专利名称：从禽多杀性巴氏杆菌提取脂多糖并制作脂多糖疫苗的方法禽多杀性巴氏杆菌病是由禽多杀性巴氏杆菌引起的家禽接触性传染病，呈世界分 布，在我国也是常见的多发性传染病，几乎所有的家禽都能感染该病，其传染流行严重影响 着家禽业的健康发展。目前我国对于禽多杀性巴氏杆菌病的预防和治疗主要采用的是药物治疗，如抗生 素等，但一旦停药后容易复发，且长期用药容易诱导禽多杀性巴氏杆菌产生耐药性，还可能 产生副作用，比如会引起产蛋鸡产蛋率的下降。因此，为了更加有效地预防禽多杀性巴氏杆 菌病的流行，需要用有效的疫苗进行免疫。禽多杀性巴氏杆菌病的常规疫苗主要有弱毒活疫苗和灭活疫苗两种，但是弱毒活 疫苗存在一定的缺点，比如免疫持续期比较短、保护效果偏低、副作用偏大，应用不当时会 引起免疫失败，甚至会造成一些家禽的死亡。而灭活疫苗在灭活过程中可能造成某些抗原物质的丢失，只能对同血清型的菌株 感染有一定的免疫效果，且保护效果和免疫持续期还不如弱毒活疫苗更好。脂多糖是禽多杀性巴氏杆菌内毒素的物质基础，在禽多杀性巴氏杆菌崩裂时释放 出来，是很强的发热原。目前人们普遍认为脂多糖在禽多杀性巴氏杆菌的致病过程中起着 重要的作用。研究表明禽多杀性巴氏杆菌的脂多糖在对嗜中性粒细胞的黏附中起着辅助作 用。从血清型为B:2的禽多杀性巴氏杆菌菌株中分离到的脂多糖能够引起动物产生出血性 败血症的症状。除了具有致病性外，禽多杀性巴氏杆菌的脂多糖还能够诱发体液免疫应答， 因此被认为是一种保护性抗原。截止目前，从禽多杀性巴氏杆菌中提取脂多糖并制作禽多杀性巴氏杆菌脂多糖疫 苗的方法还未见相关报道。
为解决上述问题，本发明提供了一种从禽多杀性巴氏杆菌提取脂多糖并制作脂多 糖疫苗的方法，该方法先从禽多杀性巴氏杆菌中提取脂多糖，然后将提取的脂多糖溶液与 弗氏完全佐剂按照1 1.5的比例进行混合制成禽多杀性巴氏杆菌病脂多糖疫苗，经动物 实验验证表明本方法制备出的禽多杀性巴氏杆菌病脂多糖疫苗可有效地为被免疫的鸡提 供抵抗禽多杀性巴氏杆菌攻击的能力，保护率为66. 7%，能够有效地预防家禽产生禽多杀性 巴氏杆菌病。为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案一种从禽多杀性巴氏杆菌提取脂多糖并制作脂多糖疫苗的方法，该方法经过①制备禽 多杀性巴氏杆菌培养液、②从禽多杀性巴氏杆菌培养液中收集禽多杀性巴氏杆菌菌体、③超声波对禽多杀性巴氏杆菌菌体进行破碎、④从超声波破碎的禽多杀性巴氏杆菌菌体中粗 提脂多糖溶液、⑤从粗提的脂多糖溶液中提取脂多糖浓缩液、⑥用DNA酶和RNA酶来酶解脂 多糖浓缩液中的DNA和RNA、⑦制备纯化的脂多糖和⑧将纯化的脂多糖制作成禽多杀性巴 氏杆菌脂多糖疫苗共八个步骤，上述八个步骤中所述的②中涉及到离心机的离心转速，所 述的③中涉及到超声波的功率、辐射时间、间歇秒数和辐射次数，所述的⑤中涉及到换水次 数，所述的⑥中涉及到酶解时间，所述的⑦中涉及到用浓度为6摩尔/升NaOH来调节溶液 的PH值，所述的⑧中涉及到脂多糖溶液与弗氏完全佐剂的体积比均为常规实验技术手段， 这些常规实验技术手段中的任一项作为单独实验条件或许是存在的，但这些常规实验技术 手段综合应用在“从禽多杀性巴氏杆菌提取脂多糖并制作脂多糖疫苗的方法”则是必需的。 