专利名称：聚乙二醇化的l-天冬酰胺酶的制作方法聚乙二醇化的L-天冬酰胺酶发明背景发明领域本发明涉及具有实质性的L-天冬酰胺氨基水解酶活性的蛋白质与聚乙二醇的缀合物，特别是其中所述聚乙二醇具有低于或等于约5000Da的分子量，特别涉及其中所述蛋白质是来自欧文氏菌(Erwinia)的L-天冬酰胺酶的缀合物，以及其在治疗中的用途。具有L-天冬酰胺氨基水解酶活性的蛋白(通常被称作L-天冬酰胺酶)已经多年被成功地用于治疗儿童中的急性淋巴细胞白血病(ALL)。ALL是最常见的儿童恶性肿瘤 (Avramis and Panosyan, Clin. Pharmacokinet. (2005)44:367—393)。L-天冬酰胺酶还被用于治疗何杰金氏病，急性骨髓白血病，急性骨髓单核细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病，淋巴肉瘤，网状细胞肉瘤和黑素肉瘤(Kotzia and Labrou, J.Biotechnol. 127(2007)657-669)。L-天冬酰胺酶的抗肿瘤活性被相信是由于某些恶性细胞不能合成L-天冬酰胺或降低了合成L-天冬酰胺的能力(Kotzia and Labrou, J. Biotechnol. 127 (2007) 657-669)。这些恶性细胞依赖于L-天冬酰胺的细胞外供给。然而，L-天冬酰胺酶催化L-天冬酰胺水解为天冬胺酸和氨，从而耗尽循环的L-天冬酰胺库并杀死肿瘤细胞，所述肿瘤细胞在没有L-天冬酰胺时不能进行蛋白质合成(Kotzia and Labrou, J.Biotechnol. 127(2007)657—669)。来自大肠杆菌的L-天冬酰胺酶是用于ALL治疗的第一种酶药物并且在美国已作为Elspar 上市，或者在欧洲作为Kidrolase 和L-天冬酰胺酶Medac 上市。也从其它的微生物中分离了 L-天冬酰胺酶，例如，来自菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi) 的L-天冬酰胺酶蛋白，被命名为克立他酶(crisantaspase)，其作为Erwinase 上市 (ffriston Jr. , J. C. (1985) “ L-asparaGlnase “ Meth.Enzymol. 113,608-618 ；Goward, C. R.等人· (1992) “ Rapid large scale preparation of recombinant Erwinia chrysanthemi L-asparaGlnase " , Bioseparation 2，335_341)。 另1」了: 自 ggl^i 氏菌菌种的L-天冬酰胺酶，包括例如菊欧文氏菌3937 (Genbank登录号AAS67(^8)，菊欧文氏菌 NCPPB 1125 (Genbank 登录号 CAA31239)，胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora) (Genbank登录号AAP92666)和胡萝卜软腐欧文氏菌马铃薯黑胫亚种(Erwinia carotovora subsp. Astros印tica) (Genbank登录号AAS67027)。这些菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶彼此间具有大约91% -98%的氨基酸序列同一性，而胡萝卜软腐欧文氏菌L-天冬酰胺酶与菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶具有大约75%-77%的氨基酸序列同一性(Kotzia and Labrou, J.Biotechnol. 127(2007)657-669)。细菌来源的L-天冬酰胺酶具有高免疫原和抗原潜力并且经常引起不良反应，所述不良反应的范围从轻度过敏反应到敏化患者中的过敏性休克(Wang，B.等人.(2003) “ Evaluation of immunologic cross reaction of anti—asparaGlnaseantibodies in acute lymphoblastic leukemia (ALL and lymphoma patients), Leukemia 17,1583-1588)。大肠杆菌L-天冬酰胺酶是特别有免疫原性的，据报道在i. v.或i. m.施用之后，存在抗大肠杆菌L-天冬酰胺酶的抗天冬酰胺酶抗体在成年人中高达78% ；在儿童中为 70% (Wang, B.等人· (2003)Leukemia 17,1583-1588)。