专利名称：检测乙醛脱氢酶2基因多态性的试剂盒及其扩增方法和检测方法人类ALDH2基因位于12号染色体，包含13个外显子，其12号外显子1510位的鸟嘌岭(G)突变为腺嘌呤(A)时，导致该基因编码蛋白487位的谷氨酸(Glu)替换为赖氯酸(Lys)，即Glu487Lys (rs671)。该突变可引起ALDH2酶活性的明显下降，削弱ALDH2的生物学功能。多项研究表明乙醛脱氢酶酶2活性降低对硝酸甘油疗效降低，酒精代谢解毒能力降低和多种疾病的发生均有影响。舌下含服硝酸甘油片是抗冠心病心绞痛急性发作的常规首选方法，但概要的临床有效性因人而异，有些患者服用后并无疗效，中国汉族人群中，含服硝酸甘油无效的比例高达25%以上，远高于欧美人群。乙醛脱氢酶2是硝酸甘油的有效代谢物一氧化氮形成的关键，如果病人携带有ALDH2的rs671携带突变型，就会影响其产物酯酶的活性，使硝酸甘油在体内的生物转化过程受阻，致一氧化氮减少甚至无法产生一氧化氮，也就难以有效发挥作用，值得注意的是，在亚洲人群中，30% -50%的人都携有rs671基因突变，远远高于欧美人群。各种酒类都含有乙醇，进入体内后经乙醇脱氢酶代谢形成乙醛，再经乙醛脱氢酶氧化形成乙酸，最终氧化为水和二氧化碳。乙醛具有强烈的毒理作用，可刺激肾上腺素、去甲肾上腺素等物质的分泌，引起面红耳赤、心率快、皮温高等症状。如果人饮酒后产生乙醛速度快，而氧化为乙酸的速度慢，则易产生乙醛蓄积中毒。当ALDH活性降低时，未被氧化的乙醛进入血内，通过黄嘌呤氧化酶转变为超氧化物，进而导致膜脂质过氧化，破坏细胞膜，最终促进肝损伤。ALDH2还是体内重要的氧化应激分子，ALDH2野生型能够减少体内的氧化应激，减缓动脉粥样硬化进展，增加斑块的稳定性，减少心肌梗死。乙醛导致DNA复制异常和修复能力降低，使得DNA发生点突变，从而诱导姐妹染色单体交换和染色体异常，有很多流行病学研究已经证实，携带ALDH2突变等位基因的亚洲人因酗酒引发消化道癌症的几率明显较大:胃癌、结肠癌、肺癌为3 10倍；咽癌、食道癌为11 一 15倍；而食道癌、咽癌和肺癌同时发病的几率增加了 50倍。
人乙醛脱氢酶2基因遗传多态性直接或间接影响患者服用硝酸甘油的有效性和多种疾病的发生。本发明提供一种利用单管双向等位基因特异性扩增技术结合分子开关技术检测乙醛脱氢酶2基因多态性的试剂盒及其扩增方法和检测方法。本发明采用的技术方案:一种检测乙醛脱氢酶2基因多态性的试剂盒，所述试剂盒在一个PCR反应中对ALDH2基因上rs671 SNP位点进行分型。所述试剂盒包括检测ALDH2基因rs671 SNP位点的外侧双向引物和2条双向序列特异性引物。所述检测ALDH2基因rs671 SNP的引物碱基序列如下所示:外侧正向引物:GGGTCCTGGGAGTGTAACCCATAACCC外侧反向引物:TGGGTCTTTACCCTCTCTTGTCACTTCTC突变型引物:ACGGGCTGCAGGCATACACTA野生型引物:GTCCCACACTCACAGITITCACTTC所述的检测乙醛脱氢酶2基因多态性的试剂盒所采用的检测方法:对受检样本DNA用扩增缓冲液进行扩增，扩增后经凝胶电泳在紫外光下见到根据片段大小区分开的产物条带，扩增片段由大到小依次是:内对照480bp，突变型产物333bp和野生型产物190bp ；根据条带的有无判断SNP位点的基因型。所述的检测乙醛脱氢酶2基因多态性的试剂盒的扩增方法，包括以下步骤:预变性由I次循环构成,其条件为:温度为94°C，时间为5分钟；PCR扩增由30次循环构成，其条件为:变性:温度为94°C， 时间为30秒；退火:温度为56°C，时间为30秒；延伸:温度为72°C，时间为90秒；扩增结束后于4°C保存至电泳检测。本发明与现有技术相比具有下列优点和效果:(I)本发明采用单管双向等位基因特异性扩增技术，在一次PCR反应中即可判断SNP位点的基因型，提高检测效率降低检测成本。(2)本发明采用SNP敏感性分子开关技术，使3’端不能与模板互补的引物所引发的扩增非成熟性终止，无法形成产物，避免假阳性结果的产生。(3)引入内参，为阴性结果的判读提供依据，避免假阴性结果的产生。(4)本发明扩增后只需通过DNA凝胶电泳及凝胶成像系统即可完成检测，不需添置贵重设备，快速，准确，灵敏，特异，重复性好，大幅降低了检测成本和操作复杂程度，适合临床和科研使用。(5)无需DNA提取，只需裂解全血细胞，将细胞裂解后的悬液加入反应体系即可完成扩增，免去DNA提取的步骤和成本并避免气溶胶污染。(6)本发明的试剂盒，提供2X扩增缓冲液，使用者只需加入全血裂解悬液和聚合酶即可进行扩增，减少了操作步骤，提高劳动速率，可以实现高效率检测。(7)本发明的试剂盒所提供的2X扩增缓冲液，加入了扩增指示染料和高分子沉降剂，扩增后即可直接进行凝胶电泳，无需加入loading buffer，避免人为错误。
本发明公开了一种利用单管双向等位基因特异性扩增技术结合SNP敏感性分子开关技术检测乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因多态性检测试剂盒及其扩增方法和检测方法。所述试剂盒对乙醛脱氢酶2上Glu487Lys(rs671)位点进行分型。所述试剂盒包含扩增缓冲液、聚合酶、细胞裂解液和甘油，可在一个PCR反应中完成对上述SNP位点的分型，从而了解受试者乙醛脱氢酶2的基因型和其产物活性。