本发明从禽多杀性巴氏杆菌提取脂多糖并制作脂多糖疫苗的方法所述的八个步 骤分述如下①制备禽多杀性巴氏杆菌培养液用接种环刮取一环斜面保藏的禽多杀性巴氏杆菌，将刮有一环禽多杀性巴氏杆菌的接 种环以“Z”字型划线接种于培养平板上，将培养平板放置于37°C培养箱内培养M小时，挑 取培养M小时后的培养平板上生长的一个单菌落接种于5毫升的液体培养基中，将该5毫 升的液体培养基放在37°C的摇床中以160转/分钟的速度振荡培养M小时，再将振荡培养 的5毫升液体培养基全部倒入200毫升的液体培养基中并在37°C的摇床中以160转/分钟 的速度振荡培养M小时制备出禽多杀性巴氏杆菌培养液；②从禽多杀性巴氏杆菌培养液中收集禽多杀性巴氏杆菌菌体
将上述①制备出的禽多杀性巴氏杆菌培养液加入到250毫升的离心管中，将加入禽多 杀性巴氏杆菌培养液的该250毫升离心管放在离心机上并在5000转/分钟的转速下离心 15分钟，然后将离心15分钟后的250毫升离心管中的上清液弃掉，留在该250毫升离心管 中的沉淀物就是所收集的禽多杀性巴氏杆菌菌体；
③超声波对禽多杀性巴氏杆菌菌体进行破碎
在上述②中250毫升离心管所收集的禽多杀性巴氏杆菌菌体中加入10毫升的蒸馏水， 然后将该250毫升离心管置于超声波破碎仪中，设置超声波破碎仪的功率为500瓦，每超声 波辐射20秒后停止辐射20秒为一个破碎循环过程，所有破碎循环过程共持续30分钟，30 分钟后该250毫升离心管中得到的就是经超声波破碎的禽多杀性巴氏杆菌菌体；
④从超声波破碎的禽多杀性巴氏杆菌菌体中粗提脂多糖溶液
从禽多杀性巴氏杆菌菌体中粗提脂多糖分为三步，三步分述如下
第一步，提取上述③中经超声波破碎得到的禽多杀性巴氏杆菌菌体10毫升并加入到 50毫升离心管中，然后再向该50毫升离心管中加入10毫升其浓度为90%的苯酚，颠倒该 50毫升离心管数次使10毫升禽多杀性巴氏杆菌菌体和10毫升苯酚充分混勻，然后将充分 混勻的该50毫升离心管放置在70°C的水浴锅中加热并用玻璃棒快速搅拌30分钟，30分钟 后从水浴锅中取出该50毫升离心管并在室温下放置20分钟，再将该50毫升离心管放在离 心机上并在4000转/分钟的转速下离心30分钟，离心结束后将该50毫升离心管的上层溶 液吸取并加入到另一 50毫升的三角瓶中、该50毫升离心管中的中层溶液弃掉不要、最后再 向该50毫升离心管中的下层溶液中加入蒸馏水补足体积至10毫升待用；
第二步，向第一步中待用的该50毫升离心管中的下层溶液+蒸馏水中加入10毫升其浓度为90%的苯酚，颠倒该50毫升离心管数次使其充分混勻，充分混勻后将该50毫升离心 管放置在70°C的水浴锅中加热并用玻璃棒快速搅拌30分钟，30分钟后从水浴锅中取出该 50毫升离心管并在室温下放置20分钟，再将该50毫升离心管放在离心机上并在4000转/ 分钟的转速下离心30分钟，离心结束后将该50毫升离心管的上层溶液吸取并加入到第一 步中的另一 50毫升的三角瓶中存储、该50毫升离心管中的中层溶液弃掉不要、最后再向该 50毫升离心管中的下层溶液中加入蒸馏水补足体积至10毫升准备再次使用；
