专利名称：一种人源抗鼻咽癌lmp1胞外区抗体及其应用的制作方法鼻咽癌是来源于鼻咽上皮的高度恶性肿瘤，肿瘤进展极易侵犯颅底等重要结构， 并较早发生颈部淋巴结转移和远处转移。鼻咽癌表现为种族和地区分布的特点，是我国十大高发恶性肿瘤之一，其发病率为20/100，000，已引发严重健康问题。鼻咽癌是由 Epstein-Ban·病毒(EBV)的潜伏感染、环境因素和宿主的基因遗传因素共同参与的多步骤交互作用而逐步形成的复杂性疾病。所有的鼻咽癌细胞都含有EBV基因组，并表达EBNA1， EBERl, EBER2，和LMP1，LMP2A，LMP2B，这使得这些病毒蛋白成为理想的肿瘤标志物，其中 LMPl (latent membrane proteinl,LMP1)在鼻咽上皮细胞的转化和癌变过程中的作用倍受关注，是目前公认的病毒癌基因。它以其独特的蛋白分子结构参与鼻咽癌发生和发展的全过程。目前还没有一种能够具有靶向作用的人源抗鼻咽癌LMPl胞外区抗体。
本发明目的是提供一种人源抗鼻咽癌LMPl胞外区抗体。本发明另一个目的是提供上述抗体在制备靶向作用于人类鼻咽癌LMPl胞外区的药物中的应用。本发明还有一个目的是提供能够靶向作用于人类鼻咽癌LMPl胞外区的药物。发明人通过建立潜伏膜蛋白I(LMPl)胞外区-GST融合蛋白作为抗原，以噬菌体抗体展示技术，利用细胞与抗原固相筛选相结合的方法进行筛选人源噬菌体抗体库(Fab抗体库)。多轮筛选后经噬菌体酶联免疫吸附反应(phage enzyme linked immunosorbent assay, phage ELISA)进行阳性克隆鉴定。筛选出人源抗LMPl胞外区抗体Fab (命名为 HLEAFab)。原核表达HLEAFab抗体，表达蛋白产物使用ftOtein L亲和层析柱纯化；纯化产物经ELISA、流式细胞技术以及免疫荧光技术进行鉴定。进一步通过体外实验显示该抗体与鼻咽癌细胞HNE2-LMP1胞外区特异性结合特性和靶向功能。在此基础上，靶向鼻咽癌细胞LMPl胞外区人源抗体Fab结合丝裂霉素C制备免疫毒素HLEAFab-丝裂霉素 C(HLEAFab-MMC)。MTT法检测HLEAFab-MMC对人鼻咽癌细胞系HNE2-LMP1生长的抑制作用； 流式细胞术检测HLEAFab-MMC对鼻咽癌细胞HNE2-LMP1细胞凋亡和细胞周期的影响。观察靶向鼻咽癌细胞LMPl胞外区人源抗体Fab-MMC免疫毒素体内抑瘤效应。本发明的目的是通过下列措施实现的一种人源抗鼻咽癌LMPl胞外区抗体，该抗体的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。所述的抗体，其中编码其轻链可变区氨基酸的核苷酸序列如SEQ ID N0. 3所示，编3码其重链可变区氨基酸的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。所述抗体的表达载体，该表达载体为质粒、噬菌粒或噬菌体。所述的抗体在制备靶向作用于人类鼻咽癌LMPl胞外区的药物中的应用一种药物组合物，含有上述抗体和抗鼻咽癌药物。所述的药物组合物，其中上述抗体与抗鼻咽癌药物化学偶联。所述的药物组合物，其中抗鼻咽癌药物为丝裂霉素。本发明有益效果本发明利用基因重组技术，以噬菌体抗体展示技术筛选人源抗LMPl胞外区抗体 Fab,并制备靶向作用于鼻咽癌的免疫毒素HLEAFab-丝裂霉素C(HLEAFab-MMC)，为鼻咽癌治疗提供了更多的药物选择。图1. LMPl胞外区融合基因在大肠杆菌系统中的表达。其中M:蛋白标准分子质量；1 :pGEX-4T-2载体诱导纯化后的GST蛋白；2 :pGEX_LEDl诱导后的重组菌；3 诱导前的重组菌；4 非重组菌BL21 (DE3)。图2.噬菌体抗体库筛选的ELISA检测结果。图3.抗LMPl胞外区抗体Fab表达的western blot结果。其中1. ToplO空菌； 2. HLEAFab克隆超声上清；3. HLEAFab克隆超声沉淀；4. HLEAFab。图4.纯化的抗LMPl胞外区抗体Fab (HLEAFab) SDS-PAGE结果(纯化的36号阳性克隆表达产物)。