专利名称：固相多肽合成cw7213的制备方法中文名无指盘臭蛙胰岛素释放促进肽缩写CW7213等电点10.32分子量2632.3结构式:Phe-Leu-Pro-Leu-Leu-Ala-Gly-Leu-Ala-Ala-Asn(Trt)-Phe-Leu-Pro-L ys(boc)-Leu-Phe-Cys(trt)-Lys(boc)-Ile-Thr(tbu)-Arg(pbf)-Lys(boc)-Gly-OH糖尿病是以持续高血糖为基本生化特征的综合征。各种原因造成胰岛素相对或绝对缺乏以及不同程度的胰岛素抵抗，使碳水化合物、脂肪及蛋白质代谢紊乱，临床上表现为糖尿病。随着病程的延长，可出现广泛的微血管及大血管病变，导致双目失明、肾功能衰竭、 肢端坏疽、心肌梗死及脑血管病变，严重威胁患者的生命。近年来，糖尿病的患病率急剧上升，全世界糖尿病患者已由1997年的1. 3亿发展到2005年的2. 37亿，我国预计有糖尿病患者6千万。有关专家预测，2025年全球糖尿病患者可达3亿。目前，我国糖尿病的发病率已达20岁以上人群总数的3. 2%。2型糖尿病发病机制复杂，目前普遍认为胰岛素抵抗和β细胞分泌缺陷是2型糖尿病发病机制的2个主要环节。经典的抗2型糖尿病药物存在多种缺陷，不能从根本上治愈糖尿病患者。胰高血糖素样肽-I(GLP-I)受体属于G蛋白偶联胰高血糖素受体家族，广泛分布于胰腺β、δ细胞、胃小凹和小肠黏膜以及心、肺、中枢神经系统。GLP-I与GLP-I受体特异性结合后，主要通过cAMP为第二信使的信号通路发挥血糖调控作用。其主要优点一是具有血糖依赖性的肠促胰岛素分泌作用，从而避免了糖尿病药物治疗中常存在的低血糖症的危险；二是阻止胰腺β细胞退化，刺激β细胞的增值和分化，从根本上改善糖尿病病程的发展。但GLP-I在体内易被二肽基肽酶IV (DPP-IV)降解，半衰期仅aiiin左右。DPP-IV 是一种丝氨酸蛋白酶，可特异性识别GLP-I的N末端第二位丙氨酸残基，并从此处切除二肽使GLP-I失活。针对内源性GLP-I的优点和不足，人们从GLP-I受体激动剂和DPP- IV抑制剂两个方面进行新药设计。这类药物将以其独特的降糖活性，在2型糖尿病的治疗中发挥重要的作用。CW7213是胰高血糖素样肽_1 (GLP-I)类似物，具有多种生理功能能够降低患者体重，更平稳地控制血糖水平，不会产生低血糖。此外，GLP-I类似物还能维持、并且改善II 型糖尿病患者的基础和葡萄糖刺激后的β细胞功能，延缓疾病进程。由于这些无可比拟的治疗优点，CW7213有非常广阔的市场前景。传统的多肽合成方法多为液相合成法或固相boc策略合成法，由于工艺三废较严重，使用剧毒的氟化氢，接肽效率低，反应时间较长，工艺复杂，产品收率较低，不具备大规模生产的能力，而CW7213的制备工艺尚未见报导。
本发明需要解决的技术问题是公开一种固相多肽合成CW7213的制备方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。本发明的方法包括如下步骤以Fmoc-Gly-WANG树脂为起始原料，按照固相合成的方法依次以Fmoc保护的氨基酸为单体，以HBTU/HoBT为缩合剂，以DIPEA为催化剂，在砂芯漏斗中通入氮气逐个接上氨基酸，获得保护的二十四肽树脂，其间依次脱去Fmoc保护基团，同步进行脱侧链保护基团和切肽，加入乙醚沉淀，获得CW7213的粗品，并经C18柱进行分离纯化，再经冷冻干燥，获得产品(包括醋酸盐、三氟乙酸盐等医学上可用的盐)。