第三步，重复第二步数次直至将另一 50毫升的三角瓶储满刻度为止，存储满50毫升的 另一 50毫升三角瓶中的所述上层溶液就是从超声波破碎的禽多杀性巴氏杆菌菌体中粗提 的脂多糖溶液；
⑤从粗提的脂多糖溶液中提取脂多糖浓缩液
将粗提的50毫升脂多糖溶液全部加入到透析袋中，将透析袋放在自来水流水中持续 冲洗48小时，再将透析袋放入到蒸馏水中浸泡，每6小时浸泡换一次蒸馏水共换蒸馏水8 次，然后将透析袋放入装有聚乙二醇6000的烧杯中进行浓缩，直到透析袋中的50毫升脂多 糖溶液被浓缩到7. 5毫升浓缩液为止，透析袋中所述
7. 5毫升浓缩液即为脂多糖浓缩液；
⑥用DNA酶和RNA酶来酶解脂多糖浓缩液中的DNA和RNA
将上述⑤中的所述7. 5毫升脂多糖浓缩液倒入10毫升的离心管中，再向该10毫升离 心管中分别加入375微克的DNA酶和RNA酶；将该10毫升离心管放在37°C水浴中放置5 小时，再将该10毫升离心管放在100°C水浴中放置10分钟，放置10分钟后从100°C水浴中 取出该10毫升离心管并冷却至室温，在室温条件下将该10毫升离心管放在离心机上并在 3000转/分钟的转速下离心30分钟，离心30分钟后将该10毫升离心管中的上清液吸取并 倒入另一 100毫升的离心管中备用；
⑦制备纯化的脂多糖
向上述⑥备用的另一 100毫升离心管中加入体积是其上述⑥所述上清液液体6倍的无 水乙醇并用6摩尔/升的NaOH调节pH值至9. 0，再将该另一 100毫升离心管在4°C时放置 12小时，然后在离心机上并在6000转/分钟的转速下离心15分钟，离心15分钟后将该另 一 100毫升离心管中的液体倒掉、留在该另一 100毫升离心管中的沉淀物即为所制备纯化 的脂多糖；
⑧将纯化的脂多糖制作成禽多杀性巴氏杆菌脂多糖疫苗
在上述⑦另一 100毫升离心管中所制备纯化的脂多糖中加入1毫升的超纯水进行溶解 并得到高浓度的脂多糖溶液，用蒽酮法测定所述脂多糖溶液的浓度，缓慢加入超纯水至所 述脂多糖溶液的浓度达到0. 5毫克/毫升为止；
向上述浓度为0. 5毫克/毫升的所述脂多糖溶液中倒入50毫升烧杯中，再向该50毫 升烧杯中加入体积是所述脂多糖溶液体积1. 5倍的弗氏完全佐剂，同时在该50毫升烧杯中 放入一磁力棒并在磁力搅拌器作用下搅拌1小时，搅拌1小时后在该50毫升烧杯中的溶液 就是制作的禽多杀性巴氏杆菌脂多糖疫苗。所述培养平板上包含有1. 5%的胰蛋白胨、0. 5%的大豆蛋白胨、0. 5%的氯化钠、2% 的琼脂和少量水。所述液体培养基包含有1. 5%的胰蛋白胨、0. 5%的大豆蛋白胨、0. 5%的氯化钠和少量水。
由于采用如上所述的技术方案，本发明具有如下优越性