图5.纯化的HLEAFab与细胞株HNE2-LMP1的结合的细胞ELISA测定结果。图 6. HLEAFab 与 HNE2-LMP1 细胞结合的 FACS 结果。图7. HLEAFab与肿瘤细胞株HNE2-LMP1的结合而不与HNE2细胞结合的免疫荧光结果。其中a 肿瘤细胞株HNE2-LMP1经Fab染色；b 普通光学显微镜检视；c 肿瘤细胞株 HNE2经Fab染色；d 图a与b普通光学显微镜检视。图8. HLEAFab-MMC与细胞株HNE2-LMP1的结合测定。图9. HLEAFab-MMC对鼻咽癌HNE2-LMP1细胞生长抑制匪T实验结果。图10. HLEAFab-MMC偶联抗体作用于HNE2/LMP1的细胞周期和凋亡流式细胞仪检测结果。图11. HLEAFab-MMC偶联抗体治疗后鼻咽癌荷瘤各组裸鼠肿瘤体积的动态变化结^ ο
融合蛋白表达。4. GST-LMPl融合蛋白的纯化(1).离心收集表达GST-LMPl膜外肽段融合蛋白菌液。用PBS 45ml重悬细菌，超声碎菌。4°C收集上清过滤；(2).将含有GST-LMPl膜外肽段融合蛋白的上清经Glutathione Sepharose 4B 亲和层析柱(GE Healthcare)，用洗脱液(10mmol/L glutathione, 50mmol/L Tris-HCl, pH 8. 0)洗脱，收集蛋白；(3).经SDS-PAGE分析蛋白表达含量与纯度，样品于_70°C贮存。二、交替固相法与差减法的筛选抗体Fab1.本发明采用基于固相抗原的筛选与基于细胞的筛选，差减筛选法选择人鼻咽癌细胞HNE2为阴性细胞，大量表达LMPl的鼻咽癌细胞株HNE2-LMP1 (表面表达LMPl分子) 为阳性细胞；固相筛选时GST-LMPl胞外肽段融合蛋白为抗原；人鼻咽癌HNE2和HNE2-LMP1 细胞系购自湖南万百生物公司。2.基于细胞表面的差减筛选(1)抗体库滴度测定采用pComb3X载体构建Fab人源噬菌体抗体原库(Jiao Y， Zhao P, Zhu J, Grabinski T, Feng Z, Guan X, Skinner RS, Gross MD, Hay RV, Tachibana H,Cao B. Construction of human naive Fab library and characterization of anti—metFab fragment generated from the library. Mol Biotechnol. 2005Sep ；31 (1) :41-54.), 多样性约为2X109，保存于8%甘油中。将_80°C保存的噬菌体抗体原库于冰上解冻后，取噬菌体上清1 μ 1加入Iml SB培养基(此为a液)，充分混勻。取a液1 μ 1加入Iml SB 培养基(此为b液)，充分混勻。取b液ΙΟΟμΙ加入900μ1 SB培养基(此为c液)，充分混勻。取c液100 μ 1加入900 μ 1 SB培养基(此为d液)，充分混勻。从b、c、d液中各取 1 μ 1稀释的抗体原库与50 μ 1对数生长期的XLl-blue (OD600约1. 0)于室温下混合30min 后铺板，于第二天通过菌落数测滴度，大肠杆菌XLl-blueGtratagene，LaJolla, CA Cat #200158)，使用前通过抗性(抗氨苄青霉素、抗卡那霉素)检测与噬菌斑检测排除污染。公式如下每微升噬菌体数=稀释倍数X菌落数首轮准备约IO13噬菌体；筛库加入的体积数按需要的噬菌体数+每微升噬菌体数计算；如噬菌体滴度低，则将几个不同离心管内的噬菌体混合后加入1/5体积20%的PEG， 15% NaCl沉淀后用Iml 1 %的BSA-PBS溶解；(2)筛库前一天接种单克隆XLl-blue于含IOml 30 μ g/ml四环素SB培养液的 50ml烧瓶中，37°C，250r/min，过夜，第二天按1 100用含10 μ g/ml四环素的SB培养液转接，注意OD6tltl不要超过1.0 ；(3)至少准备HNE2细胞(为消除部分非特异性结合抗体的阴性细胞)与 HNE2-LMP1细胞(为细胞表面高表达抗原的阳性细胞，用于结合特异性抗体)各100万个， 即150cm2的细胞培养瓶70%长满后1-2瓶；(4)首先移去HNE2细胞培养瓶内的培养基，用10ml pH 7. 