专利名称：人源dcf1基因转基因果蝇模型的构建方法果蚬(Drosophila melanogaster)具有高度发达的神经系统以及较短的生命周期，易饲养且易于进行遗传学、细胞生物学、分子生物学手段的操作和分析，是一种非常实用的模式生物。所有，果蝇广泛地用于神经退行性疾病模型的构建和研究。树突状细胞因子(dendritic cell factor I, DCFl)又名跨膜蛋白59(transmembrane protein 59, TMEM59),首次发现于免疫系统的树突细胞中，是一个表达 范围比较广泛的单次跨膜蛋白。目前对于该蛋白的功能研究报道比较少，已有的报道表明DCFl主要定位在高尔基体上，且DCFl与其同源蛋白TMEM59-like能够抑制APP向细胞膜的转运以及进一步的剪切，说明DCFl与AD存在某种联系。Alzheimer’s disease (AD),又称老年痴呆症，是由一名叫 Alois Alzheimer 的德国医生于1906年第一次报道的，以不可逆进行性的记忆减退和认知、语言功能障碍以及定向力、运动能力障碍等为主要临床表现的一种神经退行性疾病。AD是老年人的常见病与多发病，全球有超过1500万的老年人正受到AD的侵蚀和折磨。AD严重危害老年人的身心健康，已成为仅次于心脏病、恶性肿瘤和中风的第4位导致老年人死亡的原因，也是老年医学中亟待解决和最棘手的问题之一。AD的发病机制目前学说众多，如自由基损伤学说、胆碱能学说、钙平衡失调学说、兴奋性氨基酸毒性学说等。AD的患者一般表现为皮质神经元丢失，并伴随有细胞外由APP剪切产生的大量β淀粉样肽(amyloid β -peptides, APs)沉积形成的老年斑和大量神经细胞内异常过度磷酸化tau蛋白聚集且以双螺旋丝的形式形成神经原纤维缠结(neurofibrillary tangle, NFT)。
本发明的目的在于提供一种人源dcfl基因转基因果蝇模型的构建方法。为达到上述目的，本发明采用如下技术方案 一种人源dcfl基因转基因果蝇模型的构建方法，其特征在于该方法的具体步骤为a.将人源dcfl基因开放式阅读框对应的cDNA序列构建入果蝇转基因载体pWIZ中，得到果蝇转基因载体pUAST-dcfl ； b.将步骤a所得果蝇转基因载体pUAST-dcfl为材料，利用显微注射的基因工程技术手段构建并得到人源dcfl转基因果蝇。上述的步骤a的具体方法可以为 a-Ι.以人子宫颈癌细胞HeLa细胞的cDNA为模版进行PCR扩增，引物为 dcfl primers 5’ -CGGAATTCATGGCGGCGCCGAAGGGG AG-3’5， -GCTCTAGATTAAATTTCAGAATGAGCAA-3，)，得到大小为972bp的dcfl基因开放式阅读框全长的目的片段；再用EcoRI和XbaI双酶切，收集片段；
a-2.用EcoRI和XbaI双酶切空载体质粒pWIZ，收集大片段备用；a-3.将步骤a-1和步骤a-2所得的两个片段连接起来，得到果蝇转基因载体pUAST-dcflo上述的步骤b的具体步骤为
b-Ι.将转基因载体pUAST-dcfl (终浓度O. 8 Pg/mg)和辅助质粒ρ Λ 2_3 (终浓度O. 2Kg/mg)混合后，将此混合液注入果蝇的受精卵的尾部，并放置在16°C的湿盒中培养；
b-2.待步骤b-1所得的受精卵孵化成幼虫然后羽化为成虫后即和野生型W1118交配，挑取子代眼色为红色的果蝇即为转基因果蝇； b-3.将步骤b_2所得转基因果蚬和Double Balance果蚬以及野生型wlll8杂交,筛选出基因型为w;UAS-dcfl/UAS-dcfl;+/+的果蝇。本发明利用显微注射基因工程技术和果蝇杂交技术，构建了人源dcfl基因转基因果蝇模型，为相关神经退行性疾病的研究提供了材料和新思路。


图I为构建的果蝇转基因载体pUAST-dcf I经限制性内切酶EcoRI和XbaI双酶切产物的电泳图，最左边泳道为DNA Marker，泳道1、2均为pUAST-dcfl双酶切产物。图2为显微注射操作时果蝇的受精卵的状态。
图3为显微注射得到带有平衡基因的人源dcfl转基因果蝇和Double Balance果蝇以及野生型果蝇wlll8分别杂交后获得的纯合UAS系转基因果蝇品系w;UAS-dcn/以5-如?;+/+、以及野生型果蝇《1118分别和elav-GAL4果蝇(泛神经细胞表达启动)杂交得到的Fl代果蝇，分别提取羽化后10天Fl代果蝇脑部组织的总RNA后反转录cDNA为模版而进行的PCR反应后的电泳图(引物为构建转基因载体pUAST-dcf I时取得目的片段时的引物)，内参为β-actin。