1、本发明在用超声波对禽多杀性巴氏杆菌菌体进行破碎时，所用超声波破碎仪的功率 为500瓦，每超声波辐射20秒后停止辐射20秒为一个破碎循环过程，在这一个破碎循环过 程中，辐射20秒后由于超声波所形成的空穴效应，可使禽多杀性巴氏杆菌菌体破裂，停止 辐射的20秒可以使超声波破碎仪得到修整。经过30分钟所有破碎循环过程后及在不损害 超声波破碎仪的前提下可得到最大量的经超声波破碎的禽多杀性巴氏杆菌菌体。2、本发明从超声波破碎的禽多杀性巴氏杆菌菌体中粗提脂多糖溶液时所用苯酚 浓度为90%，当经超声波破碎的禽多杀性巴氏杆菌与浓度为90%的苯酚混合并加热至70°C 并用玻璃棒剧烈搅拌时，苯酚和脂多糖溶液形成了单一相，而冷却后则形成了苯酚相和水 相；脂多糖大部分溶解于水相中，而大部分蛋白质溶解于苯酚相中，不溶性物质沉淀在两相 交界处，经过这种方法可以得到最大量的粗提的禽多杀性巴氏杆菌脂多糖溶液。3、本发明从粗提的脂多糖溶液中提取脂多糖浓缩液时，将粗提的禽多杀性巴氏杆 菌脂多糖溶液全部加入到透析袋中，将透析袋放在自来水流水中持续冲洗48小时，再将透 析袋放入到蒸馏水中浸泡，每6小时浸泡换一次蒸馏水共换蒸馏水8次，然后将透析袋放入 装有聚乙二醇6000的烧杯中进行浓缩，这种方法可得到高浓度的禽多杀性巴氏杆菌脂多 糖溶液。4、本发明用DNA酶和RNA酶来酶解脂多糖浓缩液中的DNA和RNA时，可通过DNA 酶和RNA酶的作用使禽多杀性巴氏杆菌脂多糖浓缩液中的DNA和RNA得以酶解，以除去含 在脂多糖浓缩液中的DNA和RNA，得到更高纯度的禽多杀性巴氏杆菌脂多糖溶液。5、本发明制备纯化的脂多糖时，向上述⑥备用的另一 100毫升离心管中加入体积 是其上述⑥所述上清液液体6倍的无水乙醇并用6摩尔/升的NaOH调节pH值至9. 0，再将 该另一 100毫升离心管在4°C时放置12小时，用这种方法可使禽多杀性巴氏杆菌脂多糖完 全沉淀下来，得到最大量的纯化的脂多糖。6、本发明将将纯化的脂多糖制作成禽多杀性巴氏杆菌脂多糖疫苗时，将提取的脂 多糖溶液与弗氏完全佐剂按照1 1.5的比例进行混合制成禽多杀性巴氏杆菌病脂多糖疫 苗，弗氏完全佐剂含结核分枝杆菌的细胞壁成分，是一种油包水的乳浊液，可以加强对抗原 的抗体反应，能够非常有效的诱导产生高滴度的抗体，弗氏完全佐剂活性来自于制备的脂 多糖疫苗中免疫原的持续释放并刺激局部免疫反应，用这种方法制备的禽多杀性巴氏杆菌 脂多糖疫苗可增强免疫效果。

上述八个步骤中所述的②中涉及到离心机的离心转速，所述的③中涉及到超声波 的功率、辐射时间、间歇秒数和辐射次数，所述的⑤中涉及到换水次数，所述的⑥中涉及到 酶解时间，所述的⑦中涉及到用浓度为6摩尔/升NaOH来调节溶液的pH值，所述的⑧中涉 及到脂多糖溶液与弗氏完全佐剂的体积比均为常规实验技术手段，这些常规实验技术手段 中的任一项作为单独实验条件或许是存在的，但这些常规实验技术手段综合应用在本发明 的方法之中则是必需的。本发明的八个步骤分述如下 ①制备禽多杀性巴氏杆菌培养液
用接种环刮取一环斜面保藏的禽多杀性巴氏杆菌，将刮有一环禽多杀性巴氏杆菌的接 种环以“Z”字型划线接种于培养平板上，将培养平板放置于37°C培养箱内培养对小时，挑 取培养M小时后的培养平板上生长的一个单菌落接种于5毫升的液体培养基中，将该5毫 升的液体培养基放在37°C的摇床中以160转/分钟的速度振荡培养M小时，再将振荡培养 的5毫升液体培养基全部倒入200毫升的液体培养基中并在37°C的摇床中以160转/分钟 的速度振荡培养M小时制备出禽多杀性巴氏杆菌培养液。需要注意的是