4的PBS洗三次，移去 PBS，再向每个培养瓶中移入IOml细胞解离液(购自Invitrogen, Cat :13151-014)，37°C孵育 IOmin ；(5)此时大部分细胞应已经从瓶壁分离，少量仍贴壁者可用细胞铲将细胞从培养瓶壁中缓慢刮下，收集至一个1. 5ml的聚丙烯离心管内，1800r/minX5min ；(6)仔细吸去上清，再加入Iml pH 7. 4PBS吹打重悬，按前述转速及时间离心，用 pH 7. 4PBS洗涤三次；(7)最后一次洗涤后移去PBS，用溶于Iml 5% milk (non-fat)-PBS的噬菌体抗体库重悬HNE2细胞，37°C混合30min ；在此同时按照相同方法准备HNE2-LMP1细胞；(8)离心，1800r/minX5min，然后将上清转移至HNE2-LMP1细胞(注意不要将 HNE2细胞带出)，与HNE2-LMP1细胞37°C混合30min ；(9)离心，1800r/min，5min，弃去上清，再用 Iml 0. 1% BSA-PBS 洗涤，共 8 次；(10) 50 μ 1 0. 25 % 胰酶-EDTA (trypsin-EDTA，Invitrogen)重悬细胞沉淀， 370C 20min ；把上液加入 2ml XLl-blue (OD600 约 1. 0)，37°C 30min ；(11)向装有感染了洗脱噬菌体细菌的离心管中补加事先预热至37°C的6ml SB 培养液，向其中补充1. 6 μ 1羧苄霉素保存液(羧苄霉素溶于灭菌水配制成100mg/ml保存液，-20°C保存)，吸取2μ 1加入200 μ 1 SB，混勻。取10 μ 1、100 μ 1铺板，计算洗脱噬菌体产量为第一轮产出(output)；洗脱噬菌体产量=菌落数X稀释倍数X 103，剩余菌液转到 50ml 三角瓶中，250r/min，37°C Ih ；(12)补充2. 4μ 1羧苄霉素，相同条件再培养Ih ；
(13)加入 IO13VCSM 13 辅助噬菌体(购自 Stratagene Cat :#0450468)，将整个培养液转移至含91ml预热SB培养液的500ml烧瓶中，补充46 μ 1羧苄霉素保存液与184 μ 1 四环素保存液(四环素溶于75%酒精中配成5mg/ml保存液，-20°C保存)，继续前述条件培
养(14)加入140 μ 1卡那霉素保存液(卡那霉素溶于灭菌水配成50mg/ml保存液，保存于-20°C)，过夜培养；(15)将培养液转移至500ml离心瓶中，室温，3，000g, 15min ；(16)上清中加入4g PEG，3g NaCl，摇晃混勻后于冰上静置Ih ；(17)4°C离心，15，000gX15min ；(18)弃上清，将离心瓶口朝下置于纸上，将剩余的液体清除；(19)用Iml 1% BSA-PBS溶解噬菌体，用前述方法测定滴度，取IO13次级噬菌体抗体库(基于细胞表面的差减筛选得到最后一轮噬菌体抗体库)用于下一轮筛选，共筛选5 轮；剩余保存于_80°C。3.固相筛选法方法(1)包被抗原在两个1. 5ml的离心管中，分别将纯化的GST (购自genscript公司 Cat. No. z02039), GST-LMPl融合蛋白(见实施例1中潜伏膜蛋白1 (LMPl)胞外区抗原的制备与纯化)溶于400 μ 1 ELISA包被缓冲液(0. 05mol/l碳酸盐缓冲液ρΗ9· 6 =Na2CO3L 59g NaHC032. 93g蒸馏水1000ml)使终体积达到400 μ 1，GST-LMPl融合蛋白浓度为3 μ g/ml， 每孔中分别加入50 μ 1，每次筛库每个浓度用8孔，4°C过夜；筛库前一天及当天按前述方法 (见基于细胞表面的差减筛选( 条)准备细菌；(2)次日，次级抗体库 250μ 1 与 5% milk (non-fat) 250 μ 1，37°C 30min ；(3)将上液以每孔50 μ 1加入GST包被的ELISA 8孔板中；(4)将包被了 GST-LMPl融合蛋白的八个孔弃去封闭液(5%脱脂牛奶-PBS)，拍干液体后；(5)将GST包被的ELISA八孔板中的Fab抗体库(次级抗体库)50 μ 1转入 GST-LMPl融合蛋白的8个孔中，盖上塑料膜，37 °C 2h ；(6)甩去噬菌体，0. 