专利名称：吩噻嗪类化合物在制备抑癌及辐射增敏药物中的应用的制作方法 恶性肿瘤是危害人类健康的严重疾病，目前，尚缺乏有效的防治措施，寻找有效预防治疗药物仍然是目前面临的主要任务。吩噻嗪化合物(如氯苯嗪，氟奋乃静，三氟哌拉嗪，甲氧异丁嗪)是已知有镇静、抗抑郁等作用的镇痛、抗精神病类药物。药理学研究表明，这类药物具有不同程度的拮抗钙调节蛋白、抑制蛋白激酶C和DNA依赖蛋白激酶(DNA-PKcs)活性、抑制细胞色素P450还原酶和NADPH依赖的微粒体脂质过氧化(LPO)、抑制细胞DNA合成以及诱导细胞凋亡等作用。其中，三氟哌拉嗪(TFP)可作用于Ras/MEK/Erk信号转导途径，诱导细胞早期生长反应基因(Egr-1)的表达，并可能通过此途径产生抑制细胞增殖。发明创造内容本发明的目的是提供吩噻嗪类化合物的一种新用途。本发明发明人的研究表明，吩噻嗪类化合物具有抑制肿瘤以及增强肿瘤细胞对辐射敏感性的作用。因此本发明的技术方案是吩噻嗪类化合物的抑癌及辐射增敏的药学作用。上述吩噻嗪类化合物优选为三氟哌拉嗪(TFP)。需要的时候，在以吩噻嗪类化合物为活性成分的药物中，还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等。本发明的药物可以制成注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。在上述抑癌和/或辐射增敏药物中，吩噻嗪类化合物的有效剂量为局部20μg/次，每3天1次。
本发明的药物将以其多重的药效作用(直接杀伤、辐射增敏)而广泛用于癌症的预防和/或治疗。


图1为TFP对Hela细胞存活的影响曲线图2为不同浓度TFP作用3天后BEP2D细胞和BERP35T1细胞的增殖率曲线图3为不同浓度TFP作用6天后BEP2D细胞和BERP35T1细胞的增殖率曲线图4为TFP药物对接种裸鼠肿瘤(Hela)生长的影响曲线图5为5μmol/L TFP对4Gy照射Hela细胞死亡的增强作用示意6为2μmol/L TFP对2Gy照射Hela细胞死亡的增强作用示意7为TFP阻断辐射对p38的激活作用的Western blot电泳图谱
细胞和试剂人宫颈癌Hela细胞系在含10％新生牛血清的DMEM培养液中培养。BEP2D细胞是经HPV-18永生化的正常人支气管上皮细胞，BERP35T1是辐射诱发的BEP2D癌变细胞系(在裸鼠体内成瘤，鳞状上皮癌)，两株细胞均在LHC-8无血清培养液(美国BiofluidsInc.)中于二氧化碳孵箱中、37℃培养。实验用三氟哌拉嗪(TFP)购自Sigma公司。
实施例1、TFP对体外培养细胞生长的抑制作用通过细胞克隆形成率观察TFP对Hela细胞增殖生长的影响。具体是按一定比例稀释细胞，并接种于60cm直径的培养皿中，根据药物浓度调整接种细胞数量，每剂量平行接种3皿。待细胞贴壁后加入不同浓度药物，第6天更换不含药物的新鲜生长培养液，继续培养6天，细胞固定后姬母萨染色，记数细胞克隆。实验数据为3次实验结果的平均值。
TFP对体外培养的Hela细胞存活的影响结果如图1所示，表明三氟哌拉嗪在1-2μmol/L以上浓度可杀死Hela细胞。实验观察到细胞在10μmol/L药物浓度下培养6天时还可见少量的细小克隆(少于15个细胞)，但即使更换不含TFP的新鲜的生长培养液，细胞也不再分裂增殖。在15μmol/L以上浓度下，细胞增殖已完全受到抑制。当浓度增加到50μmol/L时，只作用6小时Hela细胞就开始脱落死亡。
