专利名称：Dcf1基因的新用途的制作方法阿尔兹海默症(Alzheimer’s Disease, AD)也就是我们俗称的老年痴呆,是一种大脑的退行性疾病，主要表现为进行性记忆和认知功能障碍。目前公认的阿尔兹海默症主要的病理改变是脑内β淀粉样斑块的形成和tau蛋白介导的神经纤维缠结。目前阿尔兹海默症的形成原因与发病机制仍然是全球的热点关注话题，这不仅是一门值得被关注值有待被解决的问题，更与人类健康息息相关。树突细胞因子(dentritic cell-derived factor 1,DCF1)基因的功能报道比较罕见。有报道指出DCFl能够抑制淀粉样前体蛋白APP的剪切，进而阻止形成阿尔兹海默症淀粉样蛋白斑的β淀粉体蛋白肽。此研究就是旨在探讨DCFl缺失后对蛋白质组的功能表达发生什么样的改变。果蚬(Drosophila melanogaster)具有高度发达的神经系统以及较短的生命周期，易饲养且易于进行遗传学、细胞生物学、分子生物学手段的操作和分析，是一种非常实用的模式生物。所有，果蝇广泛地用于神经退行性疾病模型的构建和研究。本发明通过GAL4/UAS双元系统控制外源基因表达，利用在果蝇神经细胞中表达表达人源APP和BACE来构建AD果蝇模型，该模型被证实在果蝇生命周期的早期即开始呈现运动能力下降的AD的症状。DIGE (双向荧光差异凝胶电泳)是在传统电泳的基础上发展起来的新型蛋白质定量技术。DIGE通常使用三种荧光染料(CY2，CY3，CY5)标记不同组别的蛋白(包括混合蛋白样本作为内参)。电泳分离后，根据不同波长进行激光扫描，运用专业分析软件得出确定的定量结果。
发明目的之一在于提供一种dcfl基因在缓解运动能力下降症状中的应用。本发明的目的之二在于提供一种dcfl基因在缓解学习记忆能力下降症状中的应用。本发明通过杂交的方式在AD模型果蝇神经细胞中表达dcfl基因，利用ClimbingAssay (爬壁实验)检测其运动能力下降症状的缓解情况；另外通过分析野生型以及DCFl缺失后的小鼠全脑蛋白的2D-DIGE (双向荧光差异凝胶电泳)，以及质谱分析得出相关的表达差异蛋白，并对所有差异蛋白(P〈0. 05)进行功能注视及分类，归类3个蛋白为阿尔兹海默症(AD)相关蛋白并进行western的表达量验证。通过分析open field (认场实验)和Morris water maze (水迷宫即学习记忆能力实验)的结果可以证实,dcfl基因缺失后的小鼠的运动能力和学习记忆能力都有所下降。本发明通过分析Climbing Assay (爬壁实验)和 Learning and Memory AbilityAssay (学习记忆能力实验)的结果可以证实，表达人源dcfl基因后AD模型果蝇的运动能力和学习记忆能力下降的症状有了显著的缓解。这种利用在神经细胞内表达基因产物来治疗AD的方法，有别于传统的外部给药，为AD的治疗开辟了一条新的思路。图I为构建的果蝇转基因载体pUAST-dcf I经限制性内切酶EcoRI和XbaI双酶切产物的电泳图，最左边泳道为DNA Marker，泳道1、2均为pUAST_dcfl双酶切产物。图2为显微注射操作时果蝇的受精卵的状态。图3为显微注射得到带有平衡基因的人源dcfl转基因果蝇和Double Balance果蝇以及野生型果蝇wlll8分别杂交后获得的纯合UAS系转基因果蝇品系w;UAS-dcn/以5-如?;+/+、以及野生型果蝇《1118分别和elav-GAL4果蝇(泛神经细胞表达启动)杂交得到的Fl代果蝇，分别提取羽化后10天Fl代果蝇脑部组织的总RNA后反转录cDNA为模版而进行的PCR反应后的电泳图(引物为构建转基因载体pUAST-dcf I时取得目的片段时的引物)，内参为β-actin。图4为果蝇爬壁实验结果。实验的四组果蝇分别为AD模型果蝇、共表达dcfl的AD模型果蝇、表达dcfl的果蝇、野生型(这些UAS系果蝇和elav-GAL4杂交产生Fl代以表达各外源基因，野生型果蝇与elav-GAL4杂交作为对照)。图片显示从成虫羽化第I天起到第60天，每隔10天进行一次爬壁能力的测定的结果。统计显著性的方法为Student’ sTest，*ρ〈0· 05，** ρ〈0·01。