5% TWEEN-TBS 洗涤向孔中加满 0. 5% TWEEN-TBS，用 Iml Tip 头反复吹打10次，静置约5min，待气泡完全消失，甩去孔中洗涤缓冲液，孔顶朝下拍打3次， 反复10次后再用装于无菌塑料瓶中的洗涤缓冲液冲洗，甩去缓冲液后再拍打3次，反复5 次；(7)向每孔中加入约50 μ 1胰酶-EDTA，37°C 30min,用Tip头猛烈吹打10次；剩余转移到2ml当日接种培养的XLl-blue (OD6tltlL 0左右)的12ml聚丙烯培养管中，室温孵育 20min ；(8)向装有感染了洗脱噬菌体细菌的离心管中补加事先预热至37°C的6ml SB培养液，向其中补充1. 6 μ 1羧苄霉素保存液，12 μ 1四环素保存液，于37°C，250r/min, Ih ；同时取2μ1加入200μ1 SB，混勻。取10μ 1、100μ 1于LB-Agar/羧苄霉素培养液(羧苄霉素终浓度为100 μ g/ml)，37°C过夜生长后数单菌落数目，计算产出噬菌体(output)；(9)补充2· 4μ 1羧苄霉素(100mg/ml)，相同条件再培养Ih ；(10)加入IO13VCSM 13辅助噬菌体，将整个培养液转移至含91ml预热SB培养液的500ml烧瓶中，补充46 μ 1羧苄霉素保存液与184 μ 1四环素保存液，继续前述条件培养 2h ；(11)加入140 μ 1卡那霉素保存液，过夜培养；(12)将培养液转移至250ml离心瓶中，4°C离心，3，000g, 15min ；(13)上清中加入4gPEG，3gNaCl，37°C，250r/min，15min摇晃混勻完全溶解后于冰上静置Ih ；(14)4°C离心，15，000g，30min ；(15)弃上清，将离心瓶口朝下置于纸上，将剩余的液体清除；(16)用500 μ 1 BSA-TBS溶解噬菌体，用前述方法(见基于细胞表面的差减筛选(1)条)测定滴度，取IX IO12噬菌体次级抗体库用于下一轮筛选；剩余保存于-80°C。4.噬菌体ELISA挑选阳性克隆(1)本过程需新鲜准备的包被抗原。用ELISA包被缓冲液(同上)分别稀释纯化的GST和GST-LMPl融合蛋白至浓度为3 μ g/ml，每孔中加入50 μ 1，4°C过夜；(2)第二天甩去每板中的包被缓冲液，每孔中加满ELISA洗涤缓冲液(0. 05% PBST 缓冲液含终浓度为0. 05% Tween-20的PBS溶液)，甩去，于纸上拍打三次洗涤，反复三次；(3)每孔中加新鲜配制的 1 % BSA-PBS, 37°C，1. 5h ；(4)最后一轮产出噬菌体2ml铺四块板，37°C孵箱中过夜培养；(5)次日晨用枪头挑选60个单菌落分别接种于Iml SB培养基(100 μ g/ml氨苄青霉素及葡萄糖)，于12ml聚丙烯培养管中37°C震荡培养；(6)约8-10h后，0D_达到0. 3，此时向每个培养管中加入IO9VCSM 13辅助噬菌体， 继续37°C震荡培养池；(7)每管中加入1.4μ 1 50mg/ml的卡那霉素至终浓度为701^/1111，摇床中371过
夜培养。(8)次日，将每根培养管标号，3，OOOg离心，15min，每管中剩余的噬菌体暂存于 4 0C ；(9)以GST孔做对照组，GST-LMPl融合蛋白孔做实验组，甩去ELISA板中的封闭牛奶，吸取出50 μ 1过夜培养液上清与50 μ 11 % BSA-PBS混勻，按顺序加入分别在对照孔 (GST)和实验孔(GST-LMP1融合蛋白)中加入同一克隆的噬菌体，留至少两对孔加入含相同浓度抗生素及葡萄糖的SB培养液(100 μ g/ml氨苄青霉素及葡萄糖)作为空白对照， 37°C，2h ；(10)弃去噬菌体培养液，拍打三次后再用IOml移液管吸取0. 