构进行预测，共有5个螺旋、471个伸展链和689个卷曲结构。10、LEPR蛋白质磷酸化位点预测登陆 http://www. cbs. dtu. dk/services/NetPhos/,对猪 LEPR 蛋白质憐酸化位点进行预测，结果显示，共有66个磷酸化位点，其中丝氨酸磷酸化位点有42个、苏氨酸磷酸化位点有11个、酪氨酸磷酸化位点有13个。11、LEPR蛋白质糖基化位点预测
登录 http://www. cbs. dtu. dk/services/NetNGlyc/,对版纳微型猪 LEPR 蛋白糖基化位点预测，结果显示在第41、72、80、98、187、206、397、433、659、1045位，1^ 1 蛋白共有10个糖基化位点。12、LEPR蛋白质疏水性分析
登陆http://web. expasy. org/protscale/,对LEPR蛋白质疏水性进行分析,结果显示为未水性蛋白。13、LEPR蛋白质信号肽的预测分析
登陆 http://www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/,对 LEPR 蛋白的信号肽进行预测。采用signalP-ΝΝ方法对信号肽可能存在的分割位点进行预测，结果显示LEPR蛋白序列存在一个可能的信号肽结构，且分割位点在第21至22个氨基酸之间。13、LEPR蛋白质跨膜区预测
登陆 http://www. cbs. dtu. dk/services/TMHMM/,对 LEPR 蛋白质跨膜区进行分析，结果显示I位至838位氨基酸有跨膜区，方向向外；862-1165位氨基酸有跨膜区，方向向内；893-861位氨基酸为螺旋。14、LEPR蛋白质的跨膜螺旋分析
登陆 http://www. ch. embnet. org/software/TMPRED_form. html,对 LEPR 蛋白的跨膜螺旋进行预测。结果显示在LEPR蛋白的氮末端18- 33 (16)位氨基酸有跨膜螺旋，方向由外向内；501-516(16)位氨基酸有跨膜螺旋，方向由内向外；712-738(27)位氨基酸有跨膜螺旋，方向为由外向内；749- 775(27)位氨基酸有跨膜螺旋，方向为由内向外；847-865 (19) 位氨基酸有跨膜螺旋，方向由外向内。

本发明公开一种肌内脂肪沉积LEPR基因，是从版纳微型猪肌肉组织中分离、克隆的与肌内脂肪沉积相关的瘦素受体(Leptinreceptor，LEPR)基因，基因的CDS序列全长为3498bp,其CDS核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1。并且，CDS核苷酸序列编码1165个氨基酸，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2。检测LEPR基因在猪心、肝、脾、肺、肾、肌肉和脂肪七个组织的组织表达谱，结果显示LEPR基因在脂肪组织中大量表达，初步表明LEPR基因在脂肪细胞中调控脂肪沉积的功能。

查看更多专利详情

下载专利文献

下载专利