来自大肠杆菌和菊欧文氏菌的L-天冬酰胺酶在其药代动力学性质方面不同并且分别具有不同的免疫原性特征谱(Klug Albertsen, B.等人.OOOl) ‘‘ Comparison of intramuscular therapy with Erwinia asparaGlnase and asparaGlnase Medac pharmacokinetics, pharmacodynamics, formation of antibodies and influence on thecoagulation system " Brit. J. Haematol. 115,983—990)。此夕卜，己显示了在用来自大肠杆菌的L-天冬酰胺酶处理后产生的抗体不与来自欧文氏菌的L-天冬酰胺酶交叉反应(Wang，B.等人·，Leukemia 17^003) 1583-1588)。因此，来自(菊)欧文氏菌的L-天冬酰胺酶在对大肠杆菌L-天冬酰胺酶有反应的患者中，被用作ALL的二线治疗(Duval, Μ·等人· (2002) “ Comparison of Escherichia coli-asparaGlnase with Erwinia-asparaGlnase in the treatment of childhood lymphoid malignancies results of a randomized European Organisation for Research and Treatment of Cancer, Childrenr s Leukemia Group phase 3 trial" Blood 15,2734-2739 ；Avramis and Panosyan, Clin.Pharmacokinet. (2005)44 :367-393)。在另一个为了减少与施用微生物的L-天冬酰胺酶相关的免疫原性的尝试中，产生了经甲氧基-聚乙二醇(mPEG)修饰的大肠杆菌L-天冬酰胺酶。此方法通常被称作"聚乙二醇化"并已经显示出改变蛋白质的免疫原性性质(Abuchowski，A.等人.(1977)“ Alteration of Immunological Properties of Bovine Serum Albumin by Covalent Attachment of Polyethylene Glycol, “ J.Biol.Chem. 252(11),3578-3581) 这种所谓的mPEG-L-天冬酰胺酶，或培门冬酶(pegaspargase)作为OncaSpar (Enzon Inc.，USA)上市，并于1994年首先在美国被批准作为ALL的二线治疗，并从2006年起被批准作为儿童和成人的all的一线疗法。Oncaspar 具有延长的体内半衰期和降低的免疫原性/抗原性。Oncaspar 是大肠杆菌L-天冬酰胺酶，使用5kDa的mPEG-琥珀酰亚胺琥珀酸酯(SS-PEG)对其在多个赖氨酸残基处进行了修饰(美国专利号4，179，337)。SS-PEG是第一代的PEG试剂，其含有对酶的水解敏感的、或者在微碱性PH值时不稳定的酯键(美国专利号4，670，417 ；Makromol. Chem. 1986，187，1131-1144)。这些性质降低了体外和体内的稳定性并且可损害药物安全性。此外，已显示了所产生的抗大肠杆菌L-天冬酰胺酶的抗体将与Oncaspar 交叉反应((Wang, B.等人· (2003) “ Evaluation of immunologic cross-reaction of anti-asparaGlnase antibodies in acute lymphoblastic leukemia(ALL and lymphoma patients), " Leukemia 17,1583-1588)。虽然这些抗体不是中和性的，但是这一发现清楚地表明了在体内的交叉超敏性或交叉失活的高可能性。的确，在一个报导中，30% -41%的接受了培门冬酶的儿童具有过敏反应(Wang, B.等人· (2003)Leukemia 17，1583-1588)。除了外在的过敏反应之外，最近报导了 “沉默超敏性”的问题，其中患者产生抗天冬酰胺酶抗体，但不显示出任何超敏反应的临床迹象(Wang，B.等人.Q003)Leukemia 17，1583-1588)。这种反应可引起形成抗大肠杆菌L-天冬酰胺酶和培门冬酶的中和抗体；然而，这些患者不被转向欧文氏菌L-天冬酰胺酶，因为没有外在的超敏迹象，因此，他们接受较短时期的有效治疗(Holcenberg，J.