专利名称：一种明胶酶a抑制性多肽的修饰物及其制备方法局部侵袭和远处转移是恶性肿瘤的主要生物学特征，也是导致肿瘤患者较高死亡率的主要原因。目前的研究认为在肿瘤的侵袭、转移过程中，细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的破坏是关键环节。在参与破坏细胞外基质的酶类中基质金属蛋白酶类 (matrix metalloproteinases, MMPs)是最重要的蛋白水解酶，尤其是MMP2、MMP9在癌细胞侵袭转移过程中不仅可以酶解细胞间基质成分，还能酶解基底膜的主要成分IV型胶原。 所以设计寻找针对MMPs拮抗药物就尤为重要。目前已有人工合成的MMPs抑制物，如 Marimastat、Batimastat、Mtastat、BAY12-9566、AG-3340、CGS-27023A 和 SC-204092 等，正在进行不同阶段临床试验。虽然这类小分子化合物可以有效抑制基质金属蛋白酶的酶解作用，但同时所产生的细胞毒作用会给试用者带来强烈的副作用。由此研究人员把目光转向了基质金属蛋白酶类的组织抑制因子(tissue inhibitors of metalloproteinases， TIMPs)家族。TIMPs的主要功能是天然地抑制MMPs的活性，在调节细胞外基质的代谢中起到了重要作用。其中TIMP-I被认为是组织中MMPs活性主要调节者，控制着大多数的MMPs 家族成员。然而TIMPs对肿瘤却是把双刃剑，一方面，通过对抗MMPs蛋白的水解作用抑制肿瘤的浸润。但肿瘤也需要对抗自身的过度水解，所以TIMPs对肿瘤生长同样是必须的。另夕卜，还对肿瘤细胞增殖、凋亡、血管形成等方面起到了关键作用，因此对肿瘤的发展具有双向性。因此寻找结合了小分子化合物和TIMPs蛋白优势的新型药物是我们的研究重点。多肽类药物具备高效、低毒和特异性强的显著性优势。M205C4是通过噬菌体展示技术筛选的特异性MMP2抑制性结合肽，拮抗作用模拟了 TIMPs对MMPs活性调节的方式，可以有效的抑制肿瘤细胞的侵袭转移并于2006年成功报批国家专利(ZL200610085779.7)。 经后期实验证明，M205C4对多种肿瘤细胞的生长及血管新生没有明显的促进作用，符合我们的新药筛选标准。但同时也存在肽类药物在体不稳定、易降解的问题，无法使药物在体发挥其特有的生物学活性。而对于药物的修饰同时要考虑到其自身空间结构改变所导致的活性变化和体内代谢行为两个重要因素以外，修饰的工艺化问题也是不容忽视的。所以修饰及其制备方法的选择对于药物的后期研究至关重要。
发明目的针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种M205C4的修饰物， 修饰后药物保留了原有生物学活性的同时，降低了免疫原性，延长了其在生物体内的半衰期。本发明的另一个目的是提供一种M205C4的修饰物的制备方法。技术方案为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为一种明胶酶A抑制性多肽的修饰物，为mPEG-sc对多肽M205C4组氨酸氨基端的单点修饰产物，结构式为 O. 11 CH3-f OCH2CH2-^O-C-HNWTRWLLHPDRGGCS ‘分子量为11000 13000 ；结构式中，CH3^OCH2CH2Ili为mPEG的结构式， HNWTRffLLHPDRGGGS为多肽M205C4的氨基酸序列。一种制备明胶酶A抑制性多肽的修饰物的方法，包括以下步骤(1)按摩尔比为1 Γ5分别称取M205C4和mPEG-SC，定溶于ρΗ5· 0-8. O的PBS缓冲液中，M205C4的反应浓度为100 uM ；在静音混合器上，4°C反应3h以上，制得M205C4-PEG混合液；
(2)采用SunfireTM C18 OBDTM 制备色谱柱(Waters 2545-2767-UV2489 制备液相系统)对步骤(1)制得的M205C4-PEG混合液进行液相分离和浓缩，制得浓缩液；对浓缩液进质谱检测，将浓缩液分装至2ml EP管中，在液氮中过夜保存；检测纯度在90%以上，分子量为 11000^13000 ；
(3)将过夜保存在液氮的制备样品放入冻干仪中浓缩至冻干粉末，即可。步骤(1)中，优选按摩尔比约为1 3分别称取M205C4和mPEG -SC,定溶于pH7. 4 的PBS缓冲液中，M205C4的浓度为100 uM ；在静音混合器上，4°C反应3h。上述的明胶酶A抑制性多肽的修饰物在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。有益效果本发明的明胶酶A抑制性多肽的修饰物，克服M205C4活性肽的稳定性差和体内代谢快的不足，其具有活性高、稳定性好、半衰期长等优点。PEG化的修饰方法，在生物制药领域被认为是改变蛋白多肽类药物生物、理化性质的最佳方法之一，是专门用于改善药代动力学行为的一种缓释方法，且PEG种类多，来源广泛，修饰方法简单易行，修饰后产物稳定，易保存。通过对PEG种类及大小的选择，得到了活性高，稳定性好，半衰期长的修饰后产物M205C4-PEG，为其在体的治疗应用提供了重要基础。


图1是实施例2的SDS-PAGE电泳图。图2是实施例3的SDS-PAGE电泳图。图3是实施例4的SDS-PAGE电泳图。图4是实施例5的SDS-PAGE电泳图。图5是M205C4和M205C4-PEG的色谱图及质谱结果图。图6为基质金属蛋白酶II酶活检测实验结果图。P图为修饰后的结果图，Q图为未修饰的结果图。