1 % TffEEN-PBS冲洗后再拍打三次，用此方法共洗涤五次；(11)每孔中再加入50μ 1 1 3，000稀释的HRP标记的羊抗Μ13 二抗，室温Ih;(12)用(3)中的方法再次洗涤；(13)显色，每孔中加入100 μ 1显色底液(TMB与H2A按1 1混合)，20min后加 Λ IM H2SO4停止显色；(14)于波长450nm读数记录。5.阳性克隆的测序(试剂盒购自大连宝生物工程公司，操作方法详见大连宝生物工程公司 TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver. 2. 0 说明书)
(1) 2ml随机挑取转化菌，12000r/min离心2min，弃上清；(2)加入 250 μ 1 的 Solution I (含 RNase Al)，充分重悬细菌；(3)加入250 μ 1的Solution II，轻轻地上下翻转混合5_6次，使菌体充分裂解， 形成透明溶液；(4)加入400 μ 1 4°C预冷的Solutionlll，轻轻地上下翻转混合5_6次，直至形成紧实凝集块，室温静置aiiin;(5) 12000r/min 离心 lOmin，取上清；(6) Spin Column 安置于 Collection Tube，上清置于 Spin Column 中；(7) 12000r/min 离心 lmin，弃滤液；(8)将 500 μ 1 的 Rinse A 加入 Spin Column 中，12000r/min 离心 30s，弃滤液；(9)将 700 μ 1 的 Rinse B 加入 Spin Column 中，12000r/min 离心 30s，弃滤液；(10)重复上一步，然后再12000r/min离心lmin，弃滤液；(11)将Spin Column安置于新的1. 5ml离心管，在Spin Column膜的中央处加入 60 μ 1经60°C预热的洗脱液，室温静置Imin ；(12) 12000r/min 离心 lmin，洗脱 DNA。测序。三、HLEAFab的表达1. Top 10F，购自 Invitrogen (Cat :#C3030_03)，接种于含 30 μ g/ml 四环素的 LB-Agar培养液中，取单菌落于37°C震荡培养过夜；2.将过夜培养的Top 10F，以1 100接种于含30 μ g/ml四环素的SB培养液中， 37°C震荡培养至OD 600约为0. 8 ；3.吸取Iyl阳性克隆的噬菌体与50 μ 1对数生长期的Top 10F’混合，于常温下孵育15mins，然后铺板生长于含100 μ g/ml氨苄青霉素的LB-Agar，37°C过夜生长；4.次日，挑选单菌落接种于含100 μ g/ml氨苄青霉素，2%葡萄糖的SB培养液中， 37°C震荡培养过夜；5.用含100 μ g/Ι氨苄青霉素，葡萄糖的SB培养液按1 100转接过夜生长的细菌，37°C震荡培养直至OD 600达到1. 0 ；6. 5000r/min，5min，37°C离心，弃上清，用Iml含100 μ g/Ι氨苄青霉素的SB重悬
细菌；7.加入IPTG至终浓度为0. ImM，加入终浓度为4%的蔗糖溶液，于25°C震荡培养过夜。四、阳性克隆表达的鉴定1.取100 μ 1过夜诱导表达的细菌培养液，离心，10，000g ；2.将上清与细菌沉淀分离，取10μ 1上清与相同体积的SDS 2Χ上样缓冲液混勻， 100 °C 煮沸 5min ；3.向pH 7. 4PBS加入200mM苯甲基磺酰氟(PMSF)至终浓度为ImM，用200 μ 1重悬细菌沉淀，然后于冰水混合物中超声处理5min ；4.再离心，10，000gX5mins ；5.取10 μ 1上清与相同体积的SDS样缓冲液混勻，100°C煮沸5min ；6.上样，蛋白电泳，90V，大约Ih左右；