，J. Pediatr. Hemato 1. Oncol. 26(2004)273-274)。菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶治疗通常被用于对源自大肠杆菌的L-天冬酰胺酶超敏的情形中。然而，观察到了多至30% -50%接受欧文氏菌L-天冬酰胺酶的患者是抗体阳性的(Avramis and Panosyan, Clin. Pharmacokinet. (2005)44:367—393)。此夕卜，由于菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶比大肠杆菌L-天冬酰胺酶具有显著更短的清除半衰期，其必须 ^S^^i&Mffl (Avramis and Panosyan, Clin. Pharmacokinet. (2005)44:367—393)。 $ Avramis等人的研究中，欧文氏菌天冬酰胺酶与差的药代动力学特征谱相关联(Avramis等人.，J. Pediatr. Hemato 1. Oncol. 29 (2007) 239-247)。因此，相对于欧文氏菌 L-天冬酰胺酶，大肠杆菌L-天冬酰胺酶和培门冬酶是优选的ALL的一线疗法。许多生物制药品成功地被聚乙二醇化并上市了许多年。为了将PEG与蛋白质偶联，PEG必须在其OH端被活化。基于将被聚乙二醇化的蛋白质上可获得的反应基团来选择活化基团。在蛋白质的情形中，最重要的氨基酸是赖氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、天冬氨酸， C-末端羧酸和N-末端氨基。鉴于蛋白质中广泛的反应基团，几乎整个肽化学均被应用于活化PEG部分。这种活化的PEG试剂的实例是活化的碳酸酯，例如，对硝基苯基碳酸酯、 琥珀酰亚胺碳酸酯；活性酯，例如，琥珀酰亚胺酯；对于位点特异性偶联开发了醛和马来酰亚胺(Harris, Μ.，Adv. Drug Del. Rev. 54 (2002), 459-476)。用于 PEG 修饰的各种化学方法的可得性显示出对于聚乙二醇化蛋白的每种新开发都将是个案研究。除了化学过程之外，附着于蛋白的PEG的分子量对于聚乙二醇化的蛋白的药学性质也有强大的影响。在多数情况中，预期PEG的分子量越高，药学性质的改进越好(Sherman，Μ. R.，Adv. Drug Del. Rev. 60(2008),59-68 ；Holtsberg, F. W. , Journal of Controlled Release 80(2002)， 259-271)。例如，Holtsberg等人发现当PEG与精氨酸脱氨酶(分离自微生物来源的另一个氨基酸降解酶)缀合时，当PEG附着物的大小从分子量为5000Da增加到20，OOODa时， 酶的药代动力学和药效功能增加了(Holtsberg，F. W.，Journal ofControlled Release 80(2002) ,259-271)。然而，在许多情形中，与未修饰的的生物制药品相比，聚乙二醇化的生物制药品显示出显著减少的活性(Fishburn，C. S. (2008)Review" The Pharmacology of PEGylation Balancing PD with PK to Generate Novel Therapeutics" J. Pharm. Sci. , 1-17)。在来自胡萝卜软腐欧文氏菌的L-天冬酰胺酶的情形中，观察到了聚乙二醇化使其体外活性降低至大约57% (Kuchumova,A. V.等人· (2007) “ Modification of Recombinant asparaGlnase from Erwinia carotovora with Polyethylene Glycol 5000" Biochemistry(Moscow) Supplement Series B biomedical Chemistry, 1，230-232)。来自胡萝卜软腐欧文氏菌的 L-天冬酰胺酶与菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶(克立他酶)仅具有大约75%的同源性。对于 Oncaspar ,也已知与未修饰的大肠杆菌L-天冬酰胺酶相比，其体外活性为大约50%。目前可得的L-天冬酰胺酶制备物不提供这样的备选或互补疗法-特别是治疗ALL 的疗法其特征在于高的催化活性和显著改进的药理学和药代动力学特性，以及降低的免疫原性。发明简述本发明涉及具有实质性的L-天冬酰胺氨基水解酶活性的蛋白与聚乙二醇的缀合物，其中聚乙二醇具有的分子量小于或等于大约5000Da，特别涉及其中所述蛋白质是来自欧文氏菌的L-天冬酰胺酶的缀合物。