M205C4活性肽为在中国专利ZL200610085779. 7公开的活性肽，由上海吉尔生化公司合成，mPEG-SC (IOKD)购于北京键凯公司。
SDS-PAGE电泳法将所要检测的样品与4X非还原性上样缓冲液按3 1的体积比混合，室温放置15分钟后进行电泳。胶体共分为3层，上层为浓缩胶(4%)，中层为间隔胶 (10%),下层为分离胶(16%)。首先采用80V恒压进行电泳，待样品全部进入浓缩胶并压缩成直线后，改用120V恒压继续进行电泳。电泳结束后，将胶体浸入固定液(50%甲醇+10%乙酸)中，室温浸泡30分钟后置于染色液(10%乙酸+0. 025%考马斯亮蓝R250)中，室温下染色过夜，将胶体转入脱色液(10%乙酸)中，室温脱色至样品条带清晰为止。用BIO-RAD凝胶成像系统Universal Hood II对凝胶进行成像。冻干仪FreeZone(2. 5L)，购于 LABC0NC0 公司； 其他没有药品和设备均为市售药品或常用药品和设备。实施例1
单修饰M205C4-PEG的制备
用分析天平分别精密称取M205C4和mPEG-SC干粉Img及15mg (摩尔比约为1 3)，定溶于5ml PBS缓冲液(pH7.4)中，M205C4的工作浓度为100 uM，4°C反应3h，整个反应在静音混合器上完成。制备液相分离和纯化 M205C4-PEG 型号Waters 2545_2767_UV2489 ；柱子 SunfireTM C18 OBDTM制备色谱柱(30*150 mm, 5 μ m)；流动相甲醇-水-三氟乙酸(60:40:0.1)；流速1.0ml/min ；柱温25°C ；检测器Waters 2489 (双波长，220nm 及 330nm)；
将回收的溶液浓缩并分装至2ml EP管中，进行质谱检测后在液氮中过夜保存。M205C4-PEG冻干粉的制备将过夜保存在液氮的制备样品放入冻干仪中浓缩至冻干粉末。如图5所示，为M205C4和M205C4-PEG的色谱结果。A图M205C4标准品直接进样；B图M205C4和mPEG-SC的反应样品；C图M205C4和mPEG_SC的反应样品的ELSD检测结果；D图制备的M205C4-PEG样品直接进样；E图M205C4_PEG质谱结果，mPEG-SC为分子量9000-11000的长链混合物，由此所得到的修饰后产物的分子量区间为1100(Γ13000， 峰值在12000左右。其中1号峰为M205C4，2号峰为M205C4-PEG，3号峰为PEG。mPEG-SC的分子量约为9000-11000，对多肽M205C4组氨酸氨基端的单点修饰产物为M205C4-PEG，其分子量为11000 13000。M205C4-PEG的结构式为
O
.Il
CH3~fOCH2CH2hO — C—HNWTRWLLHPDRGGGS，
结构式中，CH3I OCH2CH2^1S mPEG 的结构式,HNWTRWLLHPDRGGGS 为多肽 M205C4 的氨
基酸序列。实施例2
方法与实施例1相同，修饰反应分别在PH值为5. 0,6. 0,7. 0,8. 0的PBS缓冲液中进行， 反应结束后，各体系均吸取15ul反应液进行电泳检测。图1可以看出，在碱性条件下M205C4-PEG得率较高，游离的M205C4剩余较少，其中在pH7. 4和pH8. 0的体系中，修饰效率并无明显差别。实施例3方法与实施例1相同，分别于41、151、251、371下反应，精密吸取15ul反应液进行电泳检测。从图2中可以看出，在4°C到37°C之间，温度对修饰效率并无明显影响。实施例4
方法与实施例1相同，分别收取Oh,0. 5h、lh、2h、3h和4h的反应产物，各15ul进行电泳检测。从图3中可以看出，反应进行了 3小时后，M205C4-PEG的得率便已达到最大实施例5
方法与实施例1相同，分别按1 1、1 2、1 3、1 4、1 5的摩尔比混合M205C4和mPEG-SC， 取各15ul进行电泳检测。从图4中可以看出，M205C4和mPEG-SC按1:3的投料比反应即能得到最佳的修饰效率。实施例6
基质金属蛋白酶II酶活检测实验
试剂盒:MMP-2 Fluorimetric Drug Discovery Kit (Biomol)。仪器荧光酶标仪(MolecularDevices 公司、Gemini EM)。操作方法参照试剂盒说明，结果如图6所示，为基质金属蛋白酶II酶活检测实验结果图，由此可得，修饰后产物对基质金属蛋白酶II(MMP2)的半数抑制浓度(IC50)为 101. 4uM，是未修饰多肽的4. 1倍，即修饰后产物的生物学活性下降到24.3%。


本发明公开了一种明胶酶A抑制性多肽的修饰物及其制备方法。该明胶酶A抑制性多肽的修饰物分子量为11000~13000。该制备方法包括按摩尔比为1:1~5分别称取M205C4和mPEG-SC，定溶于pH5.0-8.0的PBS缓冲液中，M205C4的反应浓度为100μM；在静音混合器上，4℃反应3h，制得M205C4-PEG混合液；对混合液进行液相分离、纯化并制得冻干粉末。本发明的明胶酶A抑制性多肽的修饰物，克服M205C4活性肽的稳定性差和体内代谢快的不足，其具有活性高、稳定性好、半衰期长等优点。PEG种类多，来源广泛，修饰方法简单易行，修饰后产物稳定，易保存。通过对PEG种类及大小的选择，得到了活性高，稳定性好，半衰期长的修饰后产物M205C4-PEG，为其在体的治疗应用提供了重要基础。