所述培养平板上包含有1. 5%的胰蛋白胨、0. 5%的大豆蛋白胨、0. 5%的氯化钠、2%的琼 脂和少量水。所述液体培养基包含有1. 5%的胰蛋白胨、0. 5%的大豆蛋白胨、0. 5%的氯化钠和少 量水。上述①中两次使用的液体培养基相同。②从禽多杀性巴氏杆菌培养液中收集禽多杀性巴氏杆菌菌体
将上述①制备出的禽多杀性巴氏杆菌培养液加入到250毫升的离心管中，将加入禽多 杀性巴氏杆菌培养液的该250毫升离心管放在离心机上并在5000转/分钟的转速下离心 15分钟，然后将离心15分钟后的250毫升离心管中的上清液弃掉，留在该250毫升离心管 中的沉淀物就是所收集的禽多杀性巴氏杆菌菌体，为下一步的超声波破碎作准备。③超声波对禽多杀性巴氏杆菌菌体进行破碎
在上述②中250毫升离心管所收集的禽多杀性巴氏杆菌菌体中加入10毫升的蒸馏水， 10毫升的蒸馏水能将禽多杀性巴氏杆菌菌体在该250毫升离心管中悬浮起来，然后将该 250毫升离心管置于超声波破碎仪中，设置超声波破碎仪的功率为500瓦，每超声波辐射20 秒后停止辐射20秒为一个破碎循环过程，所有破碎循环过程共持续30分钟，30分钟后该 250毫升离心管中得到的就是经超声波破碎的禽多杀性巴氏杆菌菌体，该步骤的目的是通 过超声波破碎对禽多杀性巴氏杆菌菌体进行裂解，使其中的脂多糖尽可能多的释放出来。④从超声波破碎的禽多杀性巴氏杆菌菌体中粗提脂多糖溶液 从禽多杀性巴氏杆菌菌体中粗提脂多糖分为三步，三步分述如下
第一步，提取上述③中经超声波破碎得到的禽多杀性巴氏杆菌菌体10毫升并加入到 50毫升离心管中，然后再向该50毫升离心管中加入10毫升其浓度为90%的苯酚，颠倒该 50毫升离心管数次(至少3次)使10毫升禽多杀性巴氏杆菌菌体和10毫升苯酚充分混勻， 然后将充分混勻的该50毫升离心管放置在70°C的水浴锅中加热并用玻璃棒快速搅拌30分 钟，30分钟后从水浴锅中取出该50毫升离心管并在室温下放置20分钟，再将该50毫升离 心管放在离心机上并在4000转/分钟的转速下离心30分钟，离心结束后将该50毫升离心管的上层溶液吸取并加入到另一 50毫升的三角瓶中、该50毫升离心管中的中层溶液弃掉 不要、最后再向该50毫升离心管中的下层溶液中加入蒸馏水补足体积至10毫升待用。第二步，向第一步中待用的该50毫升离心管中的下层溶液+蒸馏水中加入10毫 升其浓度为90%的苯酚，颠倒该50毫升离心管数次(至少3次)使其充分混勻，充分混勻后 将该50毫升离心管放置在70°C的水浴锅中加热并用玻璃棒快速搅拌30分钟，30分钟后从 水浴锅中取出该50毫升离心管并在室温下放置20分钟，再将该50毫升离心管放在离心机 上并在4000转/分钟的转速下离心30分钟，离心结束后将该50毫升离心管的上层溶液吸 取并加入到第一步中的另一 50毫升的三角瓶中存储、该50毫升离心管中的中层溶液弃掉 不要、最后再向该50毫升离心管中的下层溶液中加入蒸馏水补足体积至10毫升准备再次 使用。第三步，重复第二步数次直至将另一 50毫升的三角瓶储满刻度为止，存储满50毫 升的另一 50毫升三角瓶中的所述上层溶液就是从超声波破碎的禽多杀性巴氏杆菌菌体中 粗提的脂多糖溶液。该步骤的第三步要不断重复进行直至将另一 50毫升的三角瓶储满刻度为止，可 以粗提更多的的脂多糖溶液，也为下一步提取脂多糖浓缩液作准备。⑤从粗提的脂多糖溶液中提取脂多糖浓缩液