在一个实施方式中，所述缀合物包含来自欧文氏菌的 L-天冬酰胺酶和聚乙二醇(PEG)，所述L-天冬酰胺酶与SEQ ID NO :1的氨基酸具有至少 80%的同一性，其中PEG具有的分子量小于或等于大约5000Da。在一个实施方式中，L-天冬酰胺酶与SEQ ID N0:1的氨基酸具有至少大约80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%， 95%，96%，97%，98%，99%或100%的同一性。在一些实施方式中，PEG具有的分子量为大约5000Da，4000Da，3000Da，2500Da或2000Da。在一个实施方式中，与未与PEG缀合时的L-天冬酰胺酶相比，所述缀合物的体外活性为至少60 %，65 %，70 %，75 %，76 %，77 %， 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 % , 93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或100%。在另一个实施方式中，与未与PEG缀合时的L-天冬酰胺酶相比，所述缀合物具有的L-天冬酰胺消耗活性为至少约10，20，30，40，50， 60，70，80，90或100倍更有效。在另一个实施方式中，所述缀合物将血浆L-天冬酰胺水平消耗至检测不到的水平持续至少约12，24，48，96，108或120小时。在一个实施方式中，与未与PEG缀合时的L-天冬酰胺酶相比，所述缀合物具有更长的体内循环半衰期。在具体的实施方式中，所述缀合物比以同等的蛋白剂量(例如以 yg/kg测量的)施用的培门冬酶(即PEG缀合的、来自大肠杆菌的L-天冬酰胺酶)具有更长的t1/2。在更具体的实施方式中，在于小鼠中i ν施用之后，在剂量约50yg/kg(基于蛋白质含量)时，所述缀合物具有至少约58至约65小时的t1/2，并且在剂量约10 μ g/kg (基于蛋白质含量)时，所述缀合物具有至少约34至约40小时的t1/2。在另一个中，在大约10，000至大约15，000IU/m2 (约20_30mg蛋白/m2)的剂量范围内，所述缀合物具有至少约100至约200小时的t1/2。在一个实施方式中，与未和PEG缀合时的L-天冬酰胺酶相比，所述缀合物具有更大的曲线下面积(AUC)。在具体的实施方式中，在相等的蛋白剂量，所述缀合物具有的平均AUC比培门冬酶大至少约3倍。在一个实施方式中，PEG与L-天冬酰胺酶的一个或多个氨基共价连接(其中" 氨基"包括赖氨酸残基和/或N-末端)。在更具体的实施方式中，PEG通过酰胺键与一个或多个氨基共价连接。在另一个具体的实施方式中，PEG共价连接于至少大约40%至大约 100%可用的氨基(例如，赖氨酸残基和/或蛋白的N-末端)或者至少约40%至约90%的总氨基(例如，赖氨酸残基和/或蛋白的N-末端)。在一个实施方式中，缀合物具有下式Asp-[NH-C0-(CH2)x-CO-NH-PEG]η其中Asp是L-天冬酰胺酶；NH是Asp的赖氨酸残基和/或N-末端的一个或多个 NH基团；PEG是聚乙二醇部分；η是个数字，其代表Asp中至少约40%至约100%的可用的氨基(例如赖氨酸残基和/或N-末端)，而χ是大约1至大约8、更特别地，大约2至大约 5的整数。在具体的实施方式中，PEG为单甲氧基聚乙二醇(mPEG)。另一方面，本发明涉及制造缀合物的方法，其包括在经缓冲的溶液中使一定量的 PEG与一定量的L-天冬酰胺酶相结合足以使PEG共价连接至L-天冬酰胺酶的一段时间。另一方面，本发明涉及药物组合物，其包含本发明的缀合物。另一方面，本发明涉及治疗疾病的方法，所述疾病可由消耗患者中的L-天冬酰胺而治疗，所述方法包括施用有效量的本发明的缀合物。在一个实施方式中，所述疾病为癌症。在具体的实施方式中，所述癌症为ALL。在另一个具体的实施方式中，以大约5U/kg体重至大约50U/kg体重的量施用所述缀合物。在另一个中，所施用的缀合物的剂量范围为约10，000至约15，000 IU/m2 (大约20_30mg蛋白/m2)。在一些实施方式中， 所述施用可以是静脉内的或肌肉内的并且可以是少于每周一次(例如，每月一次或隔周一次)，每周一次，每周2次，或每周3次。在其它的中，所述缀合物作为单一疗法被施用，且更特别地，不含天冬酰胺合成酶抑制剂。在其它的实施方式中，所述缀合物作为组合疗法的一部分被施用(但是在一些实施方式中，所述组合疗法不包括天冬酰胺合成酶抑制剂)。在具体的实施方式中，接受治疗的患者对于大肠杆菌天冬酰胺酶或其聚乙二醇化的形式或者对于欧文氏菌天冬酰胺酶具有既往的超敏性。在另一个中，接受治疗的患者具有疾病复发，特别是在用大肠杆菌天冬酰胺酶或其聚乙二醇化的形式治疗后的复发。