图5为果蝇学习记忆实验结果。实验的四组果蝇分别为AD模型果蝇、共表达dcfl的AD模型果蝇、表达dcfl的果蝇、野生型果蝇wl118 (这些UAS系果蝇和elav_GAL4杂交产生Fl代以表达各外源基因，野生型与elav-GAL4杂交作为对照)。图片显示果蝇进入可食管和不可食管的数量变化，通过果蝇寻找食物的时间和数量变化可以判断果蝇学习记忆能力的变化。A为各组果蝇在进入可食管的数量变化图；B为各组果蝇进入不可食管的数量 变化图。统计显著性的方法为Student’ s Test, *ρ〈0· 05, ** ρ〈0. 01。图6为用PCR手段鉴定小鼠基因型的凝胶电泳图。其中分别用up low以及upF31ow两对引物进行PCR检测。1，2泳道的检测结果为400bp以及I. 9kb为野生型；3，4泳道的检测结果为没有条带与700bp为敲除型。图7为蛋白质的2D电泳图，将鉴定完毕的小鼠包括野生型和敲除型的小鼠各5只取脑组织的蛋白，混合后上样，根据蛋白质大小及等电点的分离形成二维的电泳图。图8为western验证差异蛋白的表达量。对于野生型和全敲鼠的全脑蛋白进行抽提，并将其进行western定量，验证了质谱分析结果。图9为小鼠进行了阿尔兹海默症模型鼠的行为学测试。首先进行学习记忆能力的测试，测试手段为水迷宫。对其进行5天的训练，然后测试其的学习记忆。分别记录小鼠的游行距离，其穿越平台的次数与时间，并对结果进行Student’ s T test的统计分析，其中(*ρ〈0· 05, **ρ〈0· 01) 图10为小鼠进行运动能力的测试，开场实验可以检测小鼠的运动能力，同时也能测试小鼠对于新奇事物的探索能力。参数记录分别为小鼠运动的全程距离，穿越中间区域的次数以及停留在中央区域的时间。

一、果蝇转基因载体pUAST-dcfl的构建和验证
I、为得到果蝇转基因载体pUAST-dcf I，首先以人子宫颈癌细胞HeLa细胞的cDNA为模版进行 PCR 扩增，引物为 dcfl primers (5，-CGGAATTCATGGCGGCGCCGAAGGGG AG-3’和 5’ -GCTCTAGATTAAATTTCAGAATGAGCAA-3’)，得到大小为972bp (dcfl基因开放式阅读框全长)的目的片段后再用EcoRI和XbaI双酶切，收集片段备用。2、然后用EcoRI和XbaI双酶切空载体质粒pWIZ，收集大片段备用。3、最后将两个片段连接起来，得到果蝇转基因载体pUAST-dcfl。4、如图1，EcoRI和XbaI双酶切鉴定构建的果蝇转基因载体pUAST-dcf 1，可见转基因载体pUAST-dcf I双酶切后放出了大小为972bp的目的片段，后经测序证明了目的片段的准确性，说明正确的目的片段已经插入到载体中，载体构建成功。二、显微注射转基因实验以及转基因果蝇的验证
I、为得到人源dcfl转基因果蝇，以P因子介导的生殖细胞系转化的原理，利用显微注射的基因工程技术构建转基因果蝇。2、将转基因载体pUAST-dcf I和辅助质粒以一定浓度比例，装入拉长开口的玻璃微电极中，在气压机械注射臂的帮助下将此混合液注入果蝇新产出Ih内去除卵壳的受精卵的尾部(如图2)，将注射完成后的卵放16°C在湿盒中培养。3、注射后的受精卵孵化成幼虫然后羽化为成虫后即和野生型《1118交配，挑取子代眼色为红色的果蝇即为转基因果蝇。将挑选出的带有dcfl基因的果蝇和Double Balance果蝇以及野生型wl 118经过多次有针对性的杂交，可以筛选出基因型为w; UAS-dcf 1/UAS-dcf I; +/ + 的果妮。
4、为了可以在果蝇神经细胞中表达dcfl，可以将构建的UAS系dcfl转基因果蝇与elav-GAL4杂交，得到Fl代并提取羽化后10天Fl代果蝇脑部组织的总RNA后反转录cDNA为模版而进行PCR反应,引物为dcfl primers ;内参基因为β-actin,引物为β-actinprimers (5，-GTCCCAGTTGGTCACGAT-3，和 5，-AGTTGCTGCTCTGGTTGT-3，)。5、如图3，由电泳图可知，构建的人源dcfl转基因果蝇是成功的，因为以转基因果蝇Fl代的cDNA为模版可以扩增出972bp的目的条带而对照组却没有。实施例一在AD模型果蝇神经细胞中表达dcfl能够缓解其运动能力下降症状