将粗提的50毫升脂多糖溶液全部加入到透析袋中，将透析袋放在自来水流水中持续 冲洗48小时，再将透析袋放入到蒸馏水中浸泡，每6小时浸泡换一次蒸馏水共换蒸馏水8 次，然后将透析袋放入装有聚乙二醇6000的烧杯中进行浓缩，直到透析袋中的50毫升脂多 糖溶液被浓缩到7. 5毫升浓缩液为止，透析袋中所述7. 5毫升浓缩液即为脂多糖浓缩液，该 步骤通过浓缩过程可以提高脂多糖的浓缩液浓度。所述脂多糖浓缩液中含有微量DNA和 RNA。⑥用DNA酶和RNA酶来酶解脂多糖浓缩液中的DNA和RNA
将上述⑤中的所述7. 5毫升脂多糖浓缩液倒入10毫升的离心管中，再向该10毫升离 心管中分别加入375微克的DNA酶和RNA酶，可使分别加入375微克的DNA酶和RNA酶在 所述7. 5毫升脂多糖浓缩液中的浓度控制在50微克/毫升左右并使所述脂多糖浓缩液中 含有的微量DNA和RNA得以酶解。将该10毫升离心管放在37°C水浴中放置5小时，再将 该10毫升离心管放在100°C水浴中放置10分钟，放置10分钟后从100°C水浴中取出该10 毫升离心管并冷却至室温，在室温条件下将该10毫升离心管放在离心机上并在3000转/ 分钟的转速下离心30分钟，离心30分钟后将该10毫升离心管中的上清液吸取并倒入另一 100毫升的离心管中备用。⑦制备纯化的脂多糖
向上述⑥备用的另一 100毫升离心管中加入体积是其上述⑥所述上清液液体6倍的无 水乙醇并用6摩尔/升的NaOH调节pH值至9. 0，再将该另一 100毫升离心管在4°C时放置 12小时，然后在离心机上并在6000转/分钟的转速下离心15分钟，离心15分钟后将该另 一 100毫升离心管中的液体倒掉、留在该另一 100毫升离心管中的沉淀物即为所制备纯化 的脂多糖。⑧将纯化的脂多糖制作成禽多杀性巴氏杆菌脂多糖疫苗
在上述⑦另一 100毫升离心管中所制备纯化的脂多糖中加入1毫升的超纯水进行溶解并得到高浓度的脂多糖溶液，用蒽酮法测定所述脂多糖溶液的浓度，缓慢加入超纯水至所 述脂多糖溶液的浓度达到0. 5毫克/毫升为止，此时另一 100毫升离心管中的所述脂多糖 溶液大约为10毫升左右。向上述浓度为0. 5毫克/毫升的所述脂多糖溶液中倒入50毫升烧杯中，再向该50 毫升烧杯中加入体积是所述脂多糖溶液体积1. 5倍的弗氏完全佐剂，同时在该50毫升烧杯 中放入一磁力棒并在磁力搅拌器作用下搅拌1小时，搅拌1小时后在该50毫升烧杯中的 溶液就是制作的禽多杀性巴氏杆菌脂多糖疫苗，所述禽多杀性巴氏杆菌脂多糖疫苗约为25 毫升，25毫升所述禽多杀性巴氏杆菌脂多糖疫苗中的脂多糖含量约为0. 2毫克/毫升。由 于实验的环境、条件、手段以及操作方式不同，制作的所述禽多杀性巴氏杆菌脂多糖疫苗或 ^ 25毫升，或<25毫升，所述的25毫升并非是确定值，仅供参考而已。