I、为得到果蝇转基因载体pUAST-dcf I，首先以人子宫颈癌细胞HeLa细胞的cDNA为模版进行 PCR 扩增，引物为 dcfl primers (5，-CGGAATTCATGGCGGCGCCGAAGGGG AG-3’和 5’ -GCTCTAGATTAAATTTCAGAATGAGCAA-3’)，得到大小为972bp (dcfl基因开放式阅读框全长)的目的片段后再用EcoRI和XbaI双酶切，收集片段备用。2、然后用EcoRI和XbaI双酶切空载体质粒pWIZ，收集大片段备用。3、最后将两个片段连接起来，得到果蝇转基因载体pUAST-dcfl。4、如图1，EcoRI和XbaI双酶切鉴定构建的果蝇转基因载体pUAST-dcf 1，可见转基因载体pUAST-dcf I双酶切后放出了大小为972bp的目的片段，后经测序证明了目的片段的准确性，说明正确的目的片段已经插入到载体中，载体构建成功。实施例二 显微注射转基因实验以及转基因果蝇的验证
I、为得到人源dcfl转基因果蝇，以P因子介导的生殖细胞系转化的原理，利用显微注射的基因工程技术构建转基因果蝇。2、将转基因载体pUAST-dcfl和辅助质粒以一定浓度比例，装入拉长开口的玻璃微电极中，在气压机械注射臂的帮助下将此混合液注入果蝇新产出Ih内去除卵壳的受精卵的尾部，参见图2，将注射完成后的卵放16°C在湿盒中培养。3、注射后的受精卵孵化成幼虫然后羽化为成虫后即和野生型《1118交配，挑取子代眼色为红色的果蝇即为转基因果蝇。将挑选出的带有dcfl基因的UAS品系果蝇和Double Balance果蚬杂交和回交，得到稳定遗传的人源dcfl转基因果蚬品系w;UAS_dcfl/Cyo; Tm6B/Tm2o再将此品系果蚬与Double Balance果蚬以及野生型wl 118杂交,可以筛选出基因型为w;UAS-dcfl/UAS-dcfl;+/+的纯合UAS系dcfl转基因果蝇。为了可以在果蝇神经细胞中验证表达dcfl，利用GAL4/UAS双元系统控制外源基因表达的原理，将筛选出的纯合UAS系dcfl转基因果蝇与elav-GAL4杂交，得到Fl代并提取羽化后10天Fl代果蝇脑部组织的总RNA后反转录cDNA为模版而进行PCR反应， PCR反应的引物为dcfl primers ;内参基因为β-actin,引物的序列为β-actin primers(5，-GTCCCAGTTGGTCACGAT-3’ 和 5’ -AGTTGCTGCTCTGGTTGT-3’ )。 参见图 3 由电泳图可知，构建的人源dcfl转基因果蝇是成功的，因为以转基因果蝇Fl代的cDNA为模版可以扩增出972bp的目的条带而对照组却没有。实施例三本发明的果蝇模型能作为神经细胞研究中的工具
I、果蝇有天生的负趋地性，当果蝇被放入竖直放置的管中会本能地向上端爬行，而爬行的速度反应了果蝇的运动能力。实验利用不同基因、相同数量(10只)、相同羽化天数、相同性别(雄性)的果蝇用二氧化碳麻醉后分别移入相同的试管(长18cm，直径I. 5cm)中，25°C环境复苏30min后开始实验。2、装有果蝇的试管保持竖直状态，实验开始时温和地敲击试管，使果蝇集中到试管底部后开始计时，IOs后计时结束时快速计数在试管顶端和底端的果蝇数量并做好记录，一次测试后让果蝇恢复60s后再继续下一次测试，每次实验完成5-10次测试；实验每5天重复一次，从刚羽化到羽化第60天为止，各组实验要进行三次生物学重复。3、实验的四组果蝇分别为AD模型果蝇、本发明的模型果蝇与AD模型果蝇杂交后得到的共表达dcfl的AD模型果蝇、本发明的模型果蝇、野生型果蝇(这些UAS系果蝇和elav-GAL4杂交产生Fl代以表达各外源基因，野生型与elav-GAL4杂交作为对照)。每次实验中5-10次技术重复取平均值作为一次实验结果，完成三次生物学重复，利用Student’ sTest统计分析实验数据。实验结果表明，从第10天开始，共表达dcfl的AD模型果蝇相比于AD模型果蝇，同时期的爬壁能力均有了显著的提高(*ρ〈0· 05，** ρ〈0·01)，即运动能力下降的症状有了显著的缓解。AD模型果蝇相比于作为对照的表达外源dcfl的果蝇和野生型对照果蝇，同时期的爬壁能力远远要差，说明运动能力大幅度下降；而同时共表达dcfl的AD模型果蝇相比于作为对照的表达外源dcfl果蝇和野生型对照果蝇，同时期的爬壁能力仍然要差但强于AD模型果蝇，即运动能力下降的症状虽然得到缓解却不能完全治愈，以到达正常的水平。因此本发明的果蝇模型可以为相关神经退行性疾病的研究提供了材料和新思路。


本发明涉及一种人源dcf1基因转基因果蝇模型的构建方法。本发明构建了果蝇转基因载体pUAST-dcf1；通过显微注射的方式获得人源dcf1转基因UAS品系果蝇，并通过与DoubleBalance果蝇w;B1/Cyo;Tm6B/Tm2的杂交与回交得到带有平衡基因且能稳定遗传的人源dcf1转基因果蝇品系w;UAS-dcf1/Cyo;Tm6B/Tm2。本发明利用显微注射基因工程技术和果蝇杂交技术，构建了人源dcf1基因转基因果蝇模型，为相关神经退行性疾病的研究提供了材料和新思路。