I、果蝇有天生的负趋地性，当果蝇被放入竖直放置的管中会本能地向上端爬行，而爬行的速度反应了果蝇的运动能力。实验利用不同基因、相同数量(10只)、相同羽化天数、相同性别(雄性)的果蝇用二氧化碳麻醉后分别移入相同的试管(长18cm，直径I. 5cm)中，25°C环境复苏30min后开始实验。2、装有果蝇的试管保持竖直状态，实验开始时温和地敲击试管，使果蝇集中到试管底部后开始计时，IOs后计时结束时快速计数在试管顶端和底端的果蝇数量并做好记录，一次测试后让果蝇恢复60s后再继续下一次测试，每次实验完成5-10次测试；实验每5天重复一次，从刚羽化到羽化第60天为止，各组实验要进行三次生物学重复。3、实验的四组果蝇分别为AD模型果蝇、共表达dcfl的AD模型果蝇、表达dcfl的果蝇、野生型果蝇(这些UAS系果蝇和elav-GAL4杂交产生Fl代以表达各外源基因，野生型与elav-GAL4杂交作为对照)。每次实验中5_10次技术重复取平均值作为一次实验结果，完成三次生物学重复，利用Student’s Test统计分析实验数据。实验结果表明，从第10天开始，共表达dcfl的AD模型果蝇相比于AD模型果蝇，同时期的爬壁能力均有了显著的提高(*p〈0.05，# p〈0. 01)，即运动能力下降的症状有了显著的缓解。AD模型果蝇相比于作为对照的表达外源dcfl的果蝇和野生型对照果蝇，同时期的爬壁能力远远要差，说明运动能力大幅度下降；而同时共表达dcfl的AD模型果蝇相比于作为对照的表达外源dcfl果蝇和野生型对照果蝇，同时期的爬壁能力仍然要差但强于AD模型果蝇，即运动能力下降的症状虽然得到缓解却不能完全治愈，以到达正常的水平。如图4所示。实施例二 在AD模型果蝇神经细胞中表达人源dcfl能够缓解其学习记忆能力下降症状
I、果蝇可以通过其复杂敏锐的嗅觉系统区识别和确认食物的位置，经过多次训练，果蝇最终可以远离无法接近的食物，而趋向可以接近的食物。通过果蝇寻找食物时间和数量的变化可以判断出果蝇学习记忆能力的变化。实验中利用香蕉这种水果作为吸引果蝇的食物。2、实验用的50ml离心管，在靠近离心管底部的下半段钻十个可以容纳果蝇自由出入的孔洞。取带有孔洞的离心管2只置于IOOOml烧杯中，其中一只离心管底放有约5g香蕉，果蝇可以闻到香蕉的气味而找到香蕉且可以吃到香蕉，这个离心管命名为可食管；另一个离心管底也放有约5g香蕉，同时香蕉用纱布包住，果蝇可以闻到香蕉的气味而找到香蕉却吃不到香蕉，这个离心管命名为不可食管。3、在25°C环境下，使100只羽化后10天的果蝇饥饿2h，用二氧化碳麻醉后放入烧杯中盖上纱布以封住烧杯口，然后让果蝇恢复30min，快速将一个可食管和一个非可食管放入烧杯后封号烧杯口，开始计时；每隔Ih记录果蝇进入可食管和不可食管的数量，每个基因型进行三次生物学重复，利用Student’ s Test统计分析实验数据。参见图5，实验的四组果蝇分别为AD模型果蝇、共表达dcfl的AD模型果蝇、表达dcfl的果蝇、野生型果蝇(这些UAS系果蝇和elav-GAL4杂交产生Fl代以表达各外源基因，野生型与elav_GAL4杂交作为对照)。4、图5A显示在可食管中，四组实验果蝇进入可食管的数量均随着时间的增长呈逐渐上升的趋势，说明随着时间的推移和学习训练次数的增加大部分果蝇能够逐渐找到可以食用的食物而最终进入可食管，只是速度有所差异。共表达dcfl的AD模型果蝇相比于AD模型果蝇，同时期进入可食管的数量有了显著的增加(*p〈0. 05，** p〈0. 01)，即学习记忆能力下降的症状有了显著的缓解。AD模型果蝇相比于作为对照的表达外源dcfl的果蝇和野生型对照果蝇，同时期进入可食管的数量远远要少，说明学习记忆能力大幅度下降；而共表达dcfl的AD模型果蝇相比于作为对照的表达外源dcfl的果蝇和野生型对照果蝇，同时期进入可食管的数量仍然要少但多于AD模型果蝇，即学习记忆能力下降的症状虽然得到缓解却不能完全治愈，以到达正常的水平。5、图5B显示，相比于作为对照的表达外源dcfl的果蝇和野生型对照果蝇，共表达dcfl的AD模型果蝇和AD模型果蝇进入在不可食管中数量总体要多，并且随着时间的增长有逐渐上升的趋势。但是作为对照的表达外源dcfl的果蝇和野生型对照果蝇随着时间的增加，离开不可食管的速度快于共表达dcfl的AD模型果蝇和AD模型果蝇。实施例三DCF1小鼠的鉴定