本发明八个步骤中所使用的接种环、培养平板、培养箱、摇床、离心机、超声波破碎 仪、水浴锅、透析袋、烧杯、三角瓶、磁力棒、玻璃棒等均为生物学实验室普通实验仪器及材 料，均可在生物工程公司购买到。本发明八个步骤中所使用的胰蛋白胨、大豆蛋白胨、蒸馏水、苯酚、聚乙二醇6000、 DNA酶、RNA酶、无水乙醇、NaOH、超纯水、蒽酮、硫酸、弗氏完全佐剂等为生物学实验室普通 试剂，均能在化学试剂公司或生物工程公司购买到。本发明所使用的胰蛋白胨，大豆蛋白胨，苯酚，聚乙二醇6000，氢氧化钠，无水乙 醇，DNA酶，RNA酶，弗氏完全佐剂，蒽酮，硫酸，透析袋等均能在化学试剂公司或生物工程公 司购买到。有关从禽多杀性巴氏杆菌中提取脂多糖并制作禽多杀性巴氏杆菌脂多糖疫苗的 免疫预防效果参考如下
动物免疫实验和动物攻毒实验的限定条件是禽多杀性巴氏杆菌脂多糖疫苗中的脂多 糖含量为0.2毫克/毫升。1、动物免疫实验
动物免疫实验所用的实验物为鸡，取30只1日龄的未经过免疫的鸡进行饲养，等30只 鸡长到4周龄时将它们随机分为两组，每组15只鸡，其中的一组中所有的15只鸡均免疫本 发明制备的禽多杀性巴氏杆菌病脂多糖疫苗，将这一组自定义为脂多糖免疫组，该免疫组 的鸡均免疫三次，第一次免疫的时间为4周龄时，第二次免疫的时间为6周龄时，第三次免 疫的时间为8周龄时，每次免疫的剂量均为1毫升/每只鸡，免疫方式为皮下注射，另外一 组的15只鸡不进行任何免疫，只是与脂多糖免疫组的鸡在相同的条件下进行饲养，将这一 组自定义为非免疫组。2、动物攻毒实验
本实验的目的是为了检测本发明制备禽多杀性巴氏杆菌病脂多糖疫苗能否给鸡提供 抵抗禽多杀性巴氏杆菌攻击的能力，具体操作方法如下
用禽多杀性巴氏杆菌CVCC474菌株对上述脂多糖疫苗免疫组和非免疫组中的所有的 鸡都进行肌肉注射攻毒，攻毒时的剂量为1 X IO4个禽多杀性巴氏杆菌CVCC474/只鸡，攻毒 之后对脂多糖免疫组和非免疫组中的所有的鸡继续饲养2周，记录2周后两组中仍然存活 的鸡的数目，并计算出两组的保护率，保护率越高说明免疫预防效果越好，两组的保护率的 计算方法如下(攻毒2周后仍然存活的鸡的数量+15) X 100%
结果如表1所示，在攻毒2周后脂多糖免疫组的鸡仍然有10只存活，说明禽多杀性巴 氏杆菌病脂多糖疫苗的保护率为66. 7%，非免疫组的鸡在攻毒2周后已经全部死亡，说明非 免疫组的保护率为0%。上述结果表明利用本发明制备出的禽多杀性巴氏杆菌病脂多糖疫苗给鸡进行三 次免疫之后能使被免疫鸡有效地预防禽多杀性巴氏杆菌病。表1攻毒两周后仍存活的鸡的数量及保护


一种从禽多杀性巴氏杆菌提取脂多糖并制作脂多糖疫苗的方法，经过①制备禽多杀性巴氏杆菌培养液、②从禽多杀性巴氏杆菌培养液中收集禽多杀性巴氏杆菌菌体、③超声波对禽多杀性巴氏杆菌菌体进行破碎、④从超声波破碎的禽多杀性巴氏杆菌菌体中粗提脂多糖溶液、⑤从粗提的脂多糖溶液中提取脂多糖浓缩液、⑥用DNA酶和RNA酶来酶解脂多糖浓缩液中的DNA和RNA、⑦制备纯化的脂多糖和⑧将纯化的脂多糖制作成禽多杀性巴氏杆菌脂多糖疫苗共八个步骤。经动物免疫实验和动物攻毒实验，本发明制备出的禽多杀性巴氏杆菌病脂多糖疫苗给鸡进行三次免疫之后能使被免疫鸡有效地预防禽多杀性巴氏杆菌病。