图1 纯化的重组菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。在 SDS-PAGE上分析纯化的重组的菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶(r-克立他酶)。用硝酸银对蛋白质条带进行染色。道1 分子量标记物(116,66. 2，45，35，25，18. 4和14. 4kDa)，道2 纯化的重组菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶(r-克立他酶)。图2 :mPEG-r-克立他酶缀合物的SDS-PAGE分析。图3 单一静脉内剂量的Erwinase (5U/kg，25U/kg，125U/kg和 250U/kg体重) 之后，血浆L-天冬酰胺的水平。图4 在小鼠中单一的静脉内注射mPEG-r-克立他酶缀合物后，与Erwinase 相比的血浆L-天冬酰胺水平。数字〃 40%〃和〃 100%〃分别表示大约40%-55% (部分聚乙二醇化的)和大约100% (最大程度聚乙二醇化的)可用的氨基的聚乙二醇化的大概程度。图5 在小鼠中单一的静脉内注射mPEG-r-克立他酶缀合物后，从L-天冬酰胺酶特征谱计算出的曲线下面积(AUC)(残余酶活性)。图6 在小鼠中单一静脉内剂量的下列之后的血浆L-天冬酰胺水平2kDa-100% mPEG-r-克立他酶(5U/kg, 25U/kg 和 50U/kg 体重)(图 6A)，5kDa_100 % mPEG-r-克立他酶(5U/kg, 25U/kg 和 50U/kg 体重)(图 6B)或 2kDa_100 % mPEG-r-克立他酶(5U/ kg)，5kDa-100 % mPEG-r-克立他酶(5U/kg)和培门冬酶(OncaSpar ) (lU/kg)(图 6C)。施用等量的蛋白(10yg/kg)在72小时中产生相似的L-天冬酰胺消耗，所述蛋白为 2kDa-100% mPEG-r-克立他酶(5U/kg)，5kDa-100% mPEG-r-克立他酶(5U/kg)，或培门冬酶(Oncaspar , ιυ/kg)。图7 :2kDa_100%聚乙二醇化的r_克立他酶与5kDa_100%聚乙二醇化的r_克立他酶相比的剂量-效应关系。图7A显示以5U/kg (基于蛋白质含量为10 μ g/kg)，25U/kg 和50U/kg时，单一静脉内剂量的2kDa-100%聚乙二醇化r-克立他酶之后，血浆中的残余酶活性。图7B显示以5U/kg(基于蛋白质含量为1(^8/1^)，25~1^和5(^/1^时，单一静脉内剂量的5kDa-100%聚乙二醇化的r-克立他酶之后，血浆中的残余酶活性。图8 :2kDa-100 %聚乙二醇化的r_克立他酶相比于5kDa_100 %聚乙二醇化的r-克立他酶的剂量-效应关系。单一静脉内剂量的2kDa-100%或5kDa_100% mPEG-缀合物后，在小鼠中测量的残余酶活性的AUC。总的来说，当在相同的剂量水平进行比较时，对于 5kDa-100% mPEG-r-克立他酶测量的AUC高于对于2-kDa_100% mPEG-r-克立他酶所观察到的。在5，25和50U/kg剂量时，分别观察到了 31%,37%^P 14%的差别。图9 小鼠中，mPEG-r-克立他酶缀合物相对于培门冬酶(Oncaspar )的药代动力学。图9A代表单一静脉内剂量的2kDa-100% mPEG_r-克立他酶，5kDa_100% mPEG_r-克立他酶或培门冬酶(Oncaspar )之后，在小鼠中测量的残余酶活性。图9B代表单一静脉内剂量的2kDa-100 % mPEG-r-克立他酶，5kDa_100 % mPEG_r-克立他酶或培门冬酶 0)ncaspar )后，在小鼠中测量的残余酶活性的auc。图10 用mPEG-r-克立他酶缀合物或Erwinase 处理后，抗克立他酶特异性抗体的血清水平。抗体针对的是克立他酶。数据表示为平均值士SD(N = 8)。图11 用mPEG-r-克立他酶最大程度(100% )聚乙二醇化的缀合物处理后，抗缀合物特异性抗体的血清水平。图IlA 结果表示为平均值士SD(n = 8)；图IlB 结果表示为在抗缀合物ELISA中，具有> 0. 5的吸光度值的动物的百分率。