7.转膜，150mA，2h ；8.封闭，5% milk-PBS，将膜完全浸泡于封闭液中，37°C Ih ；9.洗涤三次(洗涤方法为加入PBST(0. 1 % TffEEN-PBS缓冲液)，室温下于摇床上反复摇晃5min，然后弃去再加入PBST)；然后加入1 3000稀释的HRP标记的羊抗人 IgG(Fab)，，室温下于摇床上摇晃Ih ；10.按前述方法再洗涤三次，加入HRP底物冲洗硝纤膜，约4 后曝光。五、阳性克隆表达产物的纯化1.取IL过夜诱导表达HLEAFab的细菌培养液，离心细菌培养液， 10，OOOgX 15min ；2.细菌沉淀重悬于1/10细菌培养液体积的含ImM PMSF的pH 7. 4的20mM磷酸缓冲液；3.将重悬的液体分装于50ml的聚丙烯离心管中，于冰水混合物中超声处理，约 12min ；4.将超声后的菌液再次聚集在一起，离心，15，000gX30min ；5.弃沉淀，上清通过0. 22 μ 1滤器过滤；6.准备好AKTA-FPLC(美国GE公司AKTA-purifer蛋白纯化系统)与Protein L 亲和层析柱(购自genscript公司Cat. No. L00239)，从柱中先后流过2倍柱体积的去离子水及10倍柱床体积的结合缓冲液(Νει2ΗΡ0420πιΜ NaCl 0. 15M，调节pH到7. 0)，平衡protein L-琼脂糖亲和层析柱；7.取待纯化样品上柱，流速为0. 5 lmL/min ；8.然后以同样的流速依次用20倍柱床体积的结合缓冲液；9.上 5mL 洗脱缓冲液(Citric acid 0. 1M,调节 pH 到 3. 0)，在 AKTA-FPLC 上根据峰值收集洗脱蛋白，并用0. lmol/L Tris碱中和收集的洗脱液至pH7. 0 7. 5 ；10.用BCA法测蛋白质含量，置4°C保存备用。11.纯化的HLEAFab用SDS-PAGE鉴定其纯度。用0. 12g/mL分离胶、0. 04g/mL浓缩胶，设低分子量标准，恒压下电泳。考马斯亮蓝R250染色。纯化的HLEAFab的活性用上述ELISA法鉴定；12.经旋转透析管(Centricon, Millipore Corp.，Bellerica, MA)离心换缓冲液溶解于pH 7. 4，PBS中浓缩保存。六、纯化的HLEAFab与LMPl胞外区结合能力ELISA1.包被抗原及封闭方法详见前，分为两组包被抗原，第一组每孔中GST 600ng、 第二组GST-LMPl融合蛋白每孔600ng包被抗原；2.将纯化的 HLEAFab 分别稀释为 10、5、2. 5、1. 25、0. 625、0. 313、0. 156 μ g/ml，向每孔中加入50 μ 1稀释的HLEAFab于常温下孵育Ih ；3.洗涤后加入1 2000稀释的HRP标记的羊抗人二抗，室温下Ih ；4.洗涤后加入底物显色30min于加入IM硫酸中止显色，于波长450处读数。七、HLEAFab细胞 ELISA 检测1.用胰蛋白酶消化细胞培养瓶中的细胞；收集细胞并计数；离心，1500r/min， IOmin ；
2.用1640培养液重悬细胞调整浓度4X IO5个细胞/ml，分成三组，第一组鼻咽癌细胞株HNE2-LMP1细胞，第二组对照组肝癌细株7721细胞，第三组鼻咽癌细胞株HNE2 ；3.滴加到96孔培养板中，100 μ 1/孔；37°C环境孵育过夜；4.用PBS洗板两次；5.每孔加125 μ 1 10%福尔马林缓冲液；于室温环境下固定15min ；6.用双蒸水洗涤三次；晾干；贮存于2_8°C ；7.用双蒸水洗涤ELISA板两次；8.每孔加 250 μ 1 含 2% BSA 的 PBS ；37°C孵育 Ih ；9.双蒸水洗板三次；10.每孔加50 μ 1 Fab (依次用含BSA的PBS稀释至浓度为20、5、1. 25、0. 313、 0. 078,0. 02,0. 005μ g/ml)，37°C孵育 2h ；11. 11、0. PBST 洗板五次；12.每孔加50 μ 1用含BSA的PBS稀释的HRP酶标抗人IgG(Fab) ；37°C孵育 lh；13. TMB显色，显色前按TMB H2O2 = I 1混合，100 μ 1/孔，在室温下孵育20min ； 加IM硫酸溶液50 μ 1/孔；14.在酶标仪上测0D490波长的值。八、荧光激动的细胞分类(fluorescence-activated cell sorting, FACS)1.