按照本发明优选的方案，依次连接具有Fmoc保护的氨基酸，获得保护的二十四肽树脂，依次包括如下步骤(1)将Fmoc-Gly-WANG树脂用DMF浸泡60分钟，使树脂溶胀，树脂的载量为 0.48mmol/g；(2)在上述树脂中，加入脱保护试剂，进行脱保护反应，然后树脂用DMF洗涤，抽干，加入用DMF溶解的具有Fmoc保护基团的氨基酸和HBTU/HoBT的混合物以及DIPEA，进行接肽反应，抽干，用DMF洗涤六次，然后再加入脱保护试剂，进行脱保护反应，再加入用DMF 溶解的具有Fmoc保护的氨基酸，如此重复，最后一个氨基酸脱保护后用DMF洗涤四次、二氯甲烷洗涤两次、甲醇洗涤两次，获得Fmoc-Phe-Leu-Pro-Leu-Leu-Ala-Gly-Leu-Ala-Ala-A sn(Trt)-Phe-Leu-Pro-Lys(boc)-Leu-Phe-Cys(trt)-Lys(boc)-Ile-Thr(tbu)-Arg(pbf)-Lys (boc)-Gly-树脂；所说的具有Fmoc基团的氨基酸，依次为(I)Fmoc-Lys (boc)-0H、(2) Fmoc-Arg (pbf) -0H> (3) Fmoc-Thr (tbu)-0H、(4) Fmoc-Ile-OH、 (5)Fmoc-Lys(boc)-OH、 (6)Fmoc-Cys(trt)-OH、 (7)Fmoc-Phe-OH、 (8) Fmoc-Leu-OH、 (9)Fmoc-Lys(boc)-OH、 (10)Fmoc-Pro-OH、 (11)Fmoc-Leu-OH、 (12) Fmoc-Phe-OH、(13)Fmoc-Asn(trt)-OH, (14)Fmoc-Ala-OH、(15)Fmoc-Ala-OH、(16) Fmoc-Leu-OH、 (17)Fmoc-Gly-OH、 (18)Fmoc-Ala-OH、 (19)Fmoc-Leu-OH、 (20)Fmoc-Leu-0H> (21)Fmoc-Pro-OH、 (22)Fmoc-Leu-OH、 (23)Fmoc-Phe-OH0所说的脱保护试剂的组分和体积比为PIP DMF=I 4;具有Fmoc保护基团的氨基酸的摩尔数为树脂载量的3倍；HBTU/HoBT的摩尔数为树脂载量的3倍；DIPEA的摩尔数为树脂载量的7倍；脱保护反应温度为10_30°C，反应时间为20分钟；接肽反应温度为10_30°C，反应时间为1-2小时。同步进行脱侧链保护基团和切肽，获得CW7213的粗品包括如下步骤将配制好的切割试剂，加入步骤(2)中最后脱去保护的二十四肽树脂中，10-30°C 切肽反应2小时，漏斗过滤后得滤液，加入冰乙醚沉淀静置30分钟，抽滤得到多肽沉淀物， 室温置于干燥器中，减压干燥10-14小时，获得CW7213粗品。所说的切割试剂为TFA/EDT/H20/TIS = 9. 5 0. 2 0. 2 0. 1，体积比；优选的，CW7213粗品经C18柱进行分离纯化包括如下步骤将CW7213粗品溶于水溶液中，过滤，滤液经C18柱进行分离纯化，流动相为A 10%甲醇+90%水+0. 1 % TFA, B 90%甲醇+10%水+0. TFA，体积比；流速为anl/min ；检测波长为:214nm ；用制备型高效液相色谱跟踪收集所需要的流出液，样品峰合并后旋蒸并冷冻干燥，获得目标产物(MW 2632. 3)，切肽后的收率为72%，分离纯化后总产率约为21%。由上述公开的技术方案可见，本发明的方法采用Fmoc-Gly-WANG树脂为起始原料，按照固相合成的方法依次以Fmoc保护的氨基酸为单体，以HBTU/HoBT为缩合剂，以 DIPEA为催化剂，在砂芯漏斗中通入氮气逐个接上氨基酸。每步接肽收率大于98%，采用 TFA/EDT/H20/TIS为切割试剂切割粗肽，经乙醚沉淀获得产品的方法，避免使用氟化氢等剧毒试剂，污染少，且收率提高。具备规模化生产能力，工艺稳定，原辅料来源方便，生产周期短。切肽后的收率为74. 8%，分离纯化后总产率约为21. 3%。本发明提供了一种固相多肽合成CW7213的制备方法，包括如下步骤以Fmoc-Gly-WANG树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，以HBTU/HoBT为缩合剂，在砂芯漏斗中通入氮气逐个接上氨基酸，获得保护的二十四肽树脂，其间依次脱去Fmoc保护基团，同步进行脱侧链保护基团和切肽，加入乙醚沉淀，获得CW7213的粗品，并经C18柱进行分离纯化，再经冷冻干燥，获得产品(包括醋酸盐、三氟乙酸盐等医学上可用的盐)。本发明的方法工艺稳定成熟，原辅料来源方便，接肽收率高，避免使用氟化氢等剧毒试剂，污染较少，便于工业化实施。