发明详述—方面，本发明要解决的问题是提供具有下列的L-天冬酰胺酶制备物-高的体外生物活性；-稳定的PEG-蛋白质连接；-延长的体内半衰期；-显著减少的免疫原性，如下列所证明的例如重复施用后减少或去除抗L-天冬酰胺酶制备物的抗体应答；和-对于产生了对使用例如源自大肠杆菌的L-天冬酰胺酶的一线疗法的敏感性的患者，作为二线疗法的用途。已知的L-天冬酰胺酶缀合物没有解决这个问题，其具有与经修饰的L-天冬酰胺酶制备物的显著的交叉反应性(Wang，B.等人· (2003)Leukemia 17，1583-1588，在此以其全部通过引用而并入)，或具有显著降低的体外活性(Kuchumova，Α. V.等人.Q007) Biochemistry (Moscow) Supplement Series B !Biomedical Chemistry，1，230_232，在此以其全部通过引用而并入)。根据本发明，通过提供欧文氏菌L-天冬酰胺酶与亲水性聚合物 (更具体地，分子量为5000Da或更少的聚乙二醇)的缀合物、制备此类缀合物的方法和所述缀合物的用途而解决了这一问题。本文中描述的是来自欧文氏菌的聚乙二醇化的L-天冬酰胺酶，与未修饰的L-天冬酰胺酶蛋白以及来自大肠杆菌的培门冬酶制备物相比，其具有改进的药理学特性。本文中描述的聚乙二醇化的L-天冬酰胺酶缀合物(例如被分子量为5000Da的PEG聚乙二醇化的菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶)作为治疗剂，特别用于对用来自大肠杆菌的L-天冬酰胺酶或聚乙二醇化的L-天冬酰胺酶，或者来自欧文氏菌的未修饰的L-天冬酰胺酶进行的治疗显示出超敏(例如过敏反应或沉默超敏性)的患者。本文中所描述的聚乙二醇化的L-天冬酰胺酶缀合物也可用作治疗剂而用于具有疾病复发(例如ALL的复发)且以前用另一种形式的天冬酰胺酶(例如用来自大肠杆菌的L-天冬酰胺酶或聚乙二醇化的L-天冬酰胺酶) 治疗过的患者中。
如本文中所详述的，与已知的L-天冬酰胺酶(例如培门冬酶)制备物相比，本发明的缀合物显示出出人意料的优越特性。例如，与来自大肠杆菌的未修饰的L-天冬酰胺酶相比，来自菊欧文氏菌的未修饰的L-天冬酰胺酶(克立他酶)具有显著更低的半衰期 (Avramis and Panosyan, Clin. Pharmacokinet. Q005)44 :367_393，在此以其全部通过引用而并入)。以相等的蛋白质剂量，本发明的聚乙二醇化的缀合物具有的半衰期大于来自大肠杆菌的聚乙二醇化的L-天冬酰胺酶。定义除非另外明确地定义，本文中所使用的术语将根据它们在本领域中的通常含义来理解。如本文中所使用的，术语"包括"指"包括但不限于"，并且以单数形式使用的术语应当包括复数，反之亦然，除非上下文另有指示。如本文中所使用的，术语“可通过消耗天冬酰胺而治疗的疾病”是指这样的病况或病症，其中参与或促成所述病况或病症的细胞缺乏合成L-天冬酰胺的能力或具有降低的合成L-天冬酰胺的能力。L-天冬酰胺的消耗或丧失可以是部分的或基本上完全的(例如， 达到使用本领域已知的方法和设备不可检测到的水平)。如本文中所使用的，术语"治疗有效量"是指产生所希望的治疗效果所需要的蛋白(例如天冬酰胺酶或其缀合物)的量。L-天冬酰胺酶蛋白根据本发明的蛋白是具有L-天冬酰胺氨基水解酶活性的酶，即L-天冬酰胺酶。在本领域中已鉴别了许多L-天冬酰胺酶蛋白，其是通过已知的方法从微生物中分离的(见例如 Savitri and Azmi, Indian J. Biotechnol 2 Q003) 184-194，在此以其全部通过引用而并入)。最广泛使用且商业上可得的L-天冬酰胺酶是源自大肠杆菌或菊欧文氏菌的，二者共享50%或更少的结构同源性。在欧文氏菌的种中，源自菊欧文氏菌与胡萝卜软腐欧文氏菌的酶之间被报道通常有75% -77%的序列同一性，且在菊欧文氏菌的不同亚种之间发现有大约90%的序列同一性(Kotzia GA，Labrou E，Journal of Biotechnology (2007) 127 :657_669，在此以其全部通过引用而并入)。一些代表性的欧文氏菌L-天冬酰胺酶包括，例如表1中所提供的那些表

公开了具有实质上的L-天冬酰胺氨基水解酶活性的蛋白与聚乙二醇的缀合物。特别地，聚乙二醇具有的分子量小于或等于约5000Da并且所述蛋白为来自欧文氏菌的L-天冬酰胺酶。本发明的缀合物显示了优越的特性，例如维持高水平的体外活性和出人意料的体内半衰期的增加。还公开了生产所述缀合物的方法和所述缀合物在治疗中的用途。特别地，公开了使用所述缀合物治疗癌症的方法，特别是急性淋巴细胞白血病(ALL)。更特别地，公开了使用所述缀合物作为二线疗法而用于下列患者的方法所述患者在用其它L-天冬酰胺酶制备物治疗后产生了超敏性或具有疾病复发。