分别培养HNE2与HNE2/LMP1细胞至约IO6个；2.用pH 7. 4PBS洗涤三次向每个培养瓶中移入IOml pH 7. 4，PBS后倒出；反复三次；3.向每个培养瓶中分别加入2_3ml细胞解离液(购自Invitrogen，Ca 13151-014)，37°C，IOmin ；4.用细胞刮将细胞刮落，再加入约Iml pH 7. 4PBS，转入15ml的聚丙烯离心管， 1800r/min 离心，5min ；5.弃去上清，用Iml pH 7. 4PBS重悬细胞，再离心，1800r/min，5min，反复三次；6.用 IOml 1% BSA-PBS 于 4°C封闭 30min ；7.离心，将每种细胞分为两份，一份用含50 μ g/ml HLEAFab的PBS Iml重悬，另一份用不含HLEAFab的PBS重悬，细胞均置于microtube中，于mixer上4V转动反应45min ；8. 1800r/min 离心，5min ；弃去上清；9.用 Iml pH 7. 4PBS 重悬细胞，再离心，1800r/min，5min，反复三次;10.用 Iml 1 200 稀释的 FITC-labeled anti human Fab IgG 重悬每份细胞，于 4°C转动反应30min，本步骤中就用铝箔包裹试管避光；11. 1800r/min离心，5min ；弃去上清；再用pH 7. 4PBS洗涤三次；12.将每份细胞用200μ1 pH 7. 4PBS重悬，于流式细胞仪分析光强度，其中未加 HLEAFab反应者作为阴性对照。九、免疫荧光1.将上述两种细胞分别接种于6孔培养皿中，每种细胞两孔，每孔约1500细胞，直到约80%长满，其中每种细胞培养1孔作为实验观察组，另1孔仅加入二抗作为阴性对照组；2.吸去培养液，用pH 7. 4PBS洗涤三次，方法为加入PBS后再吸去；3.加入按等体积混合的丙酮与甲醇混合液，室温下固定20min ；4.吸去固定液(上述按等体积混合的丙酮与甲醇混合液)，再用去离子水洗三次， 洗涤方法为加入去离子水后吸去；5.用新鲜配制的5%脱脂牛奶-PBS在37°C封闭Ih ；6.阴性对照组继续用封闭液(上述5%脱脂牛奶-PBS)处理，实验组中加入 20 μ g/ml HLEAFab 抗体，37 °C，Ih ；7.用pH 7.4PBS洗涤，方法同前；8.在无光条件下加入 1 200 稀释的 FITC-Iabeled goat anti human Fab，室温 0. 5h ；9.有用前述方法洗涤后于显微镜下观察；FITC激发波长494nm。结果一、LMP-I胞外肽段融合蛋白的表达与纯化LMP-I胞外肽段的相对分子质量为6. 2ku,加上^ku相对分子质量的GST，融合蛋白预期的相对分子质量应为32. 2ku。转化有重组质粒pGEX-4T-2的BL21 (DE3)经IPTG诱导后，在相应区域有浓染蛋白带一条，与预期大小相吻合，而在^ku处的蛋白带消失，说明插入的外源基因已成功地在大肠杆菌中表达，并与GST形成了融合蛋白。经SDS-PAGE分析， 含有表达载体的BL21(DE!3)菌株经IPTG诱导，可表达与预期分子量相符蛋白带(图1)。二、phage ELISA的阳性克隆挑选我们于第7轮筛库结束后挑选单克隆噬菌体扩增进行phage ELISA selection，把阳性标准定义为P/N > 2、OD450高于0. 5，结果仅有两株克隆达到我们预定的阳性克隆的标准，即30号与36号克隆。挑选2个ELISA信号最强的质粒送检，结果提示2株的基因型符合Fab基因型，且该Fab轻链为κ链，提示特异性30号和36号克隆从抗体库中被挑选出来。挑选36号克隆命名为HLEAFab (图2)。阳性克隆序列的测定表1 :36号克隆的轻链可变区(上)及重链可变区(下)序列


本发明属于基因工程领域和免疫靶向诊疗领域，公开了一种人源抗鼻咽癌LMP1胞外区抗体及其应用。该抗体的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，该抗体能与人类鼻咽癌LMP1胞外区结合，可用于制备靶向作用于人类鼻咽癌LMP1胞外区的药物。