I、实验室先期已扩种大 量的DCFl基因敲除小鼠，我们利用PCR的技术用两对引物将WT小鼠与基因敲除小鼠区分。如图6所示。实施例四2D — DIGE以及质谱分析结果
I、裂解与普通双向电泳相同，先对样品进行裂解，唯一不同的是要用DIGE裂解液对样品进行裂解。将样品在裂解液中进行匀浆或研磨。2、离心裂解完毕后，4°C下，HOOOrpm离心lh，取上清。3、定量使用Bio-Rad protein assay reagent对样品进行定量。取部分样品进行稀释，稀释到5-10mg/ml，稀释完毕还需定量一次。4>Internal Standard :每个样品各取50ug,体积5-lOul,加到同一个EP管里，振荡混匀，离心。5、取 50ug 样品，加入突光染料(working solution) lul, Cy2 标记 internalstandard, Cy3与Cy5标记样品。混勻，于冰上暗处标记30min。加入lul IOmM lysine终止反应。标记完成。6、将分别用Cy2，Cy3, Cy5标记的样品加到同一 EP管中，振荡混匀，点动离心。样品制备完毕，上样进行IEF与SDS-PAGE。结果如图7所示
7、Typhoon扫描仪进行扫描并通过质谱分析仪进行质谱分析。实施例五western检验MBP, GFAP的蛋白量
对于质谱分析的结果进行数据库(uniprot，N C B I )的搜索，发现其中3个蛋白与阿尔兹海默症相关，分别是MBP，GFAP和DRP2 (见下表)。我们对其中的MBP和GFAP进行了western定量分析,其结果与质谱结果一致。见图8。
Table I- Identification of 3 proteins differentially caressed between
WT and Knockout mice_
ProteinMaster Swiss-prot MW PI P-value
identified_^_accession no._
my elm basic 1391 P043701.39 11.33 0.00035
protem
Gfap655 P039954,83 5.09 0.0030
Drp2353 Q05AA6 O 95 0:0054~
If_；；II_I实施例六对于野生型和基因敲出小鼠进行动物行为学研究
I、如图9所示，对小鼠进行了学习记忆的测试。该实验是研究鼠类空间学习记忆功能的重要实验通过连续多日训练鼠类以水池壁的标记物进行定位导航游泳寻找水中隐藏平台的方法检测小鼠的空间学习能力；接着撤除平台，分析小鼠在水迷宫里搜索原隐藏平台的行为来检测小鼠的空间记忆功能。图9中的结果向我们展示野生型小鼠的学习能力强于敲除小鼠，可以推测DCFl的敲除确实给小鼠的学习记忆能力带来一定的损伤。2、如图10所示，对小鼠进行了认场实验的测试。该实验研究鼠类运动能力及探究新事物能力的重要实验。让其在一个四周封闭的箱内进行探索，老鼠天性喜欢在角落活动。观察其进入中央区域的时间和次数，以及运动的距离可以测出小鼠对于新事物的好奇程度以及其运动能力的强弱。图10中的结果向我们展示，无论从运动距离或者是探寻新事物的能力来说野生型的小鼠都优于敲除小鼠，推测DCFl的敲除导致了小鼠运动能力和探寻新鲜事物能力降低。·


本发明涉及一种dcf1基因的新用途。该基因能有效缓解运动能力和学习记忆能力下降的状况。本发明通过分析ClimbingAssay(爬壁实验)和LearningandMemoryAbilityAssay(学习记忆能力实验)的结果可以证实，表达人源dcf1基因后AD模型果蝇的运动能力和学习记忆能力下降的症状有了显著的缓解。这种利用在神经细胞内表达基因产物来治疗AD的方法，有别于传统的外部给药，为AD的治疗开辟了一条新的思路。