为了比较TFP对正常细胞和癌细胞生长影响的差异，本实施例通过MTT法观察了TFP对正常人支气管上皮细胞BEP2D和其辐射诱发的癌变细胞系BERP35T1增殖生长的影响。TFP作用3天和6天后的BEP2D细胞和BERP35T1细胞的增殖率(与对照细胞的比值×100％)分别如图2和图3所示，表明TFP对BEP2D和BERP35T1生长抑制作用存在明显的差别，在相同浓度下，TFP对癌变细胞BERP35T1的生长抑制作用比BEP2D细胞更加显著。
实施例2、TFP对裸鼠接种肿瘤生长的抑制作用每只裸鼠接种2.5×105的Hela细胞，当肿瘤的最大直径达到1cm后，给药组裸鼠开始局部注射TFP药物，对照组裸鼠肿瘤注射PBS溶液，每3天注射1次，每次20μgTFP/只或20μg PBS/只，每组4只裸鼠。每次注射前测量肿瘤最大和最小直径。每组数据为4只荷瘤裸鼠结果的平均值。
TFP药物对接种裸鼠肿瘤生长影响的结果如图4所示，表明20μg TFP/只的局部给药量可有效的抑制肿瘤生长。由于本组实验给药治疗的时间较晚，肿瘤较大(最大直径1cm)，药物不容易分散到整个肿瘤组织中，而且观察时间较短，因此肿瘤组织并未完全消退，但取出肿瘤组织做活检，可见给药组肿瘤组织有明显坏死现象。
实施例3、TFP的辐射增敏活性及相关机理Hela细胞在药物作用0-16h后用钴-60γ射线照射2Gy或4Gy，继续培养两星期后观察比较活存细胞克隆数。
为了确定TFP是否具有辐射增敏作用及规律和相关机制，本实施例首先检测了5μmol/L TFP药物作用即刻、4h和16h后分别对2Gy或4Gy照射细胞存活的影响。结果如图5所示，表明细胞存活率由单独4Gy照射的21％下降到9.5％(加药即刻照射)和5％(加药后16h照射)；表明5μmol/L TFP预先作用4-16h，能显著提高照射细胞的死亡率。图5中，C表示未经处理的对照细胞；D表示5μmol/L TFP药物单独处理细胞；R表示单独4Gy照射细胞；DOR表示加入TFP药物后立即4Gy照射细胞；D16R表示TFP作用16h后4Gy照射细胞。图6表明2μm/L TFP预处理16h能明显提高细胞的辐射敏感性；图6中，R表示单独2Gy照射组；D16hR表示2μmol/L TFP作用16h后2Gy照射组。
另外，上述结果也表明药物与辐射处理的相隔时间不同(0h-16h)所产生的效应也不一样，因此这种效应并不是两种处理简单相加，而是存在某种(些)内在的促进机制。为此，本实施例对TFP辐射增敏机制进行了探讨。p38是MAPK信号转导途径的重要分子，尽管其在辐射细胞学反应中的确切作用机理还不是很明确，但肯定是发挥了重要作用。
兔抗人磷酸化p38蛋白抗体(Anti-Active?p38pAb，pTGpY)购自Promega公司，作为Western blot的第一抗体，以山羊抗兔IgG为第二抗体。按常规方法提出Hela细胞总蛋白、定量后进行SDS-PAGE电泳、转膜和免疫杂交反应。Western blot杂交结果如图7所示，表明单独4Gy照射，MAPK信号转导分子p38很快(15min)被磷酸化激活，如果细胞预先用50μM TFP作用1h，照射后p38磷酸化激活就显著被抑制，表明TFP能阻断辐射对p38的激活作用。


本发明公开了吩噻嗪类化合物的一种新用途。研究表明，吩噻嗪类化合物具有抑制肿瘤以及增强肿瘤细胞对辐射的敏感性的作用。本发明的技术方案是吩噻嗪类化合物在制备抑癌和/或辐射增敏药物中的应用。本发明的药物将以其多重的药效作用(直接杀伤、辐射增敏)而广泛